В связи с техническими работами в центре обработки данных, возможность загрузки и скачивания файлов временно недоступна.
 

Водные дисперсии нефункционализированных фуллеренов и эндоэдральных фуллеренов как наноразмерные про- и антиоксиданты в свободнорадикальных биохимических системахНИР

Aqueous dispersions of non-functionalized fullerenes and endohedral fullerenes as nanoscale pro- and antioxidants in free radical biochemical systems

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 30 июля 2019 г.-30 июня 2020 г. Водные дисперсии нефункционализированных фуллеренов и эндоэдральных фуллеренов как наноразмерные про- и антиоксиданты в свободнорадикальных биохимических системах
Результаты этапа: В ходе проекта получены высококонцентрированные водные дисперсии фуллеренов С60 и С70без функциональных групп, а также предложены методики получения водных дисперсий эндофуллеренов (до 100 мг/л) методом прямого диспергирования и замены растворителя. Условия получения водных дисперсий обеспечили увеличение общего выхода продукта до 90%, что позволяет снизить затраты на получение дисперсий. Это актуально для эндофуллеренов, стоимость которых высока. Для дисперсий изучены основные физико-химические характеристики – распределение частиц по размерам (имеют диапазон от 80 до 190 нм); электрокинетический потенциал (наночастицы обладают умеренной седиментационной стабильностью до нескольких месяцев с величиной электрокинетического потенциала ~—30 мВ. Дисперсии обладают низким содержанием остаточного органического растворителя (менее 0.1 мкг/л), содержание которого контролируется с помощью ГХ-МС в парофазном режиме. С помощью ИСП-АЭС, ВЭЖХ-УФ и ионной хроматографии установлен полный неорганический и органический состав примесных компонентов. Предложенные методики обеспечивают экспрессную оценку содержаний фуллеренов в водной дисперсии из спектров поглощения. В качестве результатов проекта по изучению про- и антиоксидантной активности для разных методик получения ВДФ представлены: 1) характеристики про- и антиоксидантной емкости в единицах стандартных про- и антиоксидантов, а также ферментов (нанозимная активность) в молекулярных свободнорадикальных системах. Показано, что ВДФ Gd@C82 реагирует с супероксидным анион-радикалом примерно в 10000 раз менее активно, чем супероксиддисмутаза, эта ВДФ примерно в 10–15 раз активнее ВДФ С60 и в 50 раз — ВДФ С70; Также показано, что ВДФ, полученные по методике замены растворителя, является несколько более активным перехватчиком супероксидного анион-радикала, как и в случае С60 и С70. 2) схемы химических реакций фуллеренов и эндофуллеренов в молекулярных свободнорадикальных системах; 3) константы скоростей реакций для схем п. 2 для выяснения механизмов участия фуллеренов и эндофуллеренов в молекулярных свободнорадикальных системах. Наночастицы (кластеры) фуллеренов С60, С70, Gd@C82 являются существенно более слабыми индукторами перекисного окисления липидов в модели «арахидоновая кислота/кумарин-334», чем Fe(II), примерно от 8000 до 10000 раз. В модели «пероксид водорода/люминол» водные дисперсии фуллеренов проявляли слабые пероксидазные свойства. В целом, водные дисперсии фуллеренов обладают слабыми антиоксидантными свойствами по отношению к органическим радикалам, умеренной СОД-подобной активностью и практически инертны по отношению к пероксиду водорода и липидным гидропероксидам.
2 1 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. Водные дисперсии нефункционализированных фуллеренов и эндоэдральных фуллеренов как наноразмерные про- и антиоксиданты в свободнорадикальных биохимических системах
Результаты этапа: 1-й год реализации проекта Все планируемые ключевые результаты достигнуты. В целом предложены методики и подобраны условия физико-химического анализа немодифицированных фуллеренов и эндоэдральных металлофуллеренов в водных дисперсиях. Предложены условия определения остаточных органических растворителей и продуктов их трансформации в ВДФ и ВДФ ЭМФ с помощью ПФА-ГХ-МС и ВЭЖХ на уровне до мкг/л. Предложены методики получения высококонцентрированных устойчивых ВДФ. Предложен способ очистки водных дисперсий фуллеренов от летучих органических веществ за счет использования сорбционной очистки. Отсутствие функционализации фуллеренов С60, С70 и эндофуллеренов (Y, Gd,)@C82 в водных дисперсиях доказано с помощью МАЛДИ, спектрофотометрии и ИК-НПВО спектроскопии. На основании данных элементного анализа (ИСП-АЭС), определения полярных органических компонентов (ВЭЖХ-УФ и флуоресцентный детектор), общего содержания фуллеренов при помощи спектрофотометрии, данных о размерах кластеров, измерения электрокинетических потенциалов предложен состав кластеров фуллеренов в ВДФ. Продемонстрирована высокая седиментационная устойчивость фуллеренов в ВДФ. Изучение про- и антиоксидантных свойств водных дисперсий фуллеренов методом активированной кинетической хемилюминесценции в молекулярных моделях показало, что ВДФ обладают слабыми антиоксидантными свойствами по отношению к органическим радикалам, умеренной СОД-подобной активностью, слабо выраженной пероксидазной способностью и практически не индуцируют липидную пероксидацию. С точки зрения возможного применения эндофуллеренов в качестве контрастирующих фармпрепаратов, минимальное влияние на АФК-гомеостаз является преимуществом. Ниже представлены конкретные результаты согласно списку планируемых результатов. 