| 1 |
28 марта 2018 г.-31 декабря 2018 г. |
Механизмы избирательного торможения пролиферации опухолевых клеток человека, связанные с цитоплазматическими актинами |
| Результаты этапа: В рамках Проекта были получены данные об организации популяций актиновых филаментов в процессе деления в нормальных и опухолевых клетках. В нормальных эпителиальных митотических клетках была обнаружена четкая сегрегация и различное распределение изоформ немышечного актина на стадиях анафазы, телофазы и цитокинеза. Использование уникальных специфических моноклональных антител к цитоплазматическим изоформам актина, иммунофлуоресценции и конфокальной лазерной микроскопии позволили выявить, что бета-актин находится в экваториальной области во время анафазы, в сократительном кольце во время телофазы и цитокинеза. Гамма-актин в течение всего митоза и цитокинеза преимущественно находится в виде густой сети в субкортикальном слое клеток. Аналогичное распределение немышечных актинов в течение деления было обнаружено и в клетках рака молочной железы линий MCF-7 и MDA-MB-231. Локализация бета-актина в сократительном кольце во время телофазы и цитокинеза служит аргументом в пользу его роли в процессе сокращения. В дальнейшей работе мы планируем расширить данные о пространственной организации изоформ актина в течение деления и подготовить к печати публикацию.
Специфическая роль именно бета-актина в процессе разделения дочерних клеток подтвердилась в дальнейших экспериментах с использованием метода малых интерферирующих РНК (миРНК) в клетках рака молочной железы. Снижение экспрессии любой из изоформ подавляло пролиферацию клеток рака молочной железы. Впервые было показано, что именно супрессия бета-актина дополнительно к подавлению пролиферации вызывала значительное снижение популяции диплоидных клеток и накопление тетраплоидных и анеуплоидных клеток.
Методом проточной цитометрии была проведена оценка влияния экспрессии цитоплазматических актинов на распределение популяций опухолевых клеток по стадиям клеточного цикла. Обработка результатов при помощи программы ModFit помогла выявить, что в контрольной культуре MCF-7 практически все клетки были диплоидными (96,5 ± 3,5%). На 4-6 сутки подавления бета-актина в клетках MCF-7 количество диплоидных клеток снизилось и составило 82,3 ± 2,4%. Это сопровождалось увеличением популяции клеток на стадии G2/M и уменьшением популяции G0/G1. Аналогичные изменения были выявлены и в клетках MDA-MB-231 при супрессии бета-актина. Подавление гамма-актина в MCF-7, напротив, сопровождалось снижением популяции G2/M клеток и увеличением G0/G1 популяции, при этом все клетки культуры были диплоидными.
В митотических клетках MCF-7 снижение бета-актина методом миРНК вызывало накопление клеток в профазе/метафазе митоза по сравнению с контролем. Подавление гамма-актина индуцировало блок в телофазе в популяции митотических клеток.
В клетках фибросаркомы человека HT1080 мы наблюдали реорганизацию бета-актинового цитоскелета, подавление пролиферации и образование популяции многоядерных клеток в ответ на снижение митохондриальных активных форм кислорода. Наблюдаемые эффекты, по крайней мере, частично, были вызваны снижением активности киназ семейства Aurora.
Различное воздействие супрессии немышечных актинов на клеточный цикл определили направление дальнейшей работы. Основной интерес для нас представляли первичные циклины (A, B1, D1, D3 и E), которые играют ключевую роль в регуляции клеточного цикла. Впервые было обнаружено, что подавление бета-актина стимулирует экспрессию циклинов A2, B1 и D3, тогда как подавление гамма-актина снижает экспрессию этих циклинов в клетках рака молочной железы. Мы выявили, что циклин B1 и гамма-актин могут взаимодействовать (показано с помощью PLA анализа в митотических контрольных и бета-актин-дефицитных клетках ). Снижение бета-актина вызывало активацию киназы ERK1/2, уменьшение уровня гамма-актина, напротив, приводило к инактивации ERK1/2. Также было обнаружено прямое взаимодействие ERK1/2 с гамма-актином и циклином А2 в общем белковом комплексе. Мы предполагаем, что снижение уровня гамма-актина приводит к снижению уровня циклина А2, ингибирует передачу сигналов ERK1/2 и замедляет пролиферацию клеток рака молочной железы.
