ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Радионуклиды широко применяют как в медицинской диагностике, так и для терапии, в основном онкологических заболеваний, причем очень незначительное число радионуклидов применяется в простой химической форме. Масштабы использования радионуклидов в диагностике и лечении социально-значимых заболеваний демонстрируют цифры – так, в США в год проводят около 20 миллионов медицинских (в основном диагностических) процедур с использованием радионуклидов. К сожалению, Российская Федерация значительно отстает от развитых стран по использованию методов ядерной медицины. Так, к 2008 году в России полноценно функционировало единственное отделение радионуклидной терапии в Медицинском радиологическом научном центре РАМН (Обнинск), которое удовлетворяет потребность населения страны в данном виде радиологического лечения менее чем на 3%. Согласно материалам Общественной Палаты России - основной и главный вывод по состоянию радионуклидной терапии в России – этот вид лечения практически недоступен больным и значительно отстает от потребностей в нем. Этот вывод является следствием в том числе и того, что очень ограничено число терапевтических радиофармпрепаратов и методов радионуклидной диагностики. Поэтому разработка молекулярно-биологических основ новых диагностических радиофармпрепаратов (РФП) является актуальной комплексной междисциплинарной задачей современной биологии, химии, физики и медицины. Одной из основных проблем современной радиофармацевтики является недостаточная эффективность используемых в практике диагностических и терапевтических средств. Ключевой проблемой использования РФП для целей ПЭТ является либо короткий период полураспада радионуклидов, либо сложность их химического введения в препарат. Проблема короткого периода полураспада традиционных радионуклидов для ПЭТ может быть решена, применяя новые, более долгоживущие изотопы, в частности, 64Cu. Для этого необходима разработка легко модифицируемых лигандных систем, обладающих высоким сродством к иону металла и широкими возможностями для модификации и конъюгирования с биологическими векторами. Для решения второй проблемы можно предложить новые, высокопроизводительные и быстрые, методы введения интересующего атома в структуру целевого органического соединения. В настоящее время большая часть ПЭТ исследований проводится с использованием 18F-фтордизоксиглюкозы (ФДГ), однако расширение списка возможных фторированных биомолекул может существенно расширить круг решаемых задач, в том числе в области изучения когнитивных процессов и влияния радиационного воздействия на нервно-психологическое состояние человека. Для этой цели будут впервые получены 18F меченые катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин) – важнейшие типы нейромедиаторов и гормонов, которые играют незаменимую роль в процессах жизнедеятельности (сердцебиение, регулирование артериального давления, стрессовые состояния) и обеспечении когнитивной деятельности человека и животных. Эти соединения образуются в процессе метаболизма тирозина через образование L-DOPA (ферментативное окисление, декарбоксилирование и метилирования). Несколько важных заболеваний нервной системы связаны с дисфункцией дофаминовой системы (болезнь Паркинсона, шизофрения, синдром дефицита внимания, обцессивно-компульсивное расстройство и другие). Целью данного проекта является создание новых радиофармпрепаратов на основе фторсодержащих (18F) катехоламинов и хелатных комплексов меди (64Cu) для изучения когнитивных процессов и влияния радиационного воздействия на нервно-психологическое состояние человека. Задачи проекта: - синтез и исследование новых, хелатирующих 64Cu, соединений на основе биспидина и пиразола с целью разработки новых РФП для молекулярной визуализации; - разработка новых методов введения атомов 18F в биологически значимые молекулы (в первую очередь катехоламины) для целей молекулярной визуализации и для изучения когнитивных процессов и влияния радиационного воздействия на нервно-психологическое состояние человека; - разработка новых радиофармпрепаратов для тераностики (ПЭТ + терапия Оже-электронами и бета-частицами) на основе модулярных лигандных систем, обладающих высоким сродством к иону металла и широкими возможностями для модификации и конъюгирования с биологическими векторами. Научная новизна задачи получения комплексов меди с полидентатными лигандами заключается в выборе уникальной хелатирующей системы на основе 3,7- диазабицикло[3.3.1]нонана (биспидина). Данный вид лигандов обладает доказанным высоким сродством к катиону меди(II), что позволяет синтезировать целевые комплексы с высоким выходом за короткое время. Модификация биспидинов открывает возможность 3D (3-мерного) конструирования лигандов, имеющие нужные характеристики связывания металла, конъюгирование с интересующими биологическими молекулами/объектами, гидрофильно- гидрофобный баланс и их биодоступность. В рамках данного проекта предполагается впервые разработать эффективные короткостадийные методы получения фторированных аналогов L-DOPA, дофамина, норадреналина и адреналина. Новизна данного подхода состоит в использовании нуклеофильных методов введения фтора в целевые соединения.
