Изучение взаимодействия С-концевого домена РНК-полимеразы II и хроматина в элонгации транскриптов через нуклеосомуНИР

Understanding CTD-chromatin crosstalk during transcription through nucleosome

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 марта 2019 г.-31 декабря 2019 г. Анализ влияния модификаций С-концевого домена РНК-полимеразы II на транскрипцию через нуклеосому
Результаты этапа: В ходе работы над проектом в 2019 г. разработаны протоколы для изучения влияния фосфорилирования С-концевого домена (CTD) дрожжевой РНК-полимеразы II (РНКП II) на элонгацию через нуклеосому. Получены высокоочищенные препараты РНКП II, нефосфорилированной и гиперфосфорилированной по CTD. Подтверждена чистота и активность препаратов, а также наличие ожидаемых модификаций CTD или их отсутствия. Для целей проекта оптимизирована экспериментальная мононуклеосомная система транскрипции in vitro. Разработаны протоколы по тестированию в системе различных изоформ РНКП II, включая время-разрешенные подходы. Определены количественные изменения в выходе транскриптов и в сохранении гистонов на ДНК при гиперфосфорилировании РНКП II и последующей транскрипции хроматина. Показано, что фосфорилирование CTD РНКП II приводит к заметному изменению нуклеосом-специфичного паузирования фермента. Предложена модель влияния гиперфосфорилирования РНКП II на транскрипцию нуклеосомной ДНК.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Анализ влияния модификаций С-концевого домена РНК-полимеразы II на транскрипцию через нуклеосому
Результаты этапа: В 2020 году в ходе Проекта было продолжено изучение механизма транскрипции нуклеосомной ДНК РНК-полимеразой 2 (РНКП 2). Для исследования структурных изменений в нуклеосомной ДНК при транскрипции получены мононуклеосомы с флуоресцентными метками, внесенными в соседние супервитки ДНК и составляющими пару для определения эффективности ферстеровского резонансного переноса энергии (FRET, Förster resonance energy transfer). Структура матрицы и последовательность нуклеотидов позволяли получать различные элонгационные комплексы (ЭК) с РНКП 2, в том числе с точно известным расположением активного центра фермента. Были проведены эксперименты по транскрипции РНКП 2 и определены эффективности FRET в различных комплексах – в нуклеосоме, в ЭК с РНКП 2 вблизи нуклеосомы, а также в элонгационных комплексах, спонтанно образующихся в ходе транскрипции в течение ограниченного времени. Для наблюдения короткоживущего ЭК, образующегося при транскрипции ранней нуклеосомной области разработана и получена ДНК-матрица, позволяющая получить ЭК с соответствующим положением активного центра РНКП в ходе транскрипции в присутствии ограниченного набора рибонуклеозидтрифосфатов. В полученных ЭК определена эффективность FRET. По полученным данным сделаны выводы о структурных особенностях соответствующих комплексов. Так, предположено, что еще до входа в нуклеосому РНКП 2 может вызывать отворачивание проксимального к старту транскрипции участка нуклеосомной ДНК. Также сделан вывод о том, что уровень фосфорилирования CTD может влиять на скорость прохождения участков нуклеосомной ДНК, в которых происходит формирование внутринуклеосомных петель. Начато изучение роли N-концевых участков гистонов в ходе транскрипции, которые, предположительно, могут совместно с фосфорилированием C-концевого домена РНКП 2 влиять на формирование регуляторных нуклеосомных пауз РНКП 2 in vivo. Так, получены мононуклеосомные матрицы с использованием полноразмерных гистонов и октамеров с удаленными «хвостовыми» участками. Проведены эксперименты по транскрипции таких нуклеосом и определен эффект такой модификации нуклеосом на элонгацию через нуклеосому РНКП 2. Удаление N-концевых доменов гистонов приводит к ослаблению паузирования, в частности, в тех же участках, для скорости элонгации через которые значим уровень фосфорилирования CTD. Предположено, что совместное ускоряющее действие фосфорилированной формы CTD РНКП 2 и удаления «хвостов» гистонов может представлять собой регуляторный механизм преодоления нуклеосомного барьера для РНКП 2 вблизи промотора. Таким образом, в ходе Проекта разработаны методические подходы для изучения структуры ЭК методом детекции FRET между флуоресцентными метками в нуклеосомной ДНК, получены принципиально новые данные о структуре элонгационных комплексов, образующихся в ходе транскрипции нуклеосом, а также начато изучение роли N-концевых участков гистонов в формировании нуклеосомного барьера и модификаций С-концевого домена РНКП 2 на преодоление ферментом этого барьера.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".