|
| 2 |
1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Механизмы избирательного торможения пролиферации опухолевых клеток человека, связанные с цитоплазматическими актинами |
| Результаты этапа: В рамках Проекта были получены данные об организации популяций актиновых филаментов в процессе деления в нормальных и опухолевых клетках. В нормальных эпителиальных митотических клетках была обнаружена четкая сегрегация и различное распределение изоформ немышечного актина на стадиях анафазы, телофазы и цитокинеза. Использование уникальных специфических моноклональных антител к цитоплазматическим изоформам актина, иммунофлуоресценции и конфокальной лазерной микроскопии позволили выявить, что бета-актин находится в экваториальной области во время анафазы, в сократительном кольце во время телофазы и цитокинеза. Гамма-актин в течение всего митоза и цитокинеза преимущественно находится в виде густой сети в субкортикальном слое клеток. Аналогичное распределение немышечных актинов в течение деления было обнаружено и в клетках рака молочной железы линий MCF-7 и MDA-MB-231. Локализация бета-актина в сократительном кольце во время телофазы и цитокинеза служит аргументом в пользу его роли в процессе сокращения. В дальнейшей работе мы планируем расширить данные о пространственной организации изоформ актина в течение деления и подготовить к печати публикацию.
Специфическая роль именно бета-актина в процессе разделения дочерних клеток подтвердилась в дальнейших экспериментах с использованием метода малых интерферирующих РНК (миРНК) в клетках рака молочной железы. Снижение экспрессии любой из изоформ подавляло пролиферацию клеток рака молочной железы. Впервые было показано, что именно супрессия бета-актина дополнительно к подавлению пролиферации вызывала значительное снижение популяции диплоидных клеток и накопление тетраплоидных и анеуплоидных клеток.
Методом проточной цитометрии была проведена оценка влияния экспрессии цитоплазматических актинов на распределение популяций опухолевых клеток по стадиям клеточного цикла. Обработка результатов при помощи программы ModFit помогла выявить, что в контрольной культуре MCF-7 практически все клетки были диплоидными (96,5 ± 3,5%). На 4-6 сутки подавления бета-актина в клетках MCF-7 количество диплоидных клеток снизилось и составило 82,3 ± 2,4%. Это сопровождалось увеличением популяции клеток на стадии G2/M и уменьшением популяции G0/G1. Аналогичные изменения были выявлены и в клетках MDA-MB-231 при супрессии бета-актина. Подавление гамма-актина в MCF-7, напротив, сопровождалось снижением популяции G2/M клеток и увеличением G0/G1 популяции, при этом все клетки культуры были диплоидными.
В митотических клетках MCF-7 снижение бета-актина методом миРНК вызывало накопление клеток в профазе/метафазе митоза по сравнению с контролем. Подавление гамма-актина индуцировало блок в телофазе в популяции митотических клеток.
В клетках фибросаркомы человека HT1080 мы наблюдали реорганизацию бета-актинового цитоскелета, подавление пролиферации и образование популяции многоядерных клеток в ответ на снижение митохондриальных активных форм кислорода. Наблюдаемые эффекты, по крайней мере, частично, были вызваны снижением активности киназ семейства Aurora.
Различное воздействие супрессии немышечных актинов на клеточный цикл определили направление дальнейшей работы. Основной интерес для нас представляли первичные циклины (A, B1, D1, D3 и E), которые играют ключевую роль в регуляции клеточного цикла. Впервые было обнаружено, что подавление бета-актина стимулирует экспрессию циклинов A2, B1 и D3, тогда как подавление гамма-актина снижает экспрессию этих циклинов в клетках рака молочной железы. Мы выявили, что циклин B1 и гамма-актин могут взаимодействовать (показано с помощью PLA анализа в митотических контрольных и бета-актин-дефицитных клетках ). Снижение бета-актина вызывало активацию киназы ERK1/2, уменьшение уровня гамма-актина, напротив, приводило к инактивации ERK1/2. Также было обнаружено прямое взаимодействие ERK1/2 с гамма-актином и циклином А2 в общем белковом комплексе. Мы предполагаем, что снижение уровня гамма-актина приводит к снижению уровня циклина А2, ингибирует передачу сигналов ERK1/2 и замедляет пролиферацию клеток рака молочной железы.
|