The radionuclides, which are widely used both in the medical diagnostics and in the therapy of oncological diseases, are mainly applied in the complex chemical forms. The scale of radionuclide applications in the diagnostics and treatment of socially significant diseases is demistrated by the fact that in the United States nearly 20 millions of different operations, mainly of diagnostical character, are held. Unfrotunately, Russian Federation is not a leader in the field of using the nuclear medicine. For example, in 2008 the only functioning department of radionuclide therapy was one at the Medicinal Scientific Center for Radiology (Obninsk); the facility covers no more than 3 % of the required amount. According to the data of Accounting Chamber of RF, the radiotreatment is practically unassessible for the most of patients. This is the consequence of the limited number of diagnostical radiopharmaceuticals and methods of radionuclide diagnostics. Therefore, the development of molecular-biological bases of novel diagnostical radiopharmaceuticals (RP) is the comprehensive complex interdisciplinary problem of current biology, chemistry, phisics and medicine. One of the main questions of the current radiopharma is the low efficiency of the diagnostical and therapeutical resources used in practice. The key problem of using of RP for the positron-emission tomography (PET) is either the short radionuclide decay time or the complexity of its incorporation into the molecule. The problem of short decay time can be solved by use of new radiopharmaceuticals containing long-lived isotopes, particularly, 64Cu. To do this, the elaboration of easily modified ligand systems with high affinity to the metal cation and with wide possibilitied of chemical modifications including the conjugation to the biological vectors is proposed. To solve the second problem, the novel, highly efficient methods of fast incorporation of a particular atom into the target organic molecule should be suggested. Currently, the most of PET studies are made with use of 18F-fluorodesoxyglucose, but the extension of the list of the possible fluorinated biomolecules could significantly widen the scope of medical tasks, including those in the field of study of congnitive processes and of the effect of radiation on neuro-psycological human behavior. To solve this problem, 18F-contaning catecholamines (adrenaline, noradrenaline, dophamine) will be synthesized. Such biomolecules belong to the class of important neuromediators and hormones that play irreplaceable role in living processes such as heart beat, blood pressure regulation, stresses as well as in cognitive behavior of animals and humans. These compounds are formed as a result of tyrosine metabolism leading to L-DOPA via enzymatic oxidation, and subsequent decarboxylation and methylation. Some very important cognitive diseases, like Parkinson disease, shisophrenia, attention deficit disorder, are linked to the disfunction of dophamine system. The Aim of this Project is to create new radiofarmachemicals based on fluorine containing (18F) catecholamines and copper chelates (64Cu) for the study of congnitive processes and of the effect of radiation on neuro-psycological human behavior. The Tasks of this Porject are: - Synthesis and study of new 64Cu chelates on the base of bispidines and pyrazoles as novel radiopharmaceuticals for molecular imaging; - Elaboration of new methods of incorporation of 18F atoms in biologically relevant molecules (firstly - catecholamines) for the molecular imaging and study of congnitive processes and of the effect of radiation on neuro-psycological human behavior; - Elaboration of novel radioprarmaceuticals for teranostics (PET + Auger electrons and beta-particles therapy) on the base of modular ligand systems possessing high metal affinity and wide possibility for modification and conjugation with biological vectors. The scientific novelty of the synthesis of copper complexes is in the choice of a unique chelating ligand system, i.e. 3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonane (bispidine). These ligands possess the proved high affinity to the Cu(II) cation, and this allows to synthesize the target complexes in the short period of time. The modification of bispidines opens the way to 3D design of ligands with required chracteristics of metal binding, possibility of conjugation with relevant biomolecules and objects, desired hydrophilic-hydrophobic balance and bioavailability. In the frames of the Project is proposed to elaborate for the first time the effective short synthetic methods to make fluoro-containing analougues of L-DOPA, adrenaline, noradrenaline and dophamine. The novelty of this approach is in the application of nucleophilic reactions for the introduction of fluorine atom into the organic molecules.
В рамках проекта будут получены новые или усовершенствованы методы синтеза известных РФП для ПЭТ, как на основе 18F, так и нестандартных радионуклидов (конкретно, 64Cu). Будет расширен список возможных фторированных биомолекул и соответственно круг решаемых задач, в том числе в области изучения когнитивных процессов и влияния радиационного воздействия на нервно-психологическое состояние человека. Для этой цели будут впервые получены 18F меченые катехоламины (адреналин, норадреналин, дофамин) – важнейшие типы нейромедиаторов и гормонов, которые играют ключевую роль в процессах жизнедеятельности и обеспечении когнитивной деятельности человека и животных. Важнейшей задачей является синтез и исследование новых РФП для ПЭТ на основе более долгоживущих изотопов, в частности, 64Cu. Для этого будут получены новые лигандные системы, обладающие высоким сродством к иону металла и широкими возможностями для модификации и коньюгирования с биологическими векторами. Таким образом, в результате выполнения проекта будет решена конкретная проблема современной радиофармацевтики – синтез новых РФП на основе 18F- и 64Cu-содержащих молекул.
Коллектив исполнителей данного проекта имеет значительный научный опыт по предлагаемой программе, им опубликовано более 58 статей и 2 монографии в российских и зарубежных журналах. В коллективе заявителей накоплен огромный опыт работы по синтезу лигандов биспидинового типа и комплексов на их основе. Научная группа проф. Вацадзе является одним из мировых лидеров в области химии биспидинов. Опубликовано 22 статьи в реферируемых журналах. Разработаны методы синтеза биспидинов, содержащих в заместителях при атомах азота карбоксильные, нитрильные, гидроксильные, эфирные группы. Создан уникальный метод получения несимметричных биспидинолов. Исследованы строение и электрохимия широкого набора комплексов меди(II) с нейтральными и отрицательно заряженными биспидиновыми лигандами. Показано, что молекулы с каркасом биспидина могут быть эффективными предшественниками антагонистов тромбина. В результате были разработаны меоды синтеза различных функционально замещённые фторсодержащие алкены, которые были В области радиофармацевтической химии, коллективом заявителей проведены исследования в следующих областях: - разработка методов получения радионуклидов медицинского назначения, - синтез и исследование органических рецепторов для связывания радионуклидов, - получение и исследование модульных нанотранспортеров для целевой доставки противоопухолевых агентов в ядра клеток. В 2012-2013 гг. коллективом исполнителей выполнялся проект по заказу ГК "Росатом" по разработке научных основ технологии получения актиния-225 из облученных протонами ториевых мишеней. В результате был разработан новый способ получения актиния-225 и других радионуклидов медицинского назначения. Эти работы отражены в публикациях коллектива (более 8 публикаций за последние 5 лет) в ведущих журналах, а также полученных патентах (Патент на изобретение RU2373589 и заявка на международный патент PCT/RU2009/000462).