1. Получение высококонцентрированных водные дисперсии фуллеренов без функциональных групп на поверхности для фуллеренов С60 и С70. Методики получения водных дисперсий эндофуллеренов. Все результаты при выполнении пункта плана получены в полном объеме. 1.1. Получение водных дисперсий фуллеренов С60 и С70 и эндофуллеренов С60, С70, Y@С82, Gd@C82 по методике ультразвуковой замены органического растворителя из толуола Предложен способ получения устойчивых водных фуллереновых дисперсий (ВДФ) С60, С70, эндоэдральных металлофуллеренов Gd@C82 и Y@C82. Впервые для этого применили погруженный ультразвуковой зонд. Ранее такие зонды использовали для приготовления дисперсий производных фуллеренов с гидрофильными группами на поверхности фуллерена. Получены дисперсии по методикам замены органического растворителя (толуола), так и методика прямого диспергирования. Использование высокомощного ультразвукового оборудования позволило увеличить выход продукта (до 90%), минимизировать потери, а также сократить время ультразвуковой обработки с 168 ч до 12 ч. Среднее время приготовления ВДФ уменьшено в 10-15 раз по сравнению с помощью ультразвуковой ванны, в то время как конечные концентрации фуллерена в ВДФ остаются на уровне десятков мг/л (до 100 мг/л). Водные дисперсии С60, С70, Gd@C82, Y@C82 показали умеренную седиментационную стабильность, со средними значениями электрокинетического потенциала ~ –30 мВ при среднем диаметре нанокластеров в диапазоне от 90 до 190 нм. Разработанные методики позволяют получать исключительно чистые дисперсии по их степени чистоты основного компонента. Так методом МАЛДИ-МС доказано, что 99% основного компонента дисперсий находится в нефункционализированном состоянии (отсутствуют какие-либо группы на поверхности фуллерена), а оставшиеся 1-2% приходятся на гидроксилированные или эпоксидированные производные, которые иногда способствуют увеличению каталитического или антиоксидантного действия фуллеренов в их водных дисперсиях. В отчете представлен проект методики для крупнотоннажного получения ВДФ при использовании ультразвукового зонда. Методика достаточно хорошо масштабируется, поэтому при серийном выпуске ВДФ может быть применена в полном объеме. Показана работоспособность при получении ВДФ объемом до 1 л в течение 12 ч. Проект методики «Получение водных дисперсий с использованием погружного ультразвукового зонда по методике замены растворителя или прямого диспергирования» Навеску фуллерена растворяют в 20 мл толуола (х.ч.) с использованием ультразвуковой ванны в течение 30 мин (электрическая мощность не ниже 900 Вт) на воздухе (в случае методики прямого диспергирования — процедуру не выполняли — сразу переносили навеску в колбу Эрленмейера). Полученный раствор в течение 1 ч охлаждают до комнатной температуры и доводят до 50 мл с помощью толуола. Затем полученный толуольный раствор фуллерена добавляли к 250 мл деионизированной воды и подвергали ультразвуковой обработке с помощью погружного ультразвукового зонда в течение 12 ч до видимого испарения верхней органической фазы и образования водного темно-желтого раствора (для С60), темно-красного раствора (для С70), темно-серого раствора (для Gd@C82 или Y@C82) в конической колбе с толщиной стекла не более 3 мм. После полученный раствор доводили до кипения и кипятили в течение 30 мин с дополнительной продувкой инертным газом (аргон, чистота не ниже 99.99%) со скоростью не ниже 0.1 л/мин. После охлаждения раствор фильтровали с использованием фильтра Шотта и микропористого фильтра 220 нм, доводили до метки деионизированной водой. 2. Оптимизация условий получения водных дисперсий за счет варьирования мощности ультразвукового оборудования, температурного режима нагрева двухфазной системы вода–органический растворитель (фуллерен) Подобраны условия оптимального получения водных дисперсий, в качестве основного параметра установлено, что мощность УЗ-оборудования необходимо выбирать не менее 80% от общей электрической мощности. Для водной дисперсии С60 выход продукта при 0.3 кВт — 15%, а для 0.6 кВт — 52% для соотношения компонентов 1:5 (органический раствор фуллерена:вода). Показано, что зонды с большей эффективной площадью поверхности дают наилучшие результаты по общему выходу. Напротив, при использовании (i) высокомощного ультразвукового источника (зонда) — происходит достаточно быстрый разогрев системы, поэтому в течение 1.5 часов температура достигает отметки 70-75 град.