Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеванийНИР

Epigenetic mechanisms of biological processes and their role in pathogenesis of oncological diseases

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 марта 2019 г.-31 декабря 2019 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: Разработан дизайн двух ДНК-матриц на основе нуклеосом-позиционирующей последовательности s603-42А, содержащих сайт связывания p53 из промотора CDKN1A, расположенный в различных ротационных ориентациях на нуклеосомной ДНК. Методами компьютерного моделирования были рассчитаны оптимальные положения флуоресцентных меток на ДНК: для метки Cy3 в положении +67 п.н., и Cy5 в положении +150 п.н.на нуклеосомной ДНК. Были разработаны методики получения и последующей очистки ДНК-матриц с высоким общим выходом и сохранением флуоресцентных меток. Разработана методика сборки и оценки качества полученных нуклеосом, содержащих одиночные сайты связывания p53 в различных ротационных ориентациях на нуклеосомной ДНК. Полученные препараты нуклеосом были охарактеризованы методами электрофореза в нативном ПААГ и spFRET микроскопии в растворе. Получены чистые (>90%) препараты нуклеосом. Разработана методика изучения кинетики связывания p53 с полученными нуклеосомами R11 и R16, а также со свободной ДНК. Проделанная за отчетный период работа является надежной основой для проведения структурных и кинетических исследований, запланированных на следующие этапы проекта. Были амплифицированы три ДНК-матрицы длиной 167 п.н, содержащие фрагмент линкерной ДНК длиной 20 п.н. и нуклеосом-позиционирующую последовательность (НПП) s603 длиной 147 п.н с ковалентно пришитыми флуоресцентными метками Су3 и Су5, позволяющими анализировать изменения в структуре нуклеосом на основе анализа эффективности FRET между ними. Для последующих структурных исследований на основе этих ДНК-матриц и октамеров гистонов Xenopus laevis дикого типа были собраны три типа строго позиционированных нуклеосом, отличающихся положением меток Cy3/Cy5. Высокие эффективность и качество сборки мононуклеосом были проверены и подтверждены методом FRET-анализа в ПААГ-геле в условиях нативного электрофореза. Для дальнейших экспериментов по определению роли С-концевых доменов в разворачивании нуклеосомы дрожжевым комплексом FACT в клетках дрожжей были экспрессированы следующие варианты дрожжевого комплекса FACT: (1) димер Spt16/Pob3 с делецией С-конца белка Spt16 (Spt16dCT/Pob3), (2) Spt16/Pob3 с делецией С-конца белка Pob3 (Spt16/Pob3dCT), (3) Spt16/Pob3 с делецией двух С-концов (Spt16dCT/Pob3dCT), (4) Spt16/Pob3 дикого типа. Полученные гетеродимеры были очищены из клеток дрожжей. HMGB-белок Nhp6 был экспрессирован в клетках бактерий E.coli и очищен с использованием гель-фильтрации. За отчетный период были получены все компоненты (нуклеосомы, белки дикого и мутантного типа), необходимые для проведения дальнейших исследований механизма действия фактора FACT на структуру нуклеосом. Эти исследования запланированы на следующие этапы проекта. Определены оптимальные условия процедуры переноса комплексов на сетки для последующего изучения интермедиатов разворачивания нуклеосом фактором yFACT с использованием методов электронной микроскопии. По данным электронной микроскопии изучены проекционные структуры интермедиатов разворачивания нуклеосом фактором yFACT. Показано, что yFACT способен полностью разворачивать нуклеосомную ДНК с физическим разделением гистонов, а изолированный Nhp6 не влияет на структуру нуклеосомы. Для изучения влияния модификаций гистонов на реорганизацию нуклеосом фактором FACT были получены ДНК-матрицы 603 с флуоресцентными метками Су3 и Су5 в положениях 35 и 112 п.н. Получены рекомбинантные дрожжевые гистоны дикого типа, а также гистоны H2A.Z и H3K56Q. Собраны гистоновые октамеры следующих типов: октамеры, содержащие нативные гистоны H2A, H2B, H3 и Н4; октамеры, содержащие гистон H2A.Z; октамеры, содержащие H3K56Q; октамеры, содержащие H2A.Z и H3K56Q. Эти гистоновые октамеры были использованы для сборки серии флуоресцентно-меченых нуклеосом, отличающихся по составу гистонов. Проверено качество сборки нуклеосом и их пригодность для дальнейших структурных исследований, запланированных на последующие этапы проекта. Разработаны методики формирования всех видов одиночных субнуклеосом и полных нуклеосом и их транскрипции РНК полимеразой 2. Впервые показано, что дрожжевой фактор FACT значительно облегчает транскрипцию мононуклеосом РНК полимеразой 2 in vitro. Удаление каждого из С-концевых участков субъединиц фактора FACT приводит к существенному снижению эффективности действия фактора при транскрипции нуклеосом, но эффект удаления С-концевого участка Spt16 более выражен. Полученные данные подтверждают и позволяют уточнить модель FACT-зависимой транскрипции нуклеосом, предложенную нами ранее. Проведена подготовка к экспериментам по изучению изменений в структуре октамера гистонов в процессе разворачивания нуклеосом под действием белкового фактора FACT. Получен гистон H2A(S113C), который затем был помечен по остатку С113 меткой Су5. Получены ДНК-матрицы s603, меченые Су3 в положении 13 п.