Исследования, проводимые на стыке ядерной медицины и физики, радиохимии и радиобиологии, клеточной и молекулярной биологии, биохимии, нейроиммунологии, когнитивной психологии и нейронаук, химии высокомолекулярных соединений, физической и аналитической химии, а также применение для решения поставленных задач широкого ассортимента современных исследовательских и технологических методов, привлечение специалистов-исследователей самой высокой квалификации будут гарантировать выполнение предлагаемого исследования на самом высоком уровне, способствовать повышению квалификации молодых ученых и студентов, участвующих в предлагаемом проекте, и развитию Российской науки в целом. Научная новизна поставленной задачи определяется тем, что в настоящее время остаются не изученными многие клеточные, молекулярные, нейроиммунные и генетические механизмы патогенеза постлучевых когнитивных нарушений, которые являются важнейшим фактором, определяющим не только качество жизни, но и выживаемость больных, прежде всего, после облучения мозга, области головы и шеи и ряда других локализации. В настоящее время в мире нет зарегистрированных препаратов для ПЭТ на основе L-DOPA, содержащих 18F, несмотря на то, что доказана возможность их клинического использования. Впервые планируется разработать и применить метод нуклеофильного введения атома фтора, что должно привести к сокращению времени всего процесса получения радиофармпрепатара. Данный препарат может применяться как в исследованиях нейрологии и психиатрии, так и онкологии. Таким образом, в результате реализации проекта будут получены новые соединения на основе биспидина и пиразола для хелатирования 64Cu; определены константы устойчивости новых соединений на основе биспидина и пиразола с 64Cu; определена цитотоксичность и противоопухолевая активность на клеточных культурах с новыми соединениями на основе биспидина и пиразола с 64Cu; разработаны экспресс-методы введения 18F в катехоламины; усовершенствованы экспресс-методы введения 18F в катехоламины с контролем качества меченых молекул; определён метаболизм и распределение катехоламинов и комплексов меди при радиационном воздействии на живые организмы на примере лабораторных животных; Ожидаемые результаты позволят повысить качество жизни больных прежде всего за счет разработки новых РФП для ранней диагностики заболеваний и их эффективной терапии, а также после облучения мозга, области головы и шеи и ряда опухолей других локализаций. Все указанные результаты исследований будут новыми, патентноспособными, будут превышать или соответствовать мировому уровню и будут апробированы на реальных пациентах в ведущих радиохимических и медицинских научно-исследовательских центрах России: НИЦ Курчатовский институт, кафедре радиохимии химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, РОНЦ имени Н.Н. Блохина, МНИОИ имени П.А. Герцена и на факультете фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Создание новых радиофармпрепаратов на основе фторсодержащих (18F) катехоламинов и хелатных комплексов меди (64Cu) для изучения когнитивных процессов и влияния радиационного воздействия на нервно-психологическое состояние человека |
Результаты этапа: В ходе работы за 2016 год достигнуты следующие результаты: синтезировано 6 новых комплексов меди(II) – четыре с тетрадентатными биспидиндикарбоновыми кислотами и два с несимметричными бензилбиспидинолами; исследована растворимость, электрохимическая и термодинамическая устойчивость новых комплексов; синтезировано 5 новых фторсодержащих октагидро-2,7-метанофуро[3,2-c]пиридинов; синтезирована 1 новая бис(трифторметил)содержащая карбоновая кислота и 3 новых бис(трифторметил)содержащих аминокетона; найдены особенности электронного строения фторсодержащих соединений – способность выступать в качестве стереоэлектронных хамелеонов, которые являются важным шагом на пути понимания роли атома фтора как во внутри-, так и в межмолекулярных взаимодействиях. Опубликовано 4 статьи и тезисы 8 докладов на всероссийских и международных научных конференциях. Таким образом, можно заключить, что все формальные показатели результативности выполнения проекта в 2016 году достигнуты. | ||
2 | 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Создание новых радиофармпрепаратов на основе фторсодержащих (18F) катехоламинов и хелатных комплексов меди (64Cu) для изучения когнитивных процессов и влияния радиационного воздействия на нервно-психологическое состояние человека |
Результаты этапа: Впервые синтезированы 4 бис-триазольных производных биспидина; структура и строение одного нового лиганда доказано методом РСА. Синтезированы 3 новых бискарбоксилатных производных биспидина. Изучены методами спектрофотометрии и хроматографии 4 медных комплекса биспидинов, содержащих карбоксилатные и триазольные лигандирующие группы в дополнительных заместителях у атомов азота. Показано, что для карбоксилатных комплексов 64Cu характерна устойчивость к гидролизу в воде, изотоническом растворе и сыворотке, а комплексы обычной меди с новыми бис-триазольными лигандами характеризуются ожидаемой стехиометрией 1:1. Синтезированы 4 новых бис-пиразольных производных биспидина. Получен 1 новый несимметричный пиразолсодержащий биспидинол. Получены 3 новых лиганда на основе пиперазина; исследована модельная реакция замыкания цикла на комплексах никеля. Разработаны пути синтеза