ИСТИНА

Данный проект направлен на изучение фундаментальных принципов взаимодействия полупроводниковых наноструктур с биологическими системами. Он представляет собой междисциплинарное научное исследование, в котором ставятся следующие цели: комплексное исследование физических процессов в транзисторе с каналом-нанопроводом; разработка многоканального полевого/зарядового биосенсора на чипе, активным элементом которого является такой транзистор, обладающий уникальной зарядовой чувствительностью; разработка методики определения низких концентраций биомолекул в реальных образцах сыворотки крови. Предлагаемый проект является продолжением успешно выполненных грантов РФФИ № 11-02-12122, 09-02-12238 и 13-04-01137, направленных на разработку и исследование полевых/зарядовых сенсоров с субэлектронной чувствительностью. В проекте будет исследована возможность одновременной работы нескольких независимых близко расположенных сенсоров, обладающих избирательной чувствительностью к различным биологическим объектам, объединенных в одну многоканальную систему. Решение этой задачи особенно важно в области клинической медицины, где огромную роль играет возможность быстрого и одновременного определения в одном образце сразу нескольких исследуемых веществ. В проекте будет разработана технология изготовления на чипе нескольких близко расположенных полевых транзисторов с каналом нанопроводом на основе кремния-на-изоляторе, будут применены оригинальные методики формирования различных молекулярных рецепторных систем на поверхностях близко расположенных транзисторов. Результатом работ по данному проекту будут новые фундаментальные и технологические знания, позволяющие создать полевой/зарядовый многоканальный сенсор с высокой чувствительностью для детектирования биомолекул.

Главной фундаментальной целью проекта является создание и исследование сверхчувствительного мультисенсора на основе полевых транзисторов с каналом-нанопроводом для практического применения в биологических и медицинских исследованиях. Основные задачи исследования: - разработка методов изготовления оригинальных полупроводниковых наноструктур с заданными характеристиками; - исследование физико-химических свойств структур нанопровод-биокомплекс и механизмов их взаимодействия; - разработка и изготовление многоканального измерительного комплекса для исследования характеристик экспериментальных структур; - оптимизация методик иммобилизации различных биологических рецепторов на отдельные наноразмерные детекторы, исследование механизмов образования молекулярных комплексов, определение биологических объектов.

В ходе выполнения междисциплинарного научного исследования была разработана высокочувствительная мультисенсорная система для определения биологически важных соединений в предельно низких концентрациях. Это стало возможным благодаря совмещению уникальных методов изготовления наноразмерных структур, специально разработанных алгоритмов сбора и обработки сигнала, оригинальных методов ковалентной иммобилизации распознающих специфических биомолекул, оптимизации условий осуществления биоспецифических взаимодействий и методов регенерации поверхности нанопроводов. Работа мультисенсорной системы основана на одновременном использовании нескольких транзисторов с каналом-нанопроводом и модификации поверхности канала биомолекулами разной специфичности. Регистрация анализируемых молекул проводится по изменению проводимости полевого транзистора при их связывании с распознающими биомолекулами на поверхности каждого нанопровода. Для изготовления основного чувствительного элемента сенсора был разработан КМОП совместимый технологический метод, основанный на использовании процесса реактивно-ионного травления верхнего слоя кремния на изоляторе (КНИ) через маску, сформированную с помощью электронно-лучевой литографии. С его помощью в разных областях одного чипа были сформированы несколько независимых структур транзисторов, что позволило проводить независимую модификацию каждой области чипа различными реагентами и выполнять одновременные независимые измерения. Был предложен и реализован метод изготовления транзисторов из неравномерно легированного по глубине кремния на изоляторе, позволяющий последовательно уменьшать исходную проводимость канала. Исследование транспортных и шумовых характеристик изготовленных структур позволило определить методику выбора оптимальной рабочей точки транзистора с максимальным отношением сигнала к шуму. Достигнутая зарядовая чувствительность составила величину ~ 0.1 е/Гц1/2 на частоте f = 10 Гц. Проведено изучение резонансных свойств подвешенных кремниевых нанопроводов, которое показало, что они могут быть использованы в качестве сверхчувствительных датчиков массы для детектирования белков (с массой от 10 кДа и выше), вирусов и других биомолекул, в том числе в составе молекулярных биокомплексов. Разработан оригинальный метод модификации поверхности нанопровода бифункциональными реагентами и золотыми наночастицами небольшого размера (3-5 нм), поверхность которых используется для ковалентной иммобилизации антител в качестве распознающих биомолекул. Построенная электростатическая модель показала, что такая методика позволяет существенно увеличить эффективную сенсорную площадь нанопровода (до 6 раз) и емкостную электрическую связь между поверхностью нанопровода и детектирумым соединением. Данные были подтверждены экспериментально – чувствительность при использовании нанопроводов, модифицированных таким методом, достигает значения теоретически рассчитанного верхнего предела сдвига порогового напряжения 70±1 мВ на единицу изменения рН. В качестве анализируемых молекул в данной работе исследуются два белка - тиреотропный гормон гипофиза (ТТГ) и тиреоглобулин (ТГ), представляющие собой важные биомаркеры в клинической диагностике для распознавания патологий щитовидной железы. В качестве распознающих биомолекул использовали фрагменты специфических антител, ориентировано иммобилизованных на поверхности нанопроводов. Было выбрано два типа моноклональных антител, характеризующихся высоким значением константы аффинности и не имеющих перекрестной специфичности. Фрагменты данных антител, имеющих свободные тиоловые группы, иммобилизовали на каналах-нанопроводах двух отдельных транзисторов. Были исследованы условия биоспецифических взаимодействий антител с ТТГ и ТГ, представляющих собой белки, существенно различающихся по массе и заряду. Взаимодействие антител с белками изучали с использованием буферных систем, включающих модельный раствор сыворотки крови человека. Исследование биоспецифических взаимодействий разных белков проводили отдельно, а также одновременно в одной системе с двумя транзисторами. Предел обнаружения белков в одном анализе составил для ТТГ: (0,10±0,07)×10-3мкМЕ/мл, для ТГ: 6,0±0,9 пг/мл, что существенно ниже, чем у применяемых в настоящее время методов стандартного твердофазного иммуноферментного анализа. Проведена оптимизация биосенсора на основе транзистора с каналом-нанопроводом для определения бактерий E.coli методом молекулярно-генетического анализа с использованием иммобилизованного олигонуклеотидного зонда. Разработан оригинальный метод ориентированной ковалентной иммобилизации олигонуклеотидных зондов, модифицированных тиоловой группой. Исследованы возможности данного биосенсора для проведения гибридизации ДНК бактерий в условиях низкой ионной силы, необходимой для увеличения толщины двойного электрического слоя, определяемой длиной Дебая. Предложен протокол отмывки нанопроводов после проведения гибридизационного анализа ДНК с целью их многоразового использования. По результатам работ по проекту было опубликовано 9 статей в реферируемых научных журналах, получен патент Российской Федерации и сделано 13 докладов на российских и международных научных конференциях.