н. или 57 п.н. Собраны мононуклеосомы, содержащие Су5-меченый гистон H2A и ДНК с меткой Cy3 в одном из двух положений. Нуклеосомы были очищены от побочных продуктов сборки в нативном геле. Предсказаны ожидаемые изменения в эффективности FRET при различных сценариях изменения в структуре октамера гистонов при разворачивании нуклеосом под действием белкового фактора FACT. В культуре клеток насекомых SF9 был наработан и хроматографически очищен рекомбинантный димер Spt16/SSRP1. Методом электронной микроскопии макромолекул были исследованы структурные отличия между комплексами FACT дрожжей и человека в отсутствии нуклеосом, показано, что структура человеческого комплекса более компактная, чем дрожжевого комплекса. Таким образом, присутствие дополнительного HMGB-домена влияет на структуру комплекса, делая ее более компактной. Разработан метод коррекции квантовых выходов флуорофоров на нуклеосомах в условиях детекции одиночных молекул на основе данных о временах детекции фотонов флуоресценции донора и акцептора. Разработаны и созданы ДНК матрицы и нуклеосомы, меченные только меткой-донором, только меткой-акцептором и обеими метками. Разработан и апробирован протокол измерения квантовых выходов флуоресценции в режиме измерения одиночных молекул. Измерены изменения квантовых выходов флуоресценции меток Cy3 и Cy5 в составе нуклеосом по сравнению с выходами флуоресценции этих же меток в составе свободной ДНК. Было показано, что квантовый выход флуоресценции меток в составе нуклеосом возрастает для донора до 0,37, а акцептора - 0,7. Новые величины квантовых выходов были применены для расчета расстояний между флуоресцентными метками и дальнейшего построения молекулярных моделей. Для обработки данных измерений, а также упрощения процедуры проведения коррекции квантовых выходов в режиме одиночных молекул была разработана программа FretBurstsGUI с графическим интерфейсом. Данная программа позволяет одновременно анализировать данные нескольких экспериментов и интерактивно исследовать характеристики вспышек флуоресценции, в частности для произведения корректировки квантовых выходов. Получены расчетные компьютерные модели оптимального расположения флуорофоров Су3 и Су5 для выявления конформационных переходов в молекуле ДНК при связывании белков Nhp6 и p53. С использованием компьютерных моделей разработаны модельные субстратные двунитевые фрагменты ДНК для анализа связывания белков Nhp6 и р53 методами spFRET-микроскопии. Получены фрагменты ДНК длиной 18 п.н., позволяющие посадку лишь одной молекулы белка Nhp6, а также фрагменты ДНК длиной 41 п.н. (всего три фрагмента). Все фрагменты содержат флуоресцентные метки Су3 и Су5 в различных положениях комплементарных цепей, представляющие собой FRET-пару и позволяющие методами spFRET-микроскопии детектировать изменения в конформации ДНК при связывании белка. Степень очистки полученных фрагментов от однонитевых олигонуклеотидов и побочных продуктов ренатурации составила 90-95%. Получен препарат белка Nhp6. Разработан протокол эффективного образования комплексов между модельными фрагментами ДНК и белком Nhp6. Установлено, что при длине субстратной ДНК 18 п.н. концентрация белка в 0,5 мкМ достаточна для полного связывания ДНК (100 нМ), при длине 41 п.н. эффективное связывание наблюдается только при концентрации белка 1 мкМ. Определено, что при связывании белка Nhp6 с 18-п.н. фрагментом наблюдается повышение эффективности FRET от 0,35 до 0,55, при этом наблюдается формирование одного комплекса между ДНК и белком. Для более длинных фрагментов заметного повышения эффективного FRET не наблюдается, но наблюдается постепенное формирование двух комплексов при повышении концентрации Nhp6 (предположительно, стехиометрическое соотношение ДНК:Nhp6 1:1 и 1:2). Методом spFRET-микроскопии мононуклеосом в растворе установлено что в присутствии 50-250 мМ КCl линкерная ДНК может принимать одно из двух конформационных состояний: «открытое» (линкеры находятся на значительном расстоянии друг от друга), или «закрытое» (линкеры сближены друг с другом на протяжении не менее 25 п.