к 3 орто-хиноидным субстратам. Были исследованы возможности получения 4 фторсодержащих замещенных пирокатехина и дофамина, включая модельную реакцию замещения нитрогруппы. Проведены исследования по сравнительному изучению свойств фторзамещенных катехоламинов с их природными незамещенными аналогами, а именно квантовохимические расчеты электронного строения фторсодержащих целевых соединений, поиск и проведение докинга в активные сайты редокс-ферментов, в целях реализации взаимодействия белок-субстрат по типу “ключ-замок”. Выяснено, что использованные методы не показывают преимуществ или недостатков фторированных дофаминов по сравнению с незамещенным аналогом. Проведен расчет кинетических параметров реакций по кинетической схеме Михаэлиса-Ментен с участием катехоламинов в целях выявления замещенных соединений, которые наиболее близки по свойствам к нативным маркерам когнитивных нарушений, в целях предсказания поведения фторзамещенных аналогов этих соединений, а именно стабильности последних при их введении в организм. Из полученных экспериментальных данных следует что пероксидазный катализ (окисление пероксидом водорода) в целом эффективнее тирозиназного (окисление растворенным кислородом), так как константа k3 пероксидазного окисления АД в условиях его дериватизации с ДЭД 3 раза больше константы k3, соответствующей его тирозиназному окислению, в то время как эффективность пероксидазного окисления ДА выше тирозиназного в 2 раза. Разработаны подходы к обнаружению и определению катехоламинов и их нативных аналогов, а также метаболитов последних, для изучения распределения и накопления концентрации замещенных соединений в биологических жидкостях, тканях при минимальной пробоподготовки образцов в целях минимизации ошибки определения и сокращения времени анализа, что чрезвычайно важно при работе с объектами с подвижной, изменяющейся матрицей и составом. В результате проведенных исследований было показано, что наиболее перспективным является подход основанный на ферментативной дериватизации катехоламинов и их метаболитов ароматическими аминами в присутствии пероксидазы из корней хрена с целью получения интенсивно флуоресцирующих производных, поскольку именно эта реакция обеспечила сочетание высокой чувствительности, селективности с возможностью мультиплексного определения катехоламинов в биологических объектах. Предложенная система позволяет проводить анализ одновременно до 20 проб биологических объектов за 15-30 мин. Опубликовано 2 статьи в журналах Макрогетероциклы и Acta Crystallographica E. Одна статья принята к печати в журнале Успехи химии – это написанный впервые на русском языке обзор о применении [18F]фторкатехоламинов в диагностике нейродегенеративных заболеваний. В патогенезе многих социально значимых заболеваний – нейродегенеративных деменций и нейроэндокринных опухолей, лежит процесс нарушения нейромедиаторного обмена. Из всех существующих нейровизуализационных методов диагностики перечисленных заболеваний наиболее совершенным и информативным является позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). Применимость ПЭТ в значительной степени определяется арсеналом доступных меченых соединений – радиофармпрепаратов (РФП), предварительно вводимых в организм человека. В обзоре (197 ссылок) собраны и систематизированы сведения о современном состоянии по применению РФП группы катехоламинов, позволяющих объективно оценивать состояние симпатической и центральной нервных систем, в клинической практике, методах их синтеза и существующих проблемах. Также в обзоре суммированы известные методы введения 18F в ароматические кольца катехоламинов, включая фторирование фенолов. Сделано 6 докладов (из них 2 пленарных и 2 приглашенных) на 5 конференциях | ||
3 | 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Создание новых радиофармпрепаратов на основе фторсодержащих (18F) катехоламинов и хелатных комплексов меди (64Cu) для изучения когнитивных процессов и влияния радиационного воздействия на нервно-психологическое состояние человека |
Результаты этапа: Задача 1. Синтез новых биспидиновых и родственных лигандов Биспидины, содержащие триазолы. Как было показано в прошлогоднем отчете, для увеличения числа хелатирующих групп биспидина к атомам азом каркаса разумно прикрепить лиганды, которые будут содержать как координирующий атом (азот, кислород, сера), так и линкер, через который можно прикреплять полученный лиганд к биомолекуле для селективного транспорта в организме. Таким удобным лигандом является модифицированный триазол, к главному достоинству которого можно отнести легкость его получения из соответствующих азидов и алкинов. Классическими группами для присоединения лигандов к пептидам являются карбоксильная и аминная. Поэтому мы перешли к получению ряда азидов и триазолов, содержащих соответствующие группы. Кроме того, были получены азиды с двумя защитными группами – трет-бутильной (или Boc) и бензильной. Наличие защитных групп крайне необходимо, так как защищенные промежуточные триазолы не должны растворяться в воде, чтобы их можно было выделить из реакционной смеси после циклоприсоединения. Защитные группы, в свою очередь, должны удаляться в условиях, которые исключают наличие воды на любой стадии их выделения. Такими свойствами обладают трет-бутильные производные, которые разрушаются трифторуксусной кислотой (TFA) и бензильные, которые снимаются водородом на палладии в безводном метаноле.