От оптимизации структуры линкера лигандов ПСМА до синтеза новых терапевтических конъюгатов против рака предстательной железыНИР

From optimizing the structure of the linker of PSMA ligands to the synthesis of new therapeutic conjugates against prostate cancer

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 октября 2019 г.-30 сентября 2020 г. От оптимизации структуры линкера лигандов ПСМА до синтеза новых терапевтических конъюгатов против рака предстательной железы
Результаты этапа: Целью проекта на первом этапе было получение серии лигандов на основе мочевины DCL, со смешанной конфигурацией дипептидного линкера и дальнейшее биологическое исследование полученной серии in vitro путем ингибирования реакции расщепления N-ацетил-аспартил-глутамата1. По результатам этих исследований будут сделаны выводы о влиянии конфигурации хиральных центров в дипептидной структуре линкера на соотношение структура-активность. За основу лигандов была взята мочевина DCL, содержащая хлорзамещенный ароматический фрагмент при атоме азота лизина (Рисунок 1). Данный выбор основан на ранее проведенных исследованиях, показавший, что такая структура способствует высокой аффинности к активному центру ПСМА2. Рис 1. Структура вектор-молекулы ПСМА, взятой за основу новой серии лигандов Представленный на рисунке фрагмент представляет собой трет-бутил защищенный лиганд мочевины с мета-хлорзамещенным фрагментом при атоме азота лизина. Также в структуру уже включена алифатическая часть линкера из фрагментов 6-аминогексановой кислоты и янтарного ангидрида, с помощью которого вводились фрагменты дипептидных цепочек, путем образования амидной связи. Для того чтобы установить влияние структуры линкера на аффинность всего лиганда, структура вектор-молекулы была зафиксирована и не варьировалась (Рисунок 2). Рис. 2. Общая структура лиганда. Синим цветом выделена вектор-молекула на основе мочевины с ароматическим фрагментом при атоме азота лизина, данный фрагмент структуры не изменяется. Красным цветом выделена дипептидная цепочка на основе фенилалнина или тирозина, которая будет варьироваться. Зеленым отмечена азидо-группа, необходимая для реакции азид-алкинового присоединения Синтез фрагмента вектор-молекулы на основе мочевины проводился по ранее отработанным методикам и включает в себя четыре стадии2 (Рисунок 3). Рис 3. Синтез основного вектора, селективно связывающего с ПСМА Дипептидные цепочки Phe - Gly / Gly - Phe Модифицированные линкеры и получаемые на их основе лиганды можно разделить на блоки, основываясь на свойствах их структуры. В первый блок линкеров и лигандов, полученных на данном этапе работы можно выделить линкеры полученные на основе глицина и фенилаланина. Целью данных цепочек было выяснить влияние положения ароматического фрагмента в структуре линкера на биологическую активность лиганда. Для этого один из ароматических фрагментов в дипептидной цепочке был замещен на глицин (либо в положении, ближнем к вектор-молекуле, либо в терминальном) (Рисунок 4) Рис 4. Синтез дипептидной цепочки Phe/Gly Существует множество методик постановки защитных групп в аминокислотах, но разработанный Фишером и Курциусом метод образования пептидной связи не нашел широкого применения из-за отсутствия селективно отщепляемых защитных групп3. В современной химии пептидов применяются две основные защитные функции аминогруппы – Boc и Fmoc4. В проводимых