ц., что способствует быстрому испарению толуола и ускорения диспергирования фуллеренов. (ii) В случае использования ультразвуковой ванны использовали внутренний нагревательный элемент, потому как из-за меньшей мощности самопроизвольный нагрев системы происходит гораздо медленнее. Таким образом, общие рекомендации для увеличения выхода продукта и получения высококонцентрированных ВДФ фуллеренов и эндофуллеренов по методике замены растворителя и прямого диспергирования: необходимо использование погружного ультразвукового зонда, при максимальной электрической мощности, с большой относительной площадью рабочей поверхности и временем диспергирования до 12 ч. Полученные с помощью такого подхода дисперсии после соответствующей последующей очистки имеют концентрации до 100 мг/л (в случае С60 и С70, для ЭМФ Gd@C82 до 30 мг/л). 3. Оценка содержания остаточного органического растворителя (ГХ-МС в парофазном режиме) Ограничением широкого использования методики замены растворителя для биологических систем служит присутствие толуола, который обладает инактивирующим действием по отношению к ряду хемилюминесцентных систем. Для оценки содержаний разработаны методики, позволяющие на уровне мкг/л оценивать содержание примесных компонентов. Установлено содержание таких компонентов как толуол и его гомологи, бензойная кислота, фенол. С помощью сорбентов для обращенно-фазовой хроматографии предложены способы очистки полученных дисперсий по методике замены растворителя. Это позволило снизить содержание примесных компонентов до 0.1 мкг/л и ниже, что делает эти системы пригодными для тестирования in vitro и in vivo. 4. Основные физико-химические характеристики водных дисперсий Провели анализ водных дисперсий с помощью дополняющих друг друга методов спектроскопии и хроматографии. Комбинация спектрофотометрии, анализа общего органического углерода и ИСП-АЭС позволила разработать методику определения, которая снижает время анализа на основной компонент ВДФ для фуллеренов и эндофуллеренов. Измерение размеров коллоидных частиц в ВДФ методом динамического светорассеяния показало, что эффективный диаметр частиц лежит в диапазоне от 80 до 180 нм. Измерения электрокинетического потенциала показывают, что кластеры фуллеренов имеют отрицательно заряженную поверхность, для всех ВДФ C60 и C70 характеристическая величина потенциала составила около –30 мВ. Полученные электрокинетические потенциалы хорошо коррелируют с существующими данными. Значения электрокинетического потенциала подтверждают данные динамического светорассеяния. Полученные данные характеризуют ВДФ и ВДФ ЭМФ как стабильные коллоидные системы. Корреляции между величинами концентрации, радиуса и электрокинетического потенциала в работе не выявлены. Эти величины служат только для качественной оценки ВДФ как коллоидных систем, а также показателей их устойчивости. Проведена оценка примесного состава (неорганические компоненты), в основном получаемые за счет разрушения лабораторной посуды в процессе синтеза ВДФ и за счет частичного разрушения погружного зонда. Проведена оценка в общей сложности по 30 металлам и неметаллам, а также 5 анионам. Общее содержание примесных веществ в ВДФ оценено на уровне единиц мг/л и ниже до уровня единиц мкг/л. Предложены предварительные рекомендации по очистке полученных дисперсий, Показано, что с помощью мембранной фильтрации возможно удалить до 80% примесных компонентов. Для этого необходимо использовать целлюлозный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм фильтр позволяет снизить содержание титана и кремния. Напротив, пропускание через фильтр 0.22 мкм: снижает содержание элементов ниже пределов обнаружения ИСП-АЭС: <0.01мг/л. Эти данные подтвердили с помощью ИК-НПВО спектров. Окончательное решение проблемы очистки ВДФ будет выполнено на втором году реализации проекта. 5. Изучение про- и антиоксидантных свойств водных дисперсий фуллеренов методом активированной кинетической хемилюминесценции в молекулярных моделях Получены результаты активности ВДФ C60, С70 и ЭМФ Gd@C82 в основных молекулярных моделях генерации активных форм кислорода — (A) супероксидного анион-радикала (ксантин + ксантиноксидаза + люцигенин), (Б) модели окислительного стресса (Co(II) + H2O2 + люцигенин), (В) органических радикалов (термоиндуцированный распад 2,2’-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорида + люминол), (Г) пероксидазной или каталазной активности (пероксид водорода + люминол) и (Д) индукции перекисного окисления липидов (липидные гидропероксиды + кумарин С-334 или С-525). а. модель генерации супероксидного анион-радикала ВДФ C60 С70 и ЭМФ Gd@C82 в системе