Нами была получена пара триазолов, содержащих карбоксильную группу в качестве линкера. Оба триазола оказались хорошо растворимыми в воде. Как показал эксперимент, снятие трет-бутильной защиты в TFA приводит к образованию соли биспидина с двуми молекулами TFA. При этом эта соль намного гигроскопичнее, чем соответствующая кислота, и имеет тенденцию постепенной потере TFA с образованием липкой пенистой массы.Аналогичная реакция гидроксипроизводным биспидина, хотя и протекает, приводит к образованию водорастворимого триазола, даже несмотря на наличие двух гидрофобных бензильных групп, что сделало невозможным выделение продукта из реакционной смеси. Аналогичным образом были получены триазолы, содержащие аминогруппу. Как и в случае с карбоксилом, при снятии Boc образуется соль уже не с двумя, а с четырьмя молекулами TFA. При этом наличие такого количества кислоты сильно ухудшило качество спектра ЯМР, вплоть до его неразрешимости. Снятие бензильной защиты с амина водородом идет значительно медленнее, чем для сложного эфира. При этом длительное время реакции, согласно данным масс-спектрометрии, приводит к значительному восстановлению кето-группы биспидина до спиртовой. Помимо карбоксильной и аминовой группы нам удалось получить триазол, содержащий цепочку, терминированную атомом хлора, которая может выступать в качестве алкилирующего фрагмента для прикрепления лиганда. Кроме того, нами были получены гомологи дипропаргилбиспидинона с удлиненной на одну метиленовую группу цепочкой. Алкилирование тозилатом биспидина, в отличие от пропагильного производного, протекало с небольшим выходом. Использование в качестве алкилирующего агента 4-бром-бут-1-ина не привело к увеличению выхода целевого вещества. Аналогично описанным ранее, была проведена цепочка превращений для получения гомологичного триазола с карбоксильной группой, которое тоже представляло собой соль. А вот реакция бензил азидоацетатом привела к очень низкому выходу целевого соединения. В целях получения региоизомеров триазола мы синтезировали биспидин с азидогрупами из соответствующих замещенных этилазидов. Алкилирование, как и в случае с гомологом пропаргила, протекало с достаточно низкими выходами. В случае мезилата и тозилата в реакционной смеси обнаруживался еще один неустановленный продукт. В итоге, лучший выход был получен с 2-хлороэтилазидом. Полученный азид вводили в реакцию циклоприсоединения с соответствующим алкином. Реакция протекала с хорошим выходом. Кроме того, была изучена возможность получения несимметричных триазолов. Для этого нами был использован ранее полученный бензилбиспидинол, алкилированный пропаргилом по второму атому азота. Пропаргильное производное вводили в реакцию циклоприсоединения с бензил азидом. Низкий выход, вероятнее всего, связан с заметной растворимостью триазола в воде. Снятие же бензильной защиты гидрогенолизом протекает количественно. Далее, мы получили биспидин, содержащий вместо триазольной тетразольную группу. Он был синтезирован путем алкилирования биспидина защищенным тетразолом. При этом, в отличие от триазола, бензильная группа с азота частично снимается при обычном давлении. Однако, довести конверсию удалось только 75%. Видимо, нужно проводить реакцию в автоклаве при повышенном давлении водорода. Также была проверена возможность макроциклизации полученных алкинов и азидов. В случае азида, содержащего амидную группу, реакция не шла вовсе, по-видимому, из-за копланарного расположения азидных групп. Реакция же с алифатическим азидом протекала, однако, приводила к смеси продуктов. Создание еще более большого цикла с гем-диазидами также не происходило. Далее, нами была сделана попытка увеличить дентантность лиганда путем увеличения количества связующих атомов. За образец был взят аналог ЭДТА, присоединенный к биспидину. Реакции алкилирования и восстановления протекали гладко и с хорошими выходами. Полученное соединение хорошо растворялось в воде. Модифицирование боковой цепи. Для связывания биспидина также возможно модифицировать боковую цепь, не участвующую в связывании с атомом металла. Так, в 2017 году мы ввели в боковую цепь фрагмент аминометила, защищенный фталимидом. Однако, снятие защит привело к смеси продуктов, основным из которых, по-видимому, является гидразид кислоты. Возможно, снятие защит нужно делать в обратной последовательности и вместо этильной группы использовать трет-бутильную или бензильную. Также в боковую цепь мы попытались ввести диметоксибензильный фрагмент, получив тем самым аналог DOPA, который еще может связывать металл. В этом же случае, реакция алкилирования была очень медленной. Возможно, нужно сменить заместитель с хлора на бром или йод.Попытка введения изонитрилов. Новым направлением, получившим первые толчки к развитию в 2018 году, стала модификация биспидинового каркаса с помощью введения и дальнейшей функционализации изонитрильной группы. Действительно, наша работа по анализу механизма радикального 1,1-присоединения к изонитрильной группе вкупе с обширными литературными данными позволяют заявить, что при наличии в структуре органического соединения изонитрильной группы возможны широчайшие химические модификации, включая синтезы разнообразных классов гетероциклических соединений, что имеет непосредственное отношение к данному проекту. Наиболее простым методом является получение изонитрила из первичного амина, в нашем случае в качестве модели использовали 9-аминодиазаадамантан. Первый способ не привел к желаемому результату, присутствовал исходный кетон. В втором случае двухфазной системы выход изонитрила составил 15%. Тем не менее, мы считаем данное направление весьма перспективным и заслуживающим в будущих проектах особого внимания.