нами синтезах была выбрана Boc-защита, так как снятие этой группы происходит на последней стадии синтеза в кислой среде5. В то же время, Fmoc-защитная группа снимается в присутствии сильного основания, например пиперидина, что в нашем случае может привести к побочным продуктам переаминирования амидных групп в целевом соединении и затруднить выделение чистого продукта6. На первом этапе синтеза этого линкера нами была осуществлена постановка Boc-защиты на атом азота L-фенилаланина (или глицина). Реакцию проводили классическим взаимодействием аминокислоты с ди-трет-бутилдикарбонатом (Boc2O) в щелочном растворе тетрагидрофурана и воды с последующим выделением продукта реакции экстракцией этилацетатом, после предварительной нейтрализации раствора 1М раствором HCl. Проведение колоночной хроматографии на данной стадии не требуется. Структура данных соединений подтверждена 1Н ЯМР-спектроскопией. Анализ литературных источников свидетельствует о том, что одним из наиболее эффективных методов получения короткоцепочечных пептидов является RPPS (rapid repetitive solution phase synthesis) – быстрый повторяющийся синтез в фазе раствора7. Данный подход заключается в использовании активированных эфиров карбоновых кислот, селективно образующих амидную связь. В качестве активаторов используются такие реагенты, как N-гидроксисукцинимид NHS, разнообразные галогенированные производные фенола (например, пентафторфенол PfpOH) и другие. На втором этапе нами был осуществлен синтез дипептида L-Phe-Gly (или Gly-L-Phe). С этой целью первоначально с использованием системы реагентов EDC-HCl (N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимил гидрохлорид)– PfpOH был получен промежуточный активированный эфир фенилаланина. Данный интермедиат отличается высокой реакционной способностью по отношению к аминогруппе и устойчивостью к стандартным процедурам органического синтеза. Последующим его взаимодействием со свободной аминокислотой в присутствии третичного основания DIPEA был синтезирован дипептид Boc-L-Phe-Gly (и Boc-Gly-L-Phe) (Рисунок 5). Рис 5. Синтез дипептидной цепочки Boc-L-Phe-Gly с помощью реакции образования активированного эфира пентафторфенола Особенностью выбранного синтеза является отсутствие необходимости в колоночной хроматографии. Продукт 8 был выделен с помощью последовательного многократного переосаждения реакционной смеси в гексане и диэтиловом эфире с использованием УЗИ-диспергирования. В итоге было получено соединение, достаточно чистое для использования на следующей стадии синтеза. На третьем этапе повторно был осуществлен процесс активации карбоксильной группы соединения 8 с помощью активирующих агентов HOBt и HBTU с последующим взаимодействием с азидопропиламином в течение 24 часов при комнатной температуре в диметилформамиде. По окончании реакции проводили удаление растворителя при пониженном давлении, далее сырую реакционную массу растворяли в дихлорметане, и промывали несколько раз водой. Далее дихлорметан упаривали и хроматографировали полученную массу на колонке с силикагелем, в результате был получен промежуточный азидо-дипептид. Снятие трет-бутоксикарбонильной защиты проводили действием 10% раствора трифторуксусной кислоты в безводном дихлорметане. ТСХ-контроль протекания реакции показал, что полное снятие защиты при комнатной температуре происходит за 3-4 часа. Контроль реакции проводили методом