ксантин/ксантиноксидаза ведет к уменьшению свечения хемилюминесценции, что показывает их радикал-перехватывающую активность. На основании исследований показан разный механизм действия фуллеренов. В то время как С60 и С70 следует рассматривать не как СОД-миметики, действующие по каталитическому механизму, а как супероксид-перехватывающий агент. В отличие от этого механизм реакции Gd@C82 с супероксидным анион-радикалом похож на механизм действия СОД. ВДФ Gd@C82 реагирует с супероксидным анион-радикалом примерно в 10000 раз менее активно, чем супероксиддисмутаза, эта ВДФ примерно в 10–15 раз активнее ВДФ С60 и в 50 раз — ВДФ С70; Также показано, что ВДФ, полученные по методике замены растворителя, является несколько более активным перехватчиком супероксидного анион-радикала, как и в случае С60 и С70. Установленные различия в активности определяются параметрами кластера, прежде всего концентрацией доступных, действующих молекул на поверхности. Б. МОДЕЛЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ХЛ системе Co(II)-H2O2-люцигенин ВДФ С60, С70 и ЭМФ Gd@C82 проявляют антиоксидантные свойства, схожие с системой супероксидного анион-радикала и убывающие в ряду Gd@C82>С70>С60. В. модель генерации органических радикалов Для водных дисперсии фуллеренов С60, С70 и ЭМФ Gd@C82 наблюдали незначительное снижение интенсивности хемилюминесценции с медленным и длительным подъемом уровня свечения до исходного стационарного уровня, характерного для слабых антиоксидантов. Таким образом, водная дисперсия фуллерена является слабым антиоксидантом по отношению к перехвату радикалов АБАП. Значения коэффициентов наклона градуировочной зависимости от концентрации антиоксиданта в системе в случае С60 (меньше в 26.7 раза по отношению к тролоксу), С70 (меньше в 17.4 раза по отношению к тролоксу) и ЭМФ Gd@C82 (меньше в 11.9 раза по отношению к тролоксу). Оценена концентрация полуподавления хемилюминесценции, которая может служить условной характеристикой силы слабого антиоксиданта: С60 с1/2 = 9.4 мкМ, С70 с1/2 = 7.5 мкМ ЭМФ Gd@C82 с1/2 = 5.9 мкМ. ВДФ можно расположить в ряд по убыванию антиоксидантной активности Gd@C82>С70>С60. Г. модель Пероксидазной или КАТАЛАЗНОй активности В модели пероксид водорода/люминол показали, что ВДФ обладают пероксидазо-подобной активностью. Пероксидазная активность увеличивается в ряду С60 < С70 < Gd@C82, причем активность Gd@C82 в 1.6-1.7 раз выше, чем С60, С70. Д. МОДЕЛЬ ИНДУКЦИИ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ Изучена индукция перекисного окисления липидов (липопероксидазо-подобная активность) липидные гидропероксиды + кумарин С-334. В хемилюминесцентной системе арахидоновая кислота, кумарин-334 добавление 25 мкМ Fe(II) вызывает интенсивную быструю вспышку хемилюминесценции, в то время ВДФ С60 и С70 вызывают очень слабый, практически незначимый эффект. Подобное поведение характерно как для дисперсий, полученных по методике ЗР, так ПД. Незначительно усиление сигнала (до 1.1-1.3 раза) наблюдали для ВДФ Gd@C82. Таким образом, наночастицы (кластеры) фуллеренов С60 и С70 по отношению к индукции перекисного окисления являются более слабыми активаторами, чем Fe(II), примерно в 10000 раз. Для ВДФ Gd@C82 это величина составляет ~8000 раз. Возможный повреждающий эффект фуллеренов в липидных системах и мембранах практически сводится к нулю. 6. Математическое моделирование кинетики процессов, установление возможной схемы и механизмов реакций и оценка констант скоростей выполнены полностью. Для определения антиоксидантной активности нанопрепаратов применен метод математического моделирования, суть которого заключается в построении математической модели системы химических реакций и вычислении констант скоростей этих реакций. Принцип моделирования — решение прямой задачи, при этом задавали систему реакций при заданных начальных концентрациях участников реакций и варьировали соответствующие значения констант скоростей реакций, при этом достигая максимально возможного соответствия расчетных кинетических кривых с экспериментально полученными. Математическое моделирование позволило полностью описать кинетические схемы, лежащие в основе процессов оценки СОД-подобных свойства в модели ксантин + ксантиноксидаза, скэвенджерных антиоксидантных свойства в модели термоиндуцированного распада АБАП, пероксидазных и каталазных свойства в модели пероксида водорода, а также изучить индукцию перекисного окисления липидов. При этом, активность фуллеренов оценивали либо относительно стандартных веществ, либо находили относительные активности между собой в ряду С60, С70, Gd@C82. Обычно, во всех моделях ВДФ эндофуллерена Gd@C82 обладал большей активностью по сравнению с С60 и С70. В хемилюминесцентных моделях оценена супероксиддисмутазная и пероксидазная активность этих веществ, однако несмотря на широкое распространение