Модификация положения 9 биспидина другими реагентами. Одним из перспективнейших мест для связывания биспидина является девятое положение каркаса, которое после реакции Манниха, применяемой для синтеза исходного диазаадамантанона, занято кето-группой. Ее модифицирование описано многими исследователями, правда, которые работали с незамещенным по положениям 1 и 5 биспидинами. Мы также попробовали провести описанные реакции, но с 5,7-диметилдиаазаадамантаноном. К сожалению, ни реакция Лейкарта, ни Хорнера, ни Анри с данным субстратом не идет. При этом, хорошо идет реакция восстановления боргидридом натрия до спирта. Спирт мы также попытались модифицировать. Ни в одной из этих реакций кислород не затрагивается. В реакционной смеси остается либо исходной спирт, либо он реагирует по атому азота с раскрытием моста адамантанола. Как было показано нами в 2017 году, единственной хорошей реакцией конденсации, которая протекает с кето-группой, является оксимирование. Оно, в свою очередь, дает возможность получить аминогруппу в девятом положении. В литературе описано получение амина восстановлением водородом на никеле Ренея. Однако, реакция показала себя довольно капризной, крайне чувствительной к температуре, превышение которой приводило к образованию диазаадамантанола. Поэтому мы использовали классическое восстановление алюмогидридом лития в ТГФ. Далее, мы разработали цепочку получения хелатирующих биспидинов со свободной аминогруппой в положении 9. Для этого необходимо было сначала защитить ее дибензильной защитой. Однако, мы обнаружили, что вместо дибензильной образуется монобензильная защита, то есть первичный амин из-за пространственных затруднений позволяет ввести только одну защитную группу. Это также подтверждается тем, что реакция ацилирования в избытке ацетил хлорида идет только по мостовым атомам азота, не затрагивая атом азота в девятом положении. Последующее алкилирование и снятие защиты привели нас к целевому соединению, которое имеет как свободную группу для связывания с биомолекулой, так и защищенные хелатирующие группы. Для удлинения цепи на два атома мы использовали 1,2-присоединение к кето-группе ацетонитрил лития. Обнаруженная нами возможность проводить присоединение алкил-литиевых соединений поможет в будущем прикреплять биспидин к любым векторам для селективного транспорта в организме. Стратегия синтеза биспидин-тетраонов. На схеме ниже приведены синтетические пути к целевым/модельным бис-триазолилбиспидин-тетраонам. Согласно составленному в конце 2017 года плану, были получены биспропаргильные производные 9,9-диалкил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-2,4,6,8-тетраонов реакцией с пропаргилбромидом в ДМФА. В качестве основания использовали гидрид натрия, реакцию проводили при интенсивном нагревании (при кипячении с обратным холодильником) в инертной атмосфере. Время реакции варьировали от 3 до 6 часов. После очистки продукты реакции перекристаллизовывали и затем вводили в азид-алкиновое [3+2] циклоприсоединение с бензилазидом. Следует отметить, что такие реакции на системе биспидин-тетраонов были исследованы впервые. Реакции проводили в эмульсиях дихлорметан-вода или хлороформ-вода, где вода была добавлена с целью растворения катализатора – меди(I), реакционную смесь интенсивно перемешивали в течение суток при комнатной температуре. Источником меди(I) служил либо иодид меди(I), либо восстановленный аскорбатом натрия медный купорос. В первом случае аскорбат натрия также добавляли для предотвращения возможного окисления меди(I). Реакция также проводилась в инертной атмосфере. Продукт реакции очищался хроматографически на силикагеле в системе CHCl3 : EA 3:1. С целью уточнения структуры полученных соединений один из продуктов вышеупомянутого азид-алкинового циклоприсоединения также был получен альтернативным путем – алкилированием биспидин-тетраона триазолсодержащим алкилбромидом: После сравнения ЯМР спектров полученных соединений было доподлинно выяснено, что получаемые в ходе [3+2] циклоприсоединения триазолы отвечают представленной структуре. В качестве примера можно привести сопоставление спектров 9,9-диметильного производного; наиболее репрезентативной является область слабого поля, в которой мы можем увидеть наличие характерных триазольных протонов (7.41 и 7.43 м.д.), ароматических протонов бензильной группы (7.38-7.18 и 7.37-7.15 м.д.) , а также два разных вида метиленовых мостиков – один в бензильной группе (5.49 и 5.44 м.д.), другой между триазолом и тетраоновым каркасом (5.00 и 4.96 м.