ИСТИНА

В предлагаемом проекте будут исследованы некоторые механизмы образования антител при иммунизации нативными и денатурированными белками и разработаны способы очистки антител к разным формам белков-антигенов. Для решения поставленных задач будет изучено влияние адъюванта Фрейнда на структуру белков-антигенов – тетрамерный белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу и мономерный белок – альфа-синуклеин. После проверки предположения о денатурирующем действии адъюванта Фрейнда на белки будет проведено сравнение содержания в антисыворотке антител на нативные и денатурированные формы белков-антигенов при внутривенной иммунизации нативными белками и подкожной иммунизации белками, суспендированными в адъюванте Фрейнда. Антисыворотка, предположительно, обогащенная антителами к нативным или денатурированным формам белка, будет использована для очистки нужных антител с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованных нативных, денатурированных, диссоциированных и агрегированным формах белков. Будет также разработан метод очистки антител на рекомбинантном альфа-синуклеине с гистидиновым «тагом», связанном с Ni-NTA-сефарозой, без предварительного выделения белка. Полученные антитела будут исследованы различными иммунологическими методами для доказательства эффективности их использования при проведении иммуноферментного анализа, иммуноблоттинга, иммунопреципитации и иммунофлуоресцентной микроскопии.

The proposed project aims to study some mechanisms of the formation of antibodies after immunization with native and denatured proteins and develop methods for purifying antibodies against different forms of protein antigens. In order to support business objectives, the influence of Freund's adjuvant on the structure of antigens – tetrameric protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and the monomeric one - alpha-synuclein will be studied. After checking the assumptions about denaturing action of Freund's adjuvant on protein structure, we will compare the content of antibodies against native and denatured forms of protein antigens in the antiserum after intravenous immunization with native proteins and after subcutaneous immunization with proteins in Freund’s adjuvant. The antiserum, presumably enriched with antibodies against native or denatured forms of the protein, will be used for the purification of the desired antibodies using affinity chromatography on immobilized native, denatured, dissociated and aggregated forms of proteins. We will also develop a method of purification of antibodies against recombinant alpha synuclein with 6-His "tag" associated with Ni-NTA-sepharose, without prior extraction of the protein. Purified antibodies will be investigated with different immunological methods to prove the effectiveness of their use in an enzyme immunoassay, Western blot sections, immunoprecipitation, and immunofluorescence microscopy.