системы ксантин/ксантиноксидаза в качестве модельной, механизм реакции в ней является чрезвычайно сложным, что не позволяет провести математическое моделирование кинетики и предположить схему реакций. При моделировании скэвенджерных антиоксидантных свойств для термоиндуцированного распада АБАП подтвердили, что ВДФ обладают слабыми антиоксидантными свойствами в системе «АБАП+люминол». Анализ констант скоростей показал, что ВДФ С60, С70, Gd@C82 проявляют слабые антиоксидантные свойства, в 200, 60, 40 слабее тролокса, соответственно. Водные дисперсии фуллеренов в модели пероксид водорода/люминол не проявляли ни пероксидазных, ни каталазных свойств. Получены низкие значения констант скоростей реакции на уровне единиц мкМ^-1мин^-1. В хемилюминесцентных моделях оценена способность индуцировать перекисное окисление липидов (липопероксидазная активность). В реакции ВДФ С60 константа реакции основного процесса составляет 0.201 мкМ^-1мин^-1, для С70 0.22 мкМ^-1мин^-1, для Gd@C82 0.29 мкМ^-1мин^-1. Низкие значения констант ВДФ фуллеренов подтверждают их низкую липидопероксидазную активность. 2-й год реализации проекта Все планируемые ключевые результаты достигнуты. В целом предложены методики по оценки прооксидантных свойства водных дисперсий фуллеренов (ВДФ — здесь и далее) по отношению к моноксиду азота (NO — здесь и далее). Исследованы эффекты ВДФ в системе NO + супероксидный анион радикал. Эта реакция приводит к образованию цитотоксичного пероксинитрита. Будет оценено возможное влияние ВДФ на продукцию пероксинитрита за счет антиоксидантных свойств по отношению к супероксиду и, возможно, к NO. Предложены способы и методики оценки про- и антиоксидантной активности ВДФ (С60 и С70), (Y@C82 и Gd@C82) на клеточных и тканевых моделях источников активных форм кислорода: Изучены (1) субклеточные источники АФК (митохондрии и эндоплазматический ретикулум). На изолированных митохондриях и микросомальной фракции методом хемилюминесценции с люцигенином показана способность ВДФ выступать как перехватчиков супероксидного анион-радикала, (2) на клеточных культурах различных клеток (фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки), методом люцигенин-активированной хемилюминесценции изучена активность ВДФ по отношению ко внутриклеточному супероксидному анион-радикалу, (3) в модели in vitro двойной стимуляции нейтрофилов изучено показано отсутствие активирующего или супрессорного действия, (4) методом конфокальной микроскопии показано отсутствие влияния ВДФ на агрегацию тромбоцитов. Изучена цитотоксичность ВДФ (С60 и С70), (Y@C82 и Gd@C82) по отношению к клеточным культурам. Проведена инкубация фибробластов человека с ВДФ различных концентраций, и при помощи МТТ-теста оценили выживаемость клеток (определены токсичные концентрации ВДФ для клеток). Изучено проникновение и распределение водных дисперсий фуллеренов и эндофуллеренов в клетки (на примере клеточных культур. Проведена оценка прооксидантной активности по отношению к внутриклеточным АФК. Ниже представлены конкретные результаты согласно списку планируемых результатов. 1. Изучение про- и антиоксидантных свойств водных дисперсий фуллеренов методом активированной кинетической хемилюминесценции по отношению к моноксиду азота (для всех типов ВДФ). Все результаты при выполнении пункта плана получены в полном объеме. Предложены способы получения и характеризации газовых смесей, обогащенных NO. Для этого получения моноксида азота, так мы рассмотрели три варианта: (1) использование баллонных газов, (2) электрохимически генерируемый моноксид азота из атмосферного азота с помощь специального оборудования (Плазон, МГТУ им. Баумана), (3) химическая генерация с помощью известной, модифицированной и адаптированной нами, методике на основе (нитрит калия+йодид калия+серная кислота). Показано, что наиболее дешевым и относительно чистым способ получения моноксида азота является методика химической генерации. Из-за высокой реакционной способности моноксида азота важно проводить предварительную дегазацию реакционных сосудов и растворов. Также предварительно перед получение насыщенных водных растворов NO, методом ИК-Фурье спектроскопией проводили оценку содержания основного компонента в генерируемых газовых смесях (см. табл.1). Так моноксид азота, получаемый с помощью электрохимического генератора из атмосферного азота, содержит весьма большое количество примесных компонентов (NO2) до 500 мг/м3, даже предложенные нами в работе способ сорбционной очистки газов c помощью колонок, заполененых твердым мелкозернистым гидроксидом натрия, не позволяют полностью очистить газовую смесь (см. табл. 1), остаточное содержание снижается только на 64%. Методом ИК-Фурье спектроскопии для газов установлено, что химическая генерация монокисда азота (методика 2) позволяет получать газовые смеси с общим содержанием примесных компонентов после сорбционной очистки (не более 5 об.