д., пропаргильный мостик). Бис-амиды. В 2017 году были получены «пиразольные» бис-амиды на основе биспидина. Восстановление данных бис-амидов алюмогидридом лития приводит к смеси двух продуктов, структура которых подтверждена ЯМР-спектроскопией и масс-спектрометрией. На этот раз нам удалось установить структуру биспидин-содержащего продукта восстановления. Им, на удивление, оказался 2-гетарилзамещенный 1,3-диазадамантан-6-ол: В 2018 году проведено изучение серии несимметрично замещенных биспидинолов. Установлено, что синтез целевых амино-амидов 4 осложняется формированием органогелей при проведении стадии ацилирования. Задача 2. Получение и изучение комплексов меди(II) с новыми лигандами. В 2018 году были продолжены эксперименты по исследованию состава и устойчивости комплексов меди с полидентатными биспидинами, в том числе меди-64. Контроль выхода реакции мечения методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с последующей авторадиографией (рис. 1а) и измерением на гамма-спектрометре по линиям 511 и 1345 кэВ (соответствуюшие Cu-64). Согласно полученным результатам c(L)=5·10-4 М достаточно для получения меченного соединения с радиохимической чистотой ≥95% (рис. 1б). Рис. 1. Определение радиохимической чистоты (РХЧ) меченного соединения KAA87v в зависимости от концентрации лиганда: а) результаты авторадиографии на пластинах ТСХ; б) рассчитанное значение выхода реакции мечения по результатам гамма-спектрометрии. Исследование устойчивости меченого соединения в пристутствии сывороточных белков. Комплекс с с(L)=0,5 мМ (РХЧ 98%) проверяли на устойчивость в десятикратном избытке эмбриональной телячьей сыворотки. Для этого проводили осаждение протеиновой фракции с помощью этанола, центрифугирования и измерения маточного раствора на гамма-спектрометре. Для идентификации химической формы радионуклида в маточном растворе проводили анализ методом ТСХ. В течение всего времени анализа – 4 часа –не наблюдается более 14±7% перехелатирования катиона сывороточными белками (рис. 2а). При этом в не связанной с белками фракции радионуклид остаётся в форме исходного комплекса, что подтверждается сохранением Rf на ТСХ (рис. 2б). Для сравнения был проведён параллельный аналогичный эксперимент с введением Cu2+ без лиганда в среду сывороточных белков при той же концентрации стабильного катиона и рН. В таком случае происходит практически полное связывание катиона 90-95% сывороточными белками уже с первых минут взаимодействия (рис. 2а). Рис. 2. а) связывание Cu2+ сывороточными белками: в отсутствие лиганда “Cu2+ free” и из комплекса “LCu”; б) авторадиография ТСХ фракции, не связанной с белками. logK(LCu)=21,3. Контроль выхода реакции мечения методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) с последующей авторадиографией и измерением на гамма-спектрометре по линиям 511 и 1345 кэВ (соответствуюшие Cu-64). Согласно полученным результатам c(L)=1·10-4 М достаточно для получения меченного соединения с радиохимической чистотой ≥95% (рис. 3). Рис. 3. Определение радиохимической чистоты (РХЧ) меченного соединения KAA414 в зависимости от концентрации лиганда по результатам гамма-спектрометрии. Исследование устойчивости меченого соединения в пристутствии сывороточных белков. Комплекс с с(L)=0,1 мМ (РХЧ> 98%) проверяли на устойчивость в десятикратном избытке эмбриональной телячьей сыворотки. Для этого проводили осаждение протеиновой фракции с помощью этанола, центрифугирования и измерения маточного раствора на гамма-спектрометре. Для идентификации химической формы радионуклида в маточном растворе проводили анализ методом ТСХ. В течение всего времени анализа – 4 часа –не наблюдается более 18±7% перехелатирования катиона сывороточными белками (рис. 4). При этом в не связанной с белками фракции радионуклид остаётся в форме исходного комплекса, что подтверждается сохранением Rf на ТСХ (рис. 4б). Для сравнения был проведён параллельный аналогичный эксперимент с введением Cu2+ без лиганда в среду сывороточных белков при той же концентрации стабильного катиона и рН. В таком случае происходит практически полное связывание катиона 90-95% сывороточными белками уже с первых минут взаимодействия (рис. 4а). Рис. 4. а) связывание Cu2+ сывороточными белками: в отсутствие лиганда “Cu2+ free” и из комплекса “LCu”; б) авторадиография ТСХ фракции, не связанной с белками. Таким образом, можно заключить, что оба лиганда, несмотря на значительное отличие в константах комплексообразования, образуют достаточно устойчивые комплексы (диссоциации более 20% не наблюдается в течение, по крайней мере, 4 часов) в среде сывороточных белков. Задача 3. Исследование по получению фторзамещенных катехоламинов. Ранее в рамках развития катехоламиновой тематики нами были получены 2 производных 6-аминодофамина – N,O,O’-трис-трет-бутоксикарбонил-6-аминодофамин (трисбок-6-аминодофамин) и N,O,O’-тристриметилацетил-6-аминодофамин (триспивалоил-6-аминодофамин). В целях дальнейшего получения диазониевых солей было решено использовать органические нитриты, в частности трет-бутилнитрит, так как проведение реакции в более традиционных условиях (с нитритом натрия в воде) было нереализуемо из-за низкой водорастворимости наших субстратов. Наработка трет-бутилнитрита проводилась из трет-бутанола в воде при пониженной температуре. 