Основным результатом реализации проекта будет разработка подходов, позволяющих получать из поликлональной антисыворотки набор достаточно специфичных антител, узнающих разные формы белков-антигенов: нативные, денатурированные, олигомерные и агрегированные. В основе предлагаемых методов лежат два основных приема. Во-первых, следует проверить предположение, согласно которому специфичность присутствующих в антисыворотке антител должна зависеть от схемы иммунизации. Так, внутривенное введение нативных форм белков при иммунизации должно приводить к обогащению антисывортки антителами против нативных форм, включая антитела на конформационные детерминанты. При внутривенном введении используется раствор белков-антигенов в физиологическом растворе без добавления адъювантов, что должно способствовать сохранению нативной конформации белка. Напротив, введение белков-антигенов вместе с адъювантами Фрейнда (при подкожной, внутримышечной иммунизации, а также при введении в лимфоузлы) может сопровождаться денатурацией, разворачиванием и агрегацией белков. Эти процессы должны осложнять выработку антител на нативную структуру белка и, особенно, на конформационные детерминанты. Прежде всего нами будут проверены предположения о влияние компонентов адъюванта Фрейнда на структуру белков-антигенов. В качестве таких белков нами была выбрана рекомбинантная спермоспецифическая глицеральдегид-3-фосфатдегидроназа и альфа-синуклеин, которые являются объектами исследования в нашей лаборатории и методами исследования структуры которых хорошо владеют участники проекта. Следует также отметить, что глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа является тетрамерным ферментом, а альфа-синуклеин – мономером, что позволит нам распространить сделанные выводы на более широкий класс объектов. Кроме того, альфа-синуклеин обладает склонностью формировать амилоидные агрегаты, а выработка антител на такие структуры представляется важной задачей. Оба исследованных рекомбинантных белка будут выделены в очищенном состоянии, причем альфа-синуклеин будет получен как с гистидиновым «тагом», так и без него. Таким образом, нами будут получены данные о влиянии полного адъюванта Фрейда, а также его компонентов (легкого минерального масла, ланолина и авирулентных микобактерий) на инактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, ее диссоциацию на субъединицы и денатурацию, а также на разворачивание (“unfolding”) и агрегационное состояние альфа-синуклеина. Оба белка будут использованы для иммунизации экспериментальных животных (кроликов) путем внутривенного введения белков в физиологическом растворе, а также подкожного введения белков с адъювантом Фрейнда. Затем будет проведено сравнение результатов иммунизации, проведенных по разным схемам, с помощью анализа специфичности антител в антисыворотке методами иммуноферментного анализа (ELISA) и иммуноблоттинга. Полученные антисыворотки, содержащие антитела к разным формам глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы или альфа-синуклеина, будут использованы для аффинной очистки нужных типов антител. Второй аспект предлагаемого проекта связан с разработкой методов, позволяющих изолировать достаточно гомогенную популяцию антител, предпочтительно взаимодействующую с одной из форм белка-антигена, на носителях с иммобилизованными белками. Прежде всего нами будет апробирован предлагаемый оригинальный метод, заключающийся в совмещении очистки и иммобилизации альфа-синуклеина с гистидиновым «тагом». На первой стадии будет проведено связывание рекомбинантного альфа-синуклеина непосредственно из экстракта клеток-продуцентов E.coli на Ni-NTA-сефарозе (никель-нитрилотриуксусная кислота-сефароза) через гистидиновый “таг”. После отмывания колонки от баластных белков она будет сразу использована для очистки антител против альфа-синуклеина из соответствующей антисыворотки. Элюция антител с колонки будет проведена по стандартной методике с использованием буфера с кислым рН. Будет также проверена возможность элюции комплекса антитело-альфа-синуклеин с последующей диссоциацией комплекса и удалением альфа-синуклеина с помощью металло-хелатной хроматографии. Нами будет также проведена иммобилизация глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы или альфа-синуклеина без «тагов» на бромциан-активированной сефарозе в условиях, позволяющих максимально сохранить их нативное состояние. Для этого будут использованы специально синтезированные препараты сефарозы с низкой степенью активации бромцианом, что позволяет в случае олигомерных белков проводить связывание за одну субъединицу. Эти препараты будут использованы в качестве иммуносорбентов для очистки антител против нативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и альфа-синуклеина. Иммобилизованная в нативном состоянии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа будет подвергнута обработке мочевиной и другими детергентами для получения иммобилизованных димеров, мономеров и развернутых полипептидных цепей этого фермента. Полученные иммуносорбенты будут использованы для выделения из антисывороток антител, обладающих сродством к перечисленным формам фермента. Будут также получены иммобилизованные нативные, денатурированные и агрегированные формы альфа-синуклеина с целью их использования для очистки антител к этим формам из антисыворотки. Выделенные специфичные очищенные антитела к различным формам глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и альфа-синуклеина будут всесторонне исследованы методами иммуноферментного анализа (ELISA), а также иммуноблоттинга и иммунопреципитации. Кроме того, будет проверена возможность применения полученных антител для иммунофлуоресцентного окрашивания различных клеток с использованием конфокальной микроскопии. Задачей этого этапа работы является доказательство возможности использования полученных антител для всех типов иммунного анализа. Результаты работы будут представлены на всероссийских и международных конференциях. По результатам работы будут подготовлены и опубликованы статьи в международных и отечественных изданиях.

У коллектива имеется необходимый задел для успешной реализации проекта. В частности, руководитель проекта имеет достаточный опыт получения рекомбинантных форм белков от стадии создания генетических конструкций до выделения гомогенного белка, а также изучения полученных белков различными методами. Также руководитель проекта участвовал в работе по выделению рекомбинантных форм спермоспецифичной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Был получен рекомбинантный фермент дикого типа, а также его мутантные формы. Сравнения стабильности, активности и кооперативных свойств выделенных форм позволили установить молекулярные механизмы стабилизации и кооперативности спермоспецифичной глицераьдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Оригинальность проведенных исследований подтверждается публикацией результатов в зарубежных журналах.Кроме того, руководитель проекта принимал участие в изучении влияния активных форм кислорода в регуляции активности сперматозоидов и роли глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в этих процессах, что позволило ему приобрести необходимый опыт как в определении каталитических параметров фермента, так и в применении методов иммуноферментного анализа. Другие участники проекта являются студентами старших курсов факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ и имеют достаточный опыт теоретической и практической работы, включая работу по выполнению курсовых проектов в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ. Один из основных исполнителей проекта (Е. Моисеева) участвовал в изучении роли различных полиэлектролитов в разрушении белковых агрегатов (в том числе, агрегатов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и амилоидных белков - прионов). Результаты этой работы были опубликованы в зарубежном издании.

В 2016 году были исследованы некоторые механизмы образования антител при иммунизации кролика нативной и денатурированной формами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Разработаны способы очистки антител к разным формам белков-антигенов из антисыворотки. Изучено влияние полного и неполного адъювантов Фрейнда на структуру тетрамерного белка, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу. Доказано денатурирующее действие как полного, так и неполного адъювантов Фрейнда на белок, проведено сравнение содержания в антисыворотке антител на нативные и денатурированные формы белка-антигена при внутривенной иммунизации нативным белком и подкожной иммунизации белком с адъювантом. Антисыворотка была использована для очистки нужных антител с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованных нативных и денатурированных формах белков. Полученные антитела были исследованы различными иммунологическими методами для доказательства эффективности их использования при проведении иммуноферментного анализа, иммуноблоттинга и иммунопреципитации. По результатам работы опубликована "on-line" одна статья в журнале "Biochemical and biophysical research communications" с импакт-фактором 2, 371