%). Далее моноксид азота использовали для получения насыщенных водных растворов (методика 3). Количественное определение NO проводили согласно (методике 4). Немаловажным фактом для дальнейшего применения растворов NO в биологии и медицине необходимо контролировать остаточные содержание нитрат- и нитрит ионов (методика 5), которые образуются в результате растворения в воде примесного NO2 газовой смеси за счет диспропорционирования. Проведены эксперименты — в методе кинетической хемилюминесценции проведен подбор оптимальных условий регистрации ХЛ кривых. В качестве аналитического сигнала рассматривали светосумму (интегральная площадь под спектром — рис. 4). Подобрали наилучшие соотношения реагентов, для насыщенных растворов NO использовали достаточно низкую концентрацию оксида азота 300 нМ (0.3 мкМ), которая очень близка к физиологическому уровню NO в организме — норма от 1 до 200 нм [38]. В высоких концентрациях NO может повышать токсический эффект, связанный с образованием реакционного свободнорадикального соединения — пероксинитрита (ONOO–). Для оптимального соотношения реагентов исследовали водные дисперсии фуллеренов и изучали их поведение по отношению к растворам NO. Таким образом, ВДФ по отношению к моноксиду азота (в области микромолярных концентраций) проявляют значительные прооксидантные свойства в ряду С60> С70>Gd@C82~Y@C82. Что в первую очередь связано с особенностями электронного строения фуллеренов, где эндофуллерены являются гораздо лучшими акцепторами свободных радикалов и электронов по сравнению с фуллеренами [39]. 2. Про- и антиоксидантная активность водных дисперсий фуллеренов (С60 и С70) и гадолиниевых и иттриевых эндофуллеренов на клеточных и тканевых моделях источников активных форм кислорода. Достигнуто полностью (подробнее в п 2.1–2.4). 2.1. Субклеточные источники АФК (митохондрии и эндоплазматический ретикулум). На изолированных митохондриях и микросомальной фракции методом хемилюминесценции с люцигенином будет оценена эффективность ВДФ как перехватчиков супероксидного анион-радикала, производимого дыхательными цепями митохондрий и эндоплазматического ретикулума. Предложены условия выделения митохондрий (МХ) и микросомальной фракции (микросомы в супернатанте). Определено содержание белка в МХ и микросомах (мг/мл): МХ — 100, Микросомы — 7.6 (по Лоури). Далее выделенные фракции исследовали в аналитической хемилюминесцентной системе содержащей люцигенин. Проведены эксперименты по подбор оптимальных концентрации регентов. Установленно, что при 25 мкл 1 мМ Luc2+ в 1 мл достигаем наиболее чувствительное определение. Зарегистрирована кинетика процесса —> внесение стимула — НАДН (Никотинамидадениндинуклеотид)/НАДФН (Никотинамидадениндинуклеотидфосфат) (10 мкл 10 мМ р-р). Проведен подбор оптимальных объемов аликвоты супернатанта (рис. 6А) и суспензии МХ (рис. 6Б). 1) Подобраны рабочие концентрации (объемы аликвот) суспензии МХ и супернатанта, определяющие оптимальный уровень интенсивности ХЛ: V (МХ) = 20 мкл, V (супернатант) = 1 мл; 2) Отработана аналитическая система: ХЛ-зонд/объект/стимул (порядок смешения реагентов предполагает регистрацию ХЛ до добавления стимула в течение 30-60 с) (табл. 6) Проведены эксперименты с введением ВДФ всех типов — С60, С70, Gd@C82, Y@C82. Во всех случаях, за исключением МХ+НАДФН наблюдали усиление ХЛ сигнала (Рис. 10, Табл. 7). Так в случае стимула НАДН и введения ВДФ для МХ интесивность хемилюминесценции I (Y@C82) ≈ I (Gd@C82) ≈ I (контр.) < I (C60) < I (C70) и супернатанта I(контр.) < I(C70) < I(C60) < I (Y@C82) ≈ I (Gd@C82) получили усиление ХЛ-ответа на стимул. Напротив, в случае стимула НАДФН для МХ — снижение ХЛ-ответа на стимул (I (C60 ) < I (C70) < I (Y@C82) ≈ I (Gd@C82) < I(контр.), а для супернатанта ( I(контр.) < I (Y@C82) ≈ I (Gd@C82) ≈ I (C60) ≈ I (C70) — усиление ХЛ-ответа, а сила действия фуллеренов сопоставима. 2.2. Клеточные культуры и гомогенаты тканей. На клеточных культурах различных клеток (фибробласты, мезенхимальные стволовые клетки), методом люцигенин-активированной хемилюминесценции будет изучена активность ВДФ по отношению ко внутриклеточному супероксидному анион-радикалу. Проведены эксперименты по извлечению мозга крыс и гомогенизации в физиологическом растворе — концентрация мозгового вещества составила 0.5 г/мл. Подобрали стимул хемилюминесцентной системы (рис. 8). СОД-подобную активность определяли методом активированной хемилюминесценции по отношению к ткани мозга в оптимальной системе люцигенин + НАДН. Тканевая хемилюминесценция показала наилучшие результаты с мозгом крысы: мозжечок, гипоталамус, гиппокамп в системе с НАДН (см. рис. 9), для работы с наночастицами фуллеренов решили использовать гомогенат ткани мозга (методика 7). Оценили степень подавления свечения