ИСТИНА

Основной задачей данного проекта является разработка нового неинвазивного оптического подхода, основанного на спектроскопии комбинационного рассеяния (КР), для мониторинга восстановления энергетической активности митохондрий в клетках сердца и мозга после гипоксии и повышенной клеточной активности, приводящих к ишемии ткани и инфаркту или инсульту. Развитие такого подхода необходимо для дальнейшего поиска диагностических методов, которые можно использовать в медицине для определения размеров повреждений в ткани, вызванных гипоксией/гипероксией и нарушением синтеза АТФ. В ходе выполнения проекта будет установлено, при каких условиях (длительности гипоксии, чередовании гипоксии/реоксигенации, введении защитных препаратов, в частности, доноров оксида азота (NO)) восстанавливаются работа дыхательной цепи митохондрий, синтез АТФ и нормальное функционирование клеток. На основании полученных результатов будет разработан методический подход, позволяющий по сигналу КР от цитохромов дыхательной цепи митохондрий оценить: (1) степень восстановления переноса электронов и синтеза АТФ после неблагоприятных условий (гипоксии, гипероксии и повышенной клеточной активности); (2) определить размер поврежденной ткани, в которой произошли необратимые повреждения.

The goal of the project is the development of the novel non-invasive approach, based on Raman spectroscopy for the monitoring of the energetic state of mitochondria in heart cells and neurons after hypoxia and the increased cell activity, that can lead to the infarction or stroke. The development of such an approach is important for the further development of diagnostical techniques that can be applied in medicine for the estimation of the size of the tissue damaged in the course of hypoxia/reoxygenation and after the disruption of ATP synthesis. Project is dedicated to the finding of the conditions of hypoxia/reoxygenation, application of drug treatment (e.g. NO donors) that can help cells to survive due to the restoration of the respiratory chain function and ATP synthesis. Obtained results will be used to develop methodological approach using Raman scattering from cytochromes to estimate rate of the electron transport in respiratory chain and ATP synthesis after hypoxia and increased cell activity and to estimate size of the damaged tissue.

Данные, полученные нами, помогут понять механизмы нарушения работы цитохромов в ЭТЦ митохондрий целого сердца и нейронах головного мозга и сформулировать рекомендации по возможному терапевтическому воздействию при ишемии предшествующих интервальных гипоксических тренировок. В ходе выполнения проекта планируется получить: 1. Новые данные об изменении конформации и редокс-состояния гемопорфирина в цитохромах с, с1, b (комплексов II, III) и относительного количества FAD+ в ЭТЦ митохондрий целого сердца в течение и после длительной и/или кратковременной гипоксии. Полученные данные продемонстрируют особенности действия интервальной гипоксии перед длительной гипоксией. 2. Будут получены результаты экспериментов по исследованию свойств цитохромов ЭТЦ митохондрий нейронов мозга при остановке синтеза АТФ при разных возрастах животных. 3. По результатам исследований будет разработана неинвазивная методика изучения цитохромов всех типов в ЭТЦ митохондрий клеток сердца и мозга. Будут выявлены параметры спектров КР митохондрий, чувствительные к изменениям активности комплексов ЭТЦ. Разработанная методика может быть использована для тестирования новых лекарственных препаратов на митохондрии сердца, а также для проверки новых профилактических и терапевтических процедур, перспективных для снижения зоны инфаркта в сердце и зоны инсульта в мозге.

Предварительные исследования, проведенные нашей группой показали, что спектроскопии РКР и ГКР являются крайне перспективными методами в решении поставленных задач. Так, мы показали, что с использованием микроспектроскопии РКР можно исследовать распределение восстановленных цитохромов с, с1 и bhigh, blow комплекса III и b560 комплекса II ЭТЦ митохондрий (рис. 2) в живых изолированных кардиомоцитов и продемонстрировали, что при помощи КР-картирования можно визуализовать неоднородность кардиомиоцитов по типу митохондрий (субсарколеммных и интерфибириллярных. На примере кардиомиоцитов нами был впервые предложен подход для качественного определения количества восстановленных цитохромов с и b-типа в живых клетках. Мы показали, что при действии перекиси водорода уменьшается содержание восстановленных цитохромов b комплексов II, III ЭТЦ и цитохромов с1, с. Полученные данные коррелировали с литературными данными и независимыми измерениями при помощи флуоресцентной микроскопии. Нашей было установлено, что на живом перфузированном сердце возможна регистрация КР сигнала от цитохромов дыхательной цепи в норме и при гипоксии и был предложен подход для полуколичественной оценки содержания оксимиоглобина [Brazhe et al., 2013]. В течение многих лет наша группа успешо занимается исследованиями свойств гемоглобина эритроцитов с использованием спектроскопий КР, РКР и ГКР в норме и при различных сердечно-сосудистых заболеваниях [Brazhe et al., 2009, Semenova et al., 2012, Luneva et al., 2007 и др.]. Нами была разработана методика КР-исследований эритроцитов («Методика измерения отношений интенсивностей пиков в спектрах комбинационного рассеяния на различных участках ядерных и безъядерных эритроцитов» Свид. № 24/11-01.00276-2008. 5 октября 2011).