13 г. трет-бутанола и 13.45 г. нитрита натрия растворили в 80 мл. воды и охладили до нуля, и после медленно прикапывали конц. соляную кислоту (16 мл.). После приливания реакционную смесь поперемешивали некоторое время, разбавили водой и отделили желтый органический слой на делительной воронке, затем промыв его содой и водой. После нитрит сушили над хлоридом кальция и взвешивали, получив ~10 г. Анализ ЯМР показал присутствие в полученном веществе трет-бутанола (~1 к 14), однако для дальнейшего синтеза он не мешал, так что нитрит был использован без дальнейшей очистки. Получение арендиазониевых солей происходило при добавлении избытка (более 5 эквивалентов) трет-бутилнитрита к раствору субстрата и пара-толуолсульфокислоты (также избыток, порядка 10 эквивалентов) в метаноле. В ходе реакции происходит изменение окраски раствора и спустя примерно час в раствор полученного арендиазоний тозилата добавляли либо раствор иодида калия (3 эквивалента в небольшом количестве воды), либо раствор азида натрия (2.5 эквивалента в небольшом количестве воды), получая соответственно 6-иодо- или 6-азидо- производные. Полученные вещества были охарактеризованы методом ЯМР, выходы варьировались от 60 до 80 процентов. Полученные 6-азидодофамины были впервые введены в модельную реакцию с фенилазидом. Показано, что при оптимизации условий процесса его можно сделать синтетически оправданным. Задача 4. Разработка подходов к обнаружению и определению фторзамещенных катехоламинов и их нативных аналогов - маркеров когнитивных нарушений в организме человека. Высокочувствительное и селективное определение катехоламинов в различных биологических образцах в целях диагностики нейроэндокринных опухолей и нейродегенеративных деменций остается актуальной проблемой современного химического анализа. Одним из наиболее перспективных, сравнительно новым и интенсивно развивающимся по всему миру, методом является спектроскопия поверхностно-усиленного, или гигантского, комбинационного рассеяния (ГКР). Явление резкого усиления интенсивности сигнала КР (в 104 – 1012 раз) основано на эффекте поверхностного плазмонного резонанса на наноструктурированной поверхности, как правило, благородных металлов. Нами разработано планарное сенсорное устройство, состоящее из наночастиц серебра размером 30 – 50 нм (рис. 5, а), нанесенных на тонкую стеклянную пластинку. Синтез серебряной поверхности осуществлялся пиролизом аэрозоля аммиачного комплекса серебра [Ag(NH3)2]OH (1.25 мМ). Серебро наносили на предварительно нагретую поверхность стеклянной пластинки (290 – 320 °С) в виде капель размером 1 – 5 мкм, которые затем испарялись, образуя «кофейные кольца». Наночастицы серебра образовывали агрегаты размером 185 ± 6 нм. Кроме того, для возможности предконцентрирования целевых аналитов – катехоламинов, поверхность серебра дополнительно модифицировалась оптически прозрачной пленкой полимера – хитозана толщиной 1.7 ± 0.1 мкм. Однако нанесение образца, содержащий дофамин, не приводило к проявлению характеристических сигналов высокой интенсивности на спектрах КР. Этот факт объясняется несовпадением максимумов поглощения катехоламинов (200 – 350 нм) и положения плазмонного резонанса получаемых устойчивых и стабильных наночастиц серебра (для большинства наночастиц серебра – ок. 420 нм). В связи с этим для «проявления» сигналов катехоламинов на сенсорной поверхности предложили использовать комплексы катехоламинов, которые способны интенсивно поглощать в видимой области спектра (450 – 800 нм). Известно, что катехоламины способны образовывать комплексы с ионами меди(II) (рис. 6). Последовательная модификация наночастиц серебра пленкой полимера, затем иммобилизация в нее ионов меди(II) и нанесение на полученную поверхность анализируемого образца, содержащий дофамин, приводило к регистрации спектров ГКР с интенсивными характеристическими полосами: Однако образование на поверхности различных по стехиометрии комплексов и возможность протекания процесса окисления с течением времени в присутствии ионов меди(II) не позволило линеаризовать получаемые сигналы даже в монологарифмических координатах (рис. 7). В связи с этим, мы предложили использовать смешаннолигандные комплексы катехоламинов с ионами меди(II) и дополнительным, «фиксирующим», лигандом, способным стабилизировать катехоламин, предотвращая окисление аналита на поверхности. Наиболее подходящими лигандами для этого выбраны соединения триазола: с катионными и анионными гидрофильными и гидрофобными группами (рис. 8). Образование комплекса 1а с ионами меди на поверхности происходило, что в дальнейшем для определения катехоламинов в соответствующих тройных комплексах послужит мешающим фоновым сигналом (рис. 9). Наиболее вероятно, этот факт связан с дополнительным взаимодействием –COOH групп 1а с –NH2 группами хитозана, нанесенным на наночастицы серебра.Образование комплекса 1б с ионами меди также было зафиксировано на ГКР-сенсорной поверхности (рис. 10). Связано это с собственными интенсивными характеристическими колебаниями фенильных групп 1б.При подборе концентрации индикаторной системы, представляющей собой ионы меди(II) и триазоловый лиганд, оптимальными оказались 1 мМ для 1б и 8 мМ для 1в (рис. 12) по большинству характеристических линий в спектрах ГКР (рис. 13).Показали, что проявившиеся на спектрах ГКР сигналы соответствуют комплексам состава дофамин:Cu(II):триазол (рис. 13).Важной особенностью полученных результатов измерений явилось то, что интенсивности характеристических сигналов линейно зависели от концентрации наносимого на сенсорное устройство дофамина (рис. 14 и 15). Задача 5. Обобщение результатов, подготовка запланированных статей и итогового отчета.Сделаны доклады на 9 конференциях, подготовлены в печати (1) и опубликованы (2) часть результатов 2018 года, сделан обобщающий отчет за 2016-2018 гг. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".