тонкослойной хроматографии в элюенте дихлометан:метанол (90% : 10%) (Рисунок 6). Рис. 6 Контроль протекания реакции удаления Boc-защитной группы Структура подтверждена 1Н ЯМР-спектроскопией и масс-спектроскопией высокого разрешения. На снятие Boc-защиты указывает исчезновение синглета на 1.29 ppm, отвечающего за 9 протонов данной трет-бутоксикарбонильной группы. Таким образом, был осуществлен синтез серии из двух дипептидных линкеров: L-Phe-Gly и Gly-L-Phe, который был далее использован для получения высокоспецифичных ПСМА-векторов. Примененные методы синтеза характеризуются высокими выходами и несложностью выделения целевых продуктов. В основе синтетического пути синтеза лигандов на основе полученных дипептидов лежит реакция создания пептидной связи, повсеместно используемая в органическом синтезе. В качестве катализаторов используются реактивы, приводящие к образованию активированных эфиров, которые с легкостью реагируют с аминокислотами. В качестве активирующих реагентов используются фосфониевые соли (BOP, PyBOP, PyBrOP и др.), урониевые соли (HBTU, HATU, TBTU и др.), карбодиимиды (DCC, EDC, DIC)8. HOBt (Бензотриазол-1-ол) - реагент препятствующий рацемизации продукта в ходе реакции, поэтому он используется вместе с HBTU9. В качестве основания, депротонирующего кислоту, используется диизопропилэтиламин (DIPEA). Модифицированную вектор-молекулу и полученные дипептиды 12-13 вводились в реакцию с активирующими реагентами HBTU/HOBt и основанием DIPEA (Рисунок 7). Рис 7. Получение лигандов на основе полученных дипептидов Phe/Gly Для связывания с ПСМА у полученных лигандов необходимо наличие свободных карбоксильных групп10. Превращение трет-бутиловых эфиров в карбоновые кислоты осуществлялось в системе для удаления трет-бутильных защитных групп: 46,25% TFA, 46,25% DCM, 5% воды и 2,5% TIPS. Выбор данных условий подробно описан ниже. В результате был получен ряд лигандов-ингибиторов ПСМА 16-17. Структура полученных продуктов подтверждена данными 1H ЯМР-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Таким образом, были получены и охарактеризованы 2 лиганда первого блока на основе дипептидных цепочек фенилаланина и глицина. Для соединения 16 (L-Phe-Gly): 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.22 - 8.37 (1 H, m), 7.27 - 7.42 (1 H, m), 7.21 - 7.27 (2 H, m), 7.10 - 7.21 (1 H, m), 6.31 (1 H, dd, J=15.50, 8.28 Hz), 4.47 (1 H, s), 4.08 (1 H, d, J=8.13 Hz), 3.53 - 3.71 (1 H, m), 3.28 - 3.38 (1 H, m), 3.04 - 3.26 (2 H, m), 3.00 (1 H, dd, J=18.77, 5.01 Hz), 2.26 - 2.39 (2 H, m), 2.13 - 2.26 (3 H, m), 1.54 - 1.73 (2 H, m), 1.11 - 1.31 (3 H, m). ВЭЖХ: 91% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 943.4062 (calcd 943.4530 for C43H59ClN10O12 [M+H]+). Для соединения 17 (Gly-L-Phe): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 12.37 (3 H, br. s.), 8.29 (1 H, br. s.), 8.05 - 8.11 (1 H, m), 7.85 - 7.93 (1 H, m), 7.71 (1 H, d, J=6.36 Hz), 7.34 - 7.39 (1 H, m), 7.29 - 7.34 (1 H, m), 7.08 - 7.29 (8 H, m), 6.23 - 6.34 (2 H, m), 4.34 - 4.41 (1 H, m), 3.99 - 4.12 (2 H, m), 3.55 - 3.61 (2 H, m), 3.19 - 3.25 (3 H, m), 3.13 - 3.19 (2 H, m), 2.94 - 3.13 (6 H, m), 2.82 - 2.89 (1 H, m), 2.26 - 2.42 (5 H, m), 2.15 - 2.26 (3 H, m), 1.85 - 1.94 (1 H, m), 1.66 - 1.75 (1 H, m), 1.59 (3 H, td, J=6.60, 3.42 Hz), 1.50 (3 H, dd, J=13.94, 6.60 Hz), 1.41 (3 H, td, J=15.41, 7.34 Hz), 1.12 - 1.34 (5 H, m) ВЭЖХ: 98% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 943.4071 (calcd 943.4530 for C43H59ClN10O12 [M+H]+). Дипептидные цепочки Phe – Phe (Tyr) Второй блок пептидов и лигандов на их основе включал в себя дипептидные цепочки на основе фенилаланина и тирозина смешанной конфигурации. На участке ближнем к вектор-молекуле ПСМА был поставлен фенилаланин L или D конфигурации, терминальная аминокислота варьировалась такими аминокислотами как фенилаланин и тирозин L или D конфигурации. Синтез проводился аналогично дипептидным цепочкам фенилалнин/глицин из первого блока. Выходы представлены на рисунке 8. Рис. 8. Синтез дипептидных цепочек Phe – Phe (Tyr) После того как полученные дипептидные цепочки 26-29 были охарактеризованы основными физико-химическими методами анализа, на их основе аналогично методу описанному выше была получена новая серия из 4 лигандов, представленных на рисунке 9. Рис. 9. Получение лигандов на основе полученных дипептидов Phe/Tyr В данной реакции очень важным оказался подбор оптимального времени, при которой происходило бы удаление всех трет-бутильных групп в молекуле. На данном этапе была проведена оптимизация методики. Удаление трет-бутильных защит проводили в системе. Подобные системы часто используются для снятия трет-бутильных защитных групп в пептидном синтезе, поскольку наличие триизопропилсилана выступает в роли катионного поглотителя и защищает боковые цепи пептидных цепочек от побочных реакций11,12. Как правило это смесь в соотношении, где доля трифторуксусной кислоты достигает 80-95% процентов, 5-10% отводится на растворитель, который может представлять собой фенол, воду, дихлорметан или их смесь, 0,5-2,5% отводится на триизопропилсилан. Однако, в случае чувствительных к кислым условиям соединений, а аминокислотные последовательности с несколькими хиральными центрами являются таковыми, рекомендуется снизить содержание трифторуксусной кислоты до 45-50%13. Таким образом, была выбрана следующая система для удаления трет-бутильных защитных групп: 46,25% TFA, 46,25% DCM, 5% воды и 2,5% TIPS. На данном этапе проводилась оптимизация методики, которая заключалась в установлении оптимальной продолжительности реакции, при которой количество примесей в реакционной смеси было бы минимальным, что в свою очередь облегчает этап очистки и увеличивает выход реакции. Реакционную смесь отбирали на дальнейшую обработку через 2, 3, 4, 5, 6 и 24 часа, и исследовали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с целью установления количества побочных продуктов реакции. По результатам ВЭЖХ-МС наилучшие результаты были достигнуты при проведении реакции в течении 3 часов, количество целевого вещества составляет 79% в положительных и 94% в отрицательных ионах (Рисунок 11). При дальнейшей выдержке количество примесей увеличивается, что говорит о деградации целевого продукта. Установлено, что один из побочных продуктов имеет молекулярную массу 1031 (молекулярная масса продукта 1049), что может соответствовать либо побочной реакции со стороны глутаминовой кислоты с образованием ангидрида14 35.