н.). Замена ионов калия на натрий приводит к увеличению расстояния между линкерами в «закрытой» конформации и уменьшает заселенность этой конформации. При увеличении концентрации КCl до 300 мМ и выше происходит увеличение расстояния между линкерами в «закрытой» конформации и снижение заселенности этой конформации. Был разработан экспериментальный подход, позволяющий вводить флуоресцентную метку в область оси симметрии нуклеосомной частицы для ДНК-матриц, несущих длинные линкерные фрагменты. На основании широкого набора измеренных нами внутримолекулярных расстояний методами интегративного моделирования была построена модель, описывающая структурные особенности «закрытой» конформации линкерной ДНК. Была разработана и получена флуоресцентно-меченая ДНК-матрица для сборки динуклеосом, допускающая скольжение одной из формируемых на ней частиц. На этой ДНК-матрице были собраны динуклеосомы. Структурные особенности динуклеосом были охарактеризованы методами spFRET и криоэлектронной микроскопии. Подобраны условия для получения и получены in vitro одно- и двуслойные стабильные ко-кристаллы гистоноподобного белка Dps E.coli с ДНК. Кристаллы изучены в аналитическом электронном микроскопе, установлена кристаллическая структура и влияние на нее двухвалентных катионов. Показано, что Dps в составе ко-кристалла сохраняет свою ферритин-подобную активность, то есть может стимулировать окисление ионов Fe2+ до Fe3+.
2 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа: от, являются промежуточными в процессе конденсации хроматина. Впервые изучена морфология псевдо-ядра, образующегося в бактериях при заражении вирусами. Выдвинута гипотеза, что псевдо-ядро защищает ДНК бактериофага от повреждения репаративными системами бактерии. С помощью молекулярного моделирования были исследованы последствия введения однонитевого разрыва в ДНК. Установлено, что это приводит к снижению жесткости и повышению эластичности поврежденной, по сравнению с интактной, молекулы ДНК. Получены нуклеосомы, содержащие мутантные варианты гистонов H2A и Н2В, хвосты которых полностью (gH2A) или частично (H2BΔ1-31) делетированы. Установлено, что делеции в хвостах гистонов не влияют на структуру ДНК в коровой области нуклеосомы. Было определено, что участок 1-31 гистона Н2В (но не гистона Н2А) играет важную роль в стабилизации структуры нуклеосомного ядра, что позволило сделать вывод о том, что структурно схожие гистоны Н2А и Н2В отличаются по своей роли в поддержании стабильности нуклеосом. Были получены нуклеосомы с метками в линкерных фрагментах, содержащие димеры гистонов gH2A/H2BΔ1-31 и H2A/H2BΔ1-31. Установлено, что хвосты гистонов Н2А и Н2В существенно влияют на конформацию линкерной ДНК, удерживая линкерные фрагменты ДНК в сближенном состоянии. Показано, что хвосты гистонов Н2А и Н2В помогают линкерному гистону Н1 формировать стержень-подобную структуру линкерных фрагментов ДНК, и вследствие этого важны для правильной компактизации нуклеосом при образовании фибрилл. Методом spFRET микроскопии было показано, что присутствие второй нуклеосомы приводит к частичному отворачиванию от 10 до 30 п.н. ДНК от позиционированной нуклеосомы в составе динуклеосом. С помощью электронной микроскопии (ЭМ) с негативным контрастированием было показано, что расстояния между нуклеосомами в динуклеосоме изменяются скачком, с приращением 3-4 нм (примерно один оборот двойной спирали ДНК). Модели, полученные методами интегративного моделирования, позволяют предположить, что при вынужденном «столкновении» двух нуклеосом на ДНК может происходить ступенчатое с периодичностью ~10 п.н. (шаг равный одному обороту спирали ДНК) отворачивание от 10 до 30 п.н. нуклеосомной ДНК от гистонового октамера. Результаты моделирования в сочетании с данными, полученными методами ЭМ и spFRET позволяют заключить, что динуклеосомы – динамические, асимметрично разворачивающиеся комплексы, имеющие вариабельную структуру. Синтезирован флуоресцентно-меченный пептид LANA, известный своей способностью связываться с нуклеосомами, и реконструированы FAM-меченые нуклеосомы на основе октамера гистонов Xenopus laevis. Проведены эксперименты по подбору условий формирования комплекса Lana с нуклеосомами и разработке методических подходов к определению константы связывания природного пептида LANA с нуклеосомами по подвижности комплексов методом гель-электрофореза.
3 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа:
4 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Эпигенетические механизмы биологических процессов и их роль в патогенезе онкологических заболеваний
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".