по отношению к контрольной пробе (К) для ВДФ С60, С70, Gd@C82, Y@C82, смеси C76-C86 на примере ткани мозга и легкого крысы (табл. 5). ВДФ обладали СОД-подобной активностью по отношению к гомогенатам мозга, причем С60 обладает в 2 – 3 раза большей активностью, чем С70; возможно, это связано с большей проницаемостью для С60 вследствие меньшего размера частиц. Способ получения ВДФ — замена растворителя или прямое диспергирование — не оказывал влияния на СОД-подобную активность ВДФ и эндофуллеренов. Из изученных эндофуллеренов, СОД-подобной активностью обладали ВДФ-Gd@C82 и ВДФ-Y@C82, причем их активность оказалась в два раза меньше, чем ВДФ С70 и примерно в пять раз меньше, чем ВДФ С60, что объясняется большим размером частиц (рис. 10). Установлено, что хемилюминесцентная модель ткань мозга/люцигенин/НАДН дает возможность изучить влияние наночастиц на внутриклеточную продукцию супероксидного анион-радикала микросомальной дыхательной цепью, которая является основным источником САР наряду с митохондриями. Инертность эндофуллеренов по отношению к САР в тканях делает их перспективными нанофармпрепаратами для целей контрастирования, поскольку обеспечивается минимальное влияние на свободнорадикальный гомеостаз. 2.3. Нейтрофилы крови человека. В модели in vitro двойной стимуляции нейтрофилов (форбол-12-миристат-13-ацетат и N-формил-метионил-лейцилфенилаланин) будет изучено возможное активирующее или супрессорное действие ВДФ методом люминол-активированной хемилюминесценции. Для анализа влияния фуллеренов на радикал-продуцирующую активность нейтрофилов крови в модели in vitro двойной стимуляции нейтрофилов за счет: (1) форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) и (2) N-формил-метионил-лейцилфенилаланин (фМЛФ) выбрали ВДФ С60, С70, Gd@C82, Y@C82 и кровь трех доноров: женщины 25-30 лет, без вредных привычек, здоровы. Один из доноров дополнительно проводил прием витаминов С и D (методика 8). За счет двойной стимуляции обеспечивается максимальное вовлечение радикал-продуцирующего ресурса нейтрофилов, а хемилюминесцентное детектирование обеспечивает наилучшую чувствительность определения аналитических параметров. Показано, что активация ХЛ за счет фМЛФ в случае всех исследуемых объектов сопоставима и находится в пределах ошибки эксперимента (рис. 11 А-В). ВДФ не оказывают активирующего или супрессорного действия на радикал-продуцирующую активность нейтрофилов крови в модели in vitro. 2.4. Тромбоциты крови человека. Методом конфокальной микроскопии будет изучено влияние ВДФ на агрегацию тромбоцитов. Методом люцигенин-активированной хемилюминесценции будет изучено влияние ВДФ по отношению к супероксидному анион-радикалу, источником которого является циклооксигеназа тромбоцитов. Анализ способности ВДФ вызывать агрегацию тромбоцитов проводили методом конфокальной микроскопии с использованием оригинальной проточной ячейки; исследованы ВДФ С60 (1), С70 (2), Gd@C82 (3) и Y@C82 (4) (концентрация ~10 мг/л, в скобках указан шифр на рисунках). Показано, что не наблюдаем существенных различий при введении наночастиц в проточную ячейку с кровью человека (рис. 11). Средние значения покрытия коллагена тромбами через 5 минут после прокачки крови находится на уровне контрольных экспериментов без добавления наночастиц (табл. 4 и рис. 12). Типичные фотографии контрольных экспериментов и с введением наночастиц приведены на рис. 13. Анализ данных показывает, что внутрисосудистое введение препарата не должно вызвать немедленного множественного тромбоза 3. Цитотоксичность водных дисперсий фуллеренов и эндофуллеренов по отношению к клеточным культурам. Будет проведена инкубация фибробластов человека с ВДФ различных концентраций, и при помощи МТТ-теста оценена выживаемость клеток. Таким образом, будут определены токсичные концентрации для клеток. Достигнуто полностью. Выживаемость клеток исследовалась с помощью обычного МТТ-теста (методика 9). Водные дисперсии C60, C70 и Gd@C82 исследованы в широком диапазоне концентраций от 15 пМ до 8.2 мкМ, от 15 пМ до 9.1 мкМ и от 0.2 пМ до 105 нМ, соответственно. Фуллерены инкубировали с клетками в течение 72 часов. При всех исследуемых концентрациях ВДФ С60 не оказывала токсического воздействия на клетки и только при 8.2 мкМ снижала жизнеспособность клеток на 20% (рис. 15а). Водная дисперсия С70 снижала жизнеспособность клеток менее чем на 20% при концентрациях 15 пМ — 1.4 нМ. В концентрациях 1.4 нМ — 9.1 мкМ C70 стимулировал клетки. Выживаемость клеток увеличивалась примерно на 20% (рис. 15Б). Добавление Gd@C82 было наименее благоприятным для клеток. Начиная с 0.9 пМ, это соединение снижало выживаемость клеток на 20% (рис. 15В). Таким образом, все исследованные ВДФ безопасны для клеток в широком диапазоне концентраций. ВДФ C60 и C70 не вызывали гибели клеток до концентрации 10 мкМ, однако металлофуллерен Gd@C82 был менее безопасен и вызывал гибель 20% клеток при концентрации в 100 раз меньшей (0.1 мкМ). Мы выбрали одинаковые концентрации для всех ВДФ, чтобы сравнить их эффекты. Мы рассмотрели: (1) 1.5 мкМ — верхнюю безопасную концентрацию для Gd@C82, (2) 5 нМ потому как эта концентрация все еще влияет на гены и белки. 