а, либо побочной реакции со стороны мочевины с образованием гидантоина15 35.b (Рисунок 10). Рис. 10 . Структура целевого и побочных продуктов реакции удаления трет-бутильных защит По истечении суток в реакционной смеси осталось только 50% целевого продукта в положительных ионах. Таким образом установлено, что оптимальное время проведения реакции составляет 3 часа. Выделение целевого продукта путем очистки методом обращеннофазовой хроматографии. а) ВЭЖХ реакционной смеси через 2 часа после начала реакции б) ВЭЖХ реакционной смеси через 3 часа после начала реакции в) ВЭЖХ реакционной смеси через 4,5 часа после начала реакции г) ВЭЖХ реакционной смеси через 6 часа после начала реакции д) ВЭЖХ реакционной смеси через 24 часа после начала реакции Рис. 11 ВЭЖХ-МС оптимизации реакции удаления трет-бутильных защитных групп Конечные соединения 34-37 были охарактеризованы основными физико-химическими методами анализа такими как ЯМР-спектрометрия, ВЭЖХ-МС и массспектрометрия высокого разрешения. Для соединения 34 (L-Phe-D-Phe): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.28 - 8.41 (1 H, m), 8.07 - 8.14 (1 H, m), 7.91 - 7.99 (1 H, m), 7.24 - 7.42 (3 H, m), 7.11 - 7.24 (9 H, m), 7.04 - 7.11 (1 H, m), 6.25 - 6.35 (2 H, m), 4.44 - 4.49 (1 H, m), 4.30 - 4.43 (2 H, m), 3.95 - 4.12 (2 H, m), 3.10 - 3.27 (8 H, m), 2.86 - 3.10 (6 H, m), 2.69 - 2.81 (1 H, m), 2.52 - 2.63 (1 H, m), 2.28 - 2.37 (2 H, m), 2.13 - 2.26 (5 H, m), 1.82 - 1.93 (1 H, m), 1.66 - 1.76 (1 H, m), 1.53 - 1.64 (3 H, m), 1.41 - 1.53 (4 H, m), 1.34 (2 H, br. s.), 1.12 - 1.30 (4 H, m). ВЭЖХ: 100% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 1033.4583 (calcd 1033.5780 for C50H65ClN10O12 [M+H]+). Для соединения 35 (L-Phe-D-Tyr): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.30 (1 H, d, J=14.79 Hz), 7.91 (1 H, br. s.), 7.25 - 7.49 (2 H, m), 7.06 - 7.25 (6 H, m), 6.98 (1 H, d, J=8.68 Hz), 6.61 (2 H, d, J=8.31 Hz), 6.31 (1 H, br. s.), 4.53 (1 H, br. s.), 4.43 - 4.48 (1 H, m), 4.29 (2 H, br. s.), 4.05 (3 H, br. s.), 2.86 (2 H, d, J=5.32 Hz), 2.63 (2 H, d, J=11.74 Hz), 2.10 - 2.27 (5 H, m), 1.85 (1 H, br. s.), 1.71 (1 H, br. s.), 1.55 - 1.67 (2 H, m), 1.48 (5 H, br. s.), 1.12 - 1.29 (4 H, m). ВЭЖХ: 98% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 1033.4538 (calcd 1049.5770 for C50H65ClN10O13 [M+H]+). Для соединения 36 (D-Phe-L-Phe): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 7.97 (1 H, d, J=7.34 Hz), 7.81 - 7.87 (1 H, m), 7.56 - 7.66 (1 H, m), 7.24 - 7.35 (2 H, m), 7.05 - 7.24 (8 H, m), 6.32 (1 H, br. s.), 4.36 (1 H, br. s.), 4.04 (1 H, d, J=5.75 Hz), 3.18 - 3.28 (3 H, m), 3.16 (2 H, d, J=6.72 Hz), 3.06 (1 H, br. s.), 2.99 (2 H, br. s.), 2.89 (1 H, d, J=11.68 Hz), 2.75 (1 H, d, J=13.63 Hz), 2.32 (2 H, br. s.), 2.20 (4 H, d, J=6.60 Hz), 1.81 (1 H, br. s.), 1.72 (1 H, br. s.), 1.59 (2 H, d, J=6.54 Hz), 1.48 (2 H, br. s.), 1.32 - 1.45 (2 H, m). ВЭЖХ: 92% в положительных ионах, 95% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 1049.4538 (calcd 1033.5780 for C50H65ClN10O13 [M+H]+). Для соединения 37 (D-Phe-L-Tyr): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.25 - 8.33 (1 H, m), 8.06 - 8.12 (1 H, m), 7.87 - 7.94 (1 H, m), 7.73 - 7.83 (1 H, m), 7.25 - 7.41 (2 H, m), 7.17 - 7.24 (3 H, m), 7.11 - 7.17 (2 H, m), 7.06 - 7.11 (2 H, m), 6.98 (2 H, dd, J=8.44, 1.65 Hz), 6.58 - 6.64 (2 H, m), 6.25 - 6.34 (2 H, m), 4.50 - 4.57 (1 H, m), 4.42 - 4.49 (1 H, m), 4.26 - 4.41 (2 H, m), 3.96 - 4.13 (2 H, m), 3.02 - 3.23 (7 H, m), 2.90 - 3.02 (3 H, m), 2.72 - 2.89 (2 H, m), 2.55 - 2.69 (2 H, m), 2.29 - 2.36 (1 H, m), 2.16 - 2.28 (6 H, m), 1.83 - 1.95 (1 H, m), 1.66 - 1.76 (1 H, m), 1.55 - 1.66 (3 H, m), 1.31 - 1.54 (6 H, m), 1.11 - 1.30 (5 H, m). ВЭЖХ: 98% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 1049.4389 (calcd 1049.5770 for C50H65ClN10O13 [M+H]+). Дипептидные цепочки Tyr – Phe (Tyr) При попытках введения аминокислоты тирозина с N-конца дипептидной последовательности методами жидкофазного синтеза, был обнаружен ряд сложностей. Во-первых, плохая растворимость тирозина в апротонных растворителях, которая привела к значительному снижению выхода на стадии постановки Boc-защитной группы. Во-вторых, на последующей стадии получения дипептидов возникли сложности из-за возрастающего количества побочных реакций. Обусловлено это тем, что в структуре тирозина в побочные реакции вступает гидрокси-группа в пара-положении. В результате выход реакции в данном методе опустился ниже 20%, что является крайне неудовлетворительным и не дает возможности использовать его в дальнейшем. Вариант с предварительной защитой гидроксо-группой тирозина предполагает увеличение количества стадий и усложнение очистки получаемых соединений. В результате было принято решение применить другой подход получения необходимых дипептидных цепочек, а именно перейти на твердофазные методы синтеза. Твердофазный синтез удобен в исполнении и обладает рядом преимуществ такими как высокая селективность проводимых реакций, отсутствием рацемизации (при правильном выборе твердофазного носителя), быстрота протекания реакций, позволяющая «собрать» необходимую структуру в течении небольшого времени (вплоть до нескольких часов)16. Твердофазный синтез пептидов начинают с С-конца, постепенно наращивая цепочку, за счет образования пептидных связей17. В данной работе в качестве твердофазного носителя была выбрана 2-хлортритильная смола в хлоридной форме (2-CTC). Данный тип смолы для пептидного синтеза очень удобен в применении так как препятствует рацемизации первых аминокислотных остатков, и предполагает возможность использования широкого разнообразия боковых цепочек (Рисунок 12). Также важно отметить условия снятия полученных цепочек со смолы18,19,слабокислые условия (0,5% раствор трифторукусной кислоты в дихлорметане) позволяют сохранить трет-бутильные защитные группы, присутствующие в структуре как вектор-молекулы, так и линкера (Рисунок 11). Рис.12. Получение дипептидных цепочек Tyr/Phe Для синтеза были взяты Fmoc-защищенные аминокислотные остатки фенилаланина и тирозина различных конфигураций. Снятие Fmoc-защиты протекает в основных условиях, что соответствует типу выбранной смолы. На первом этапе проводят активацию смолы 5% SOCl2 раствором в дихлорметане с добавлением каталитического количества диметилформамида в течение 4 часов при 40 оС. Далее производят присоединение первого аминокислотного остатка (фенилаланина или тирозина) к активированной смоле. Снятие Fmoc-защитной группы проводят в 20% растворе 4-метилпиперидина. Наращивание цепи проводят путем создания пептидной связи между аминогруппой остатка на смоле и карбоксильной группой следующего Fmoc-защищенного аминокислотного остатка (Рисунок 13). Рис. 13. Синтез целевых лигандов К готовой дипептидной цепочке после снятия Fmoc-защиты присоединяют модифицированную вектор-молекулу мочевины, путем создания пептидной связи, аналогично как на предыдущем этапе с использованием активированных эфиров HOBt и HBTU. Снятие со смолы проводят в 0,5 % растворе трифторуксусной кислоты в дихлорметане в течении 15 минут, трет-бутильные