В ходе выполнения проекта в 2016 г с использованием спектроскопий резонансного, ближнего инфракрасного и гигантского комбинационного рассеяния (КР) был получен ряд новых данных по изменению свойств цитохромов дыхательной цепи (электронтранспортной, ЭТЦ) митохондрий в различных клетках и органах: (1) в интактном сердце крысы при общей длительной и локальной гипоксиях, (2) в нейронах гиппокампа и коры больших полушарий мышей в норме и при мутации по белку CSB, вызывающей ускоренное старение, а также (3) в скелетных миоцитах человека при инсулиновой резистентности и сахарном диабете 2 типа (Д2Т). Кроме того, использованием спектроскопий резонансного КР и гигантского КР (SERS, англ.- surface-enhanced Raman spectroscopy) в экспериментах на мутантных цитохромах нами впервые было показано, какие изменения в конформации гема цитохрома С приводят к снижению его подвижности и активности переноса электронов. Также нами был разработан методический подход, основанный на спектроскопиях резонансного КР или ближнего инфракрасного КР, позволяющий на клетках и препаратах органов одновременно оценивать липидный состав клеточных компонентов и окислительно-восстановительное состояние цитохромов комплекса III, цитохрома С и FADH2/FAD пары комплекса II дыхательной цепи митохондрий. Впервые на целом сердце было установлено, что так называемое гипоксическое прекондиционирование (ГП) – экспозиция перфузированного сокращающегося сердца – трём коротким пятиминутным остановкам перфузии с пятиминутными интервалами восстановления перфузии оказывает защитный эффект на сердце при последующих 60-ти минутной глобальной гипоксии и 30-ти минутной реперфузии. Так, в группе сердец, подверженных ГП, после длительной гипоксии и реперфузии практически полностью восстанавливались исходные редокс-состояния цитохромов С и В-типов и относительное количество FAD/FADH2 в комплексе II ЭТЦ. Таким образом, кратковременные гипоксические тренировки, предшествующие общей сердечной гипоксии, способствуют восстановлению работы ЭТЦ. При этом в сердцах, сразу подверженных 60-ти минутной общей гипоксии, в процессе реперфузии происходило полное окисление цитохромов ЭТЦ и накопление FAD, что говорит о повреждении компонентов ЭТЦ при восстановлении поступления О2 в кардиомиоциты. Также мы продемонстрировали, что предложенный подход позволяет различать поврежденные участки сердца, в которых локально создались гипоксические условия, и здоровые участки сердца. Впервые на интактных миоцитах было показано, что в клетках пациентов с инсулиновой резистентностью и Д2Т увеличивается относительное содержание холестерина, а в митохондриальной ЭТЦ повышается относительное содержание восстановленных цитохромов В комплекса III за счет снижения содержания окисленных цитохромов, что может приводить к увеличению генерации О2- анион-радикала и окислительному стрессу. В ходе проекта мы также впервые обнаружили, что при мутации белка CSB в нейронах гиппокампа и кортекса мозга старых животных (14 мес) повышается содержание цитохромов В и С типов по сравнению с молодыми (3 мес) мутантными животными. Подобных изменений не наблюдалось в группах молодых и старых животных дикого типа. Выполнена серия экспериментов по сравнительному изучению функционального ответа ЭТЦ митохондрий на стимуляцию электронного транспорта в нейронах живых срезов мозга у CSB-мутантных и контрольных молодых и старых животных. Суммируя, результаты, полученные в ходе первого года выполнения проекта, свидетельствует о том, что спектроскопия КР является перспективным методом для анализа восстановления работы ЭТЦ митохондрий в функционирующих сердце и мозге в условиях in situ, что в при дальнейшем развитии может быть использовано для мониторинга работы ЭТЦ при оперативных вмешательствах на сердце и мозге.