4. Проникновение и распределение водных дисперсий фуллеренов и эндофуллеренов в клетки (на примере клеточных культур). Поскольку фуллерены обладают собственной флуоресценцией, будет проведена их визуализация в клетках методом конфокальной микроскопии после инкубации в течение 1 ч, 3 ч, 24 ч и 72 ч. Будет оценена кинетика проникновения фуллеренов в клетку и их распределение. Достигнуто полностью. Для флуоресцентной микроскопии окрашенных клеток использовали микроскоп Axio Scope.A1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Германия) и платформу конфокальной микроскопии Leica TCS SP8 (Leica Camera, Wetzlar, Германия). Эксперименты по флуоресценции проводили в 6-луночном планшете при концентрации клеток 106 клеток/лунку. Анализировали не менее 100 полей зрения; интенсивность флуоресценции на клетку и общую флуоресценцию анализировали с помощью программного обеспечения микроскопа (рис. 14 А-Г). Все исследуемые фуллерены начинали проникать внутрь клетки через 3 часа, после чего флуоресценция возрастает и достигает максимума через 24 часа (усиление в 1,8 раз). Результаты, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии, были подтверждены проточной цитофлуориметрией. 5. Оценка про- и антиоксидантной активности по отношению к внутриклеточным АФК. Будет проведена при помощи флуоресцентного красителя H2DCFH-DA (дихлордигидрофлуоресцеина диацетат). Нефлуоресцирующий DCFH является чувствительным внутриклеточным маркером наличия сильных окислителей и H2O2, окисляясь ими до интенсивно флуоресцирующего DCF. Перевыполнено. Помимо планируемых результатов получены дополнительные данные об экспрессии NOX4 (Одним из основных источников АФК в клетках являются NADPH-оксидазы (NOX), которые преимущественно локализованы в эндосомах.) После инкубации с ВДФ внутриклеточные АФК определяли при помощи флуоресцентного красителя H2DCFH-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат) на проточном цитометре. После проникновения в клетку соединение деацетилируется внутриклеточными эстеразами. Свободные радикалы окисляют нефлуоресцирующий H2DCFH в цитоплазме до высокофлуоресцирующего 2',7'-дихлорфлуоресцеина (DCF). На рис. 16 представлены гистограммы продукции DCF в клетках после добавления ВДФ С60, С70 и Gd@С82 по сравнению с пустыми клетками (без ВДФ) в зависимости от времени инкубации. Установлено, что (1) ВДФ С60, добавленная в клетки, имеет тенденцию к снижению уровня АФК в клетках через 1 и 3 ч независимо от концентрации. Внутриклеточная составляющая АФК снижается, несмотря на высокую активность фермента NOX4 (см. ниже) и митохондрий, которые способствуют синтезу АФК. После 24 ч инкубации уровень АФК повысился выше контрольных значений (рис. 16 А); (2) Инкубация с C70 (1.5 мкМ) вызвала значительное увеличение уровня АФК (p <0,01) после 1, 3 и 24 ч инкубации. При наномолярной концентрации (5 нМ) уровень ROS существенно не увеличивался (рис. 16 Б). (3) Инкубация с Gd@C82 привела к незначительному повышению уровня ROS после 3 ч инкубации. Через 24 ч наблюдалось снижение уровня ROS, особенно заметное для микромолярных концентраций (рис.16 В). Экспрессия NOX4. Мы исследовали экспрессию гена и белка NOX4 в клетках после инкубации с ВДФ C60, C70 и Gd@C82. Показано, что для 1.5 мкМ C60 уровень белка NOX4 увеличился в 3 раза (p < 0,01) после 1 ч инкубации и оставался повышенным в 1.5-2.8 раза в течение 3-24 ч. После 72 ч инкубации уровень белка NOX4 снизился до значения ниже холостого. При концентрации 5 нМ C60 вызывал увеличение NOX4 после 24 ч инкубации в 2 раза (p < 0.01). Через 72 ч инкубации белок NOX 4 снизился ниже уровня пустого места (рис. 17 a). При концентрации 1.5 мкМ C70 уровень белка NOX4 увеличился в 1.6-1.4 раза (p <0,01) в течение 3-24 ч и снизился до значения ниже холостого на 40% (p <0,01) после 72 ч инкубации. При концентрации 5 нМ C70 не вызывал значительных изменений в экспрессии белка NOX4 в течение 72 ч инкубации (рис. 17 c). Фуллерен Gd@C82 только в концентрации 1.5 мкМ вызывал увеличение уровня NOX4 через 24 ч инкубации в 2.5 раза (p < 0,01) и почти двукратное снижение (p < 0,01) ниже пустых значений через 72 ч (рис. 17 d). Экспрессия NOX4 регулируется его транскрипцией. Уровень белка NOX4 и транскрипционная активность гена NOX4 изменяются согласованно. Транскрипция NOX4, вызванная исследуемыми фуллеренами, изменялась синхронно с изменением уровня экспрессии белка, но с небольшим опережением (рис. 17b, d и f).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".