ИСТИНА

В настоящем проекте мы планируем исследование возможности модификации поражающего действия физических факторов с локальным повреждающим действием на ДНК заданного типа клеток. Доставка таких модифицирующих агентов в ядра целевых клеток может осуществляться ранее разработанными нами модульными нанотранспортерами (МНТ). МНТ за счет наличия специальных модулей обладают способностью связываться с интернализуемыми рецепторами клеток-мишеней, проникать внутрь клетки, затем выходить из эндосом в цитозо ль, где происходит их взаимодействие с импортинами, обеспечивающими транспорт в ядро через ядерную пору, попадают в ядра клеток. Мы планируем использовать С-концевые фрагменты белка-регулятора репарации р21Waf1 в качестве дополнительного функционального модуля, встроенного в МНТ. Мы надеемся, что создание таких МНТ позволит создать инструмент воздействия на репарацию ДНК в заданном типе клеток-мишеней.

We plan to investigate the possibility to modify the effect of physical factors with local damaging effect on the DNA of a given cell type. Delivery of such modifying agents into the nuclei of target cells may be realized using previously developed modular nanotransporters (MNT). MNT, due to the presence of special modules, are capable of binding to internalizable receptors of target cells, of penetration into the cells, and then, after escape from endosomes, are capable to interact with importins providing transportation into the nucleus through the nuclear pore to the nucleus of cells. We plan to use C-terminal fragments of the repair regulating p21Waf1 protein as an additional function module integrated in the MNT. We hope that development of such MNT will allow to create an instrument to modify DNA repair in a given target cell type.

2016 год. В первый год работы будет осуществлен подбор фрагментов белка р21Waf1, способных взаимодействовать с PCNA, для их последующего клонирования в генетические конструкции МНТ. Мы предполагаем подбор вариантов генетических конструкций МНТ для клонирования в них фрагментов белка р21Waf1, основываясь на нескольких вариантах лигандных модулей: модуль – эпидермальный фактор роста (EGF), лиганд к рецепторам эпидермального фактора роста; модуль – меланоцит- стимулирующий гормон (MSH), лиганд к меланокортиновым рецепторам; и, возможно, модуль – фолиевая кислота (лиганд к фолатным рецепторам). Также будет осуществлена оптимизация условий наработки, выделения и очистки нескольких вариантов МНТ-р21Waf1 для выявления наиболее перспективных с точки зрения стабильности, количества и чистоты получаемых конструкций при выделении. Наработка данных конструкций будет осуществлена биосинтетически в E.coli. Будет исследовано наличие/накопление этих белков в растворимой фракции и в тельцах включения и, исходя из этого исследования, будут оптимизированы условия выделения. Для этого будет осуществлен подбор времени наработки, плотности культуры клеток E. coli, концентрации индуктора экспрессии, температуры индукции, а также материалов и растворов для выделения. В случае использования МНТ с эпидермальным фактором роста в качестве лиганда после очистки будет проведен рефолдинг конструкции. Для оценки взаимодействия МНТ-р21Waf1 с PCNA будет осуществлена наработка и выделение белка PCNA. Для обеспечения возможности аффинной очистки на N-конец PCNA генноинженерными методами будут внесены дополнительные аминокислотные остатки. Завершающим этапом работы первого года будет определение равновесных констант сродства МНТ-р21Waf1 с белком PCNA в растворе. 2017 год. На второй год работы запланировано продолжить исследования взаимодействия полученных конструкций МНТ-р21Waf1 с белком PCNA in vitro, а также приступить к экспериментам на культурах клеток. Эксперименты на клетках будут включать в себя подбор оптимальной клеточной линии для работы с конструкциями, подбор оптимальных условий культивирования выбранной линии. Предполагается исследовать внутриклеточную локализацию уже созданных конструкций МНТ-р21Waf1 и осуществить проверку функционирования модулей. Планируется создание химерных конструкций с флуоресцентными белками для эукариотической экспрессии. Также будут проведены предварительные эксперименты по трансфекции выбранной клеточной линии этими новыми конструкциями. Планируется провести ряд экспериментов с мечеными эмиттером электронов Оже 111In с целью отследить возможность одновременно вносить повреждения в молекулы ДНК, так и блокировать репарацию разрывов ДНК. Также будут протестированы методы создания разрывов ДНК химическими и/или физическими факторами и методы их выявления. После этого планируется проведение исследования влияния созданных конструкций на репарацию разрывов ДНК в клетках-мишенях.

Доставка лекарственных препаратов с помощью МНТ является оригинальной технологией, разработанной и развитой в лаборатории заявителей, не имеющей аналогов в мире. За последние годы разработан целый ряд методик получения, очистки и выделения МНТ, нами проведены исследования in vitro и in vivo данных конструкций. В ряде работ как in vitro, так и in vivo, было показано успешное проникновение данных систем доставки в ядра клеток-мишеней, а также удерживание их там. У коллектива авторов имеется значительный объем опубликованных работ по полученным экспериментальным данным, среди которых: данные по специфическому связыванию с поверхностными рецепторами, специфическому накоплению в ядрах клеток-мишеней, рН-зависимом выходе из эндосом [D.G. Gilyazova et al., Proc.SPIE, 2005, 5973:101; Y.V. Khramtsov et al., J. Contr. Release, 2008, 128:241; T.A. Slastnikova et al., EJNMMI Research, 2012, 2:59; A.S. Sobolev, BioEssays, 2008, 30:278]. Для различных лекарственных препаратов – фотосенсибилизаторы и эмиттеры электронов Оже, присоединенных к МНТ и, тем самым, доставленных в клеточное ядро, показано увеличение эффективности действия по отношению к клеткам-мишеням более чем в 3000 раз [D.G. Gilyazova et al., Proc.SPIE, 2005, 5973:101; T.A. Slastnikova et al., EJNMMI Research; 2012, 2:59; E. Koumarianou et al., Nucl. Med. Biol, 2014, 41:441]. Данные работ с фотосенсибилизаторами in vivo свидетельствуют о торможении роста опухолей на 98% при внутривенном введении хлорина е6, присоединенного к МНТ, а также значительном увеличение выживаемости – в 3.75 раза по сравнению с контролем [T.A. Slastnikova et al., Int J Nanomed, 2012, 7:467]. Первые эксперименты с эмиттером электронов Оже 67Ga, присоединенным к МНТ, при внутриопухолевом введении показали значительный потенциал в увеличении медианной продолжительности жизни по сравнению с контрольной группой.