защитные группы вектор-молекулы и фрагмента тирозина в боковой цепи линкера не затрагиваются. После снятия со смолы для очистки соединений проводилась колоночная обращеннофазовая хроматография (Рисунок 11). Так как для азид-алкинового необходимо наличие азидной группы в структуре лиганда, то следующим этапом синтеза является реакция с 3-аминопропилазидом (Рисунок 14). С целью избежать рацемизации и максимально снизить количество побочных продуктов важно учитывать порядок смешения реагентов. К раствору лиганда в диметилформамиде последовательно добавляют аминопропилазид, HOBt, HBTU и DIPEA. Реакция проводится без предактивации и при пониженной температуре (0 °C). На этой стадии также требуется очистка соединений обращеннофазовой хроматографией. Рис. 14. Присоединение аминопропилазида Удаление трет-бутильных защитных групп проводилось так же, как было описано выше с использованием смеси 46,25% TFA, 46,25% DCM, 5% воды и 2,5% TIPS, в методах жидкофазного синтеза лигандов (Рисунок 15). Очистку проводили обращеннофазовой хроматографией, элюент: ацетонитрил – вода. Полученные соединения 46-49 на всех стадиях были охарактеризованы основными методами физико-химического анализа: 1H ЯМР, ВЭЖХ-МС, HRMS. Рис. 15. Получение конечных соединений серии Tyr/Phe Для соединения 60 (D-Tyr-L-Phe): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm (1 H, dd, J=8.47, 3.85 Hz), 7.97 - 8.02 (1 H, m), 7.88 (1 H, d, J=3.25 Hz), 7.77 (1 H, s), 7.34 (1 H, d, J=7.70 Hz), 7.25 - 7.31 (2 H, m), 7.21 - 7.25 (1 H, m), 7.19 (3 H, d, J=7.01 Hz), 7.14 - 7.17 (3 H, m), 7.07 - 7.14 (2 H, m), 6.83 (2 H, m, J=8.38 Hz), 6.55 (2 H, m, J=8.38 Hz), 6.26 - 6.31 (1 H, m), 6.24 (1 H, d, J=2.91 Hz), 4.51 (1 H, s), 4.44 (1 H, s), 4.35 (1 H, d, J=5.13 Hz), 4.19 - 4.27 (1 H, m), 4.01 - 4.10 (2 H, m), 3.22 (3 H, t, J=6.93 Hz), 3.15 (3 H, dd, J=14.37, 6.67 Hz), 3.09 (1 H, d, J=6.33 Hz), 3.00 - 3.05 (1 H, m), 2.94 - 3.00 (2 H, m), 2.88 - 2.94 (2 H, m), 2.69 - 2.77 (2 H, m), 2.31 (2 H, t, J=7.27 Hz), 2.15 - 2.24 (7 H, m), 1.87 (2 H, d, J=7.36 Hz), 1.68 (2 H, br. s.), 1.47 (4 H, br. s.), 1.37 - 1.43 (2 H, m), 1.31 - 1.37 (2 H, m), 1.21 - 1.29 (3 H, m), 1.13 (2 H, d, J=7.70 Hz). ВЭЖХ: 100% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 1049.4471 (calcd 1049.5770 for C50H65ClN10O13 [M+H]+). Дипептидные цепочки с замещенными аминокислотами Phe или Tyr Также в рамках проекта запланировано несколько серий лигандов с замещенными фрагментами фенилаланина и тирозина. Получение данной серии запланировано на второй этап проекта, но некоторые соединения были получены и охарактеризованы уже на первом этапе работы. Замещенный ароматический фрагмент в дипептидной цепочке вводился во второе положение. На данный момент получено 3 лиганда: с L-3-нитро-фенилаланином, L-3-бром-тирозином и L-3-гидрокси-тирозином (L-DOPA). Получение данных соединений проводили методами жидкофазного синтеза, так как в первом положении в данных цепочках был взят L-фенилаланин. Также новые лиганды с замещенными дипептидными цепочками планируется получать методами твердовазного синтеза. Введение нитро-группы в четвертое положение фенилаланина проводили в растворе 85 % серной кислоты, далее к раствору добавляли смесь концентрированных азотной и серной кислот при пониженной температуре (8-10 °C). По окончанию реакции раствор подщелачивали 40% раствором NaOH до pH = 2-3. Выпадавший осадок отфильтровывали и промывали водой до нейтрального pH (Рисунок 14). Введение атома брома в третье положение тирозина проводили следующим образом. Раствор HBr (конц.) в ледяной уксусной кислоте (33%) добавляли к суспензии L -тирозина в ледяной уксусной кислоте. Далее при интенсивном перемешивании медленно прикапывали бром в ледяной уксусной кислоте. Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Осадок фильтровали и промывали ледяной уксусной кислотой и Et2O (Рисунок 16). Рис. 16. Синтез замещенных фенилаланина и тирозина Было получено еще три лиганда на основе замещенных дипептидных цепочек фенилалнина и тирозина. Синтез проводили аналогично синтезу дипептидных цепочек методами жидкофазного синтеза, подробно описанными выше. (Рисунок 17) Рис. 17. Синтез замещенных дипептидных цепочек Phe/Tyr Получение серии лигандов 76-78 на основе данных дипептидов проводили вышеописанными методами жидкофазного синтеза (Рисунок 18). Рис. 18. Синтез конечных лигандов Для соединения 76 (L-Phe-L-Phe(3-NO2)): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.40 - 8.52 (1 H, m), 8.20 - 8.35 (1 H, m), 8.03 - 8.20 (3 H, m), 7.89 - 8.03 (1 H, m), 7.81 (1 H, dt, J=14.29, 5.78 Hz), 7.40 - 7.53 (2 H, m), 7.24 - 7.40 (3 H, m), 7.00 - 7.24 (9 H, m), 6.25 - 6.38 (2 H, m), 4.53 (1 H, br. s.), 4.40 - 4.51 (3 H, m), 4.23 - 4.40 (2 H, m), 3.97 - 4.14 (4 H, m), 3.20 - 3.31 (8 H, m), 3.02 - 3.20 (10 H, m), 2.85 - 3.02 (6 H, m), 2.79 (2 H, dd, J=13.42, 4.68 Hz), 2.14 - 2.35 (10 H, m), 1.82 - 1.96 (2 H, m), 1.55 - 1.80 (5 H, m), 1.30 - 1.55 (9 H, m), 1.07 - 1.30 (7 H, m). ВЭЖХ: 96% в положительных ионах, 93% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 1078.4382 (calcd 1078,5750for C50H64ClN11O14 [M+H]+). Для соединения 77 (L-Phe-L-Tyr(3-Br)): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.26 - 8.44 (1 H, m), 8.04 - 8.13 (1 H, m), 7.86 - 8.00 (1 H, m), 7.77 (1 H, d, J=15.96 Hz), 7.25 - 7.44 (3 H, m), 7.04 - 7.25 (6 H, m), 6.95 - 7.04 (1 H, m), 6.74 - 6.88 (1 H, m), 6.20 - 6.39 (2 H, m), 4.54 (1 H, s), 4.41 - 4.49 (1 H, m), 4.29 (2 H, d, J=5.14 Hz), 4.01 (2 H, br. s.), 3.08 (5 H, d, J=5.56 Hz), 2.80 - 2.90 (1 H, m), 2.77 (1 H, br. s.), 2.66 (1 H, d, J=2.08 Hz), 2.59 (1 H, br. s.), 2.28 - 2.38 (2 H, m), 2.12 - 2.28 (5 H, m), 1.76 - 1.94 (1 H, m), 1.54 - 1.76 (3 H, m), 1.36 (5 H, br. s.), 1.22 (4 H, br. s.), 1.12 (1 H, br. s.).ВЭЖХ: 91% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. HRMS (ESI) m/z 1028.3609 (calcd 1128,4730 for C50H64ClBrN10O13 [M+H]+). Для соединения 78 (L-Phe-L-Tyr(3-OH)): 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 8.35 (1 H, br. s.), 8.08 (1 H, s), 7.95 (1 H, br. s.), 7.55 (1 H, br. s.), 7.31 (3 H, d, J=7.58 Hz), 7.07 - 7.24 (10 H, m), 6.60 (3 H, d, J=7.15 Hz), 6.47 (1 H, br. s.), 6.31 (3 H, br. s.), 4.45 (3 H, s), 4.26 (3 H, br. s.), 4.06 (4 H, br. s.), 3.10 - 3.28 (15 H, m), 2.89 (12 H, br. s.), 2.69 (4 H, br. s.), 2.33 (5 H, br. s.), 2.21 (7 H, br. s.), 1.87 (1 H, br. s.), 1.50 (13 H, br. s.), 1.22 (7 H, br. s.) ВЭЖХ: 100% в положительных ионах, 100% в отрицательных ионах. LCMS (ESI) m/z 1065.45 (calcd 1065,56 for C50H65ClN10O14 [M+H]+). Результаты биологических испытаний in vitro ПСМА (Простатический специфический мембранный антиген, глутамат карбоксипептидаза II) - это Zn-зависимый металлофермент, который катализирует гидролиз пептидного нейротрансмиттера N-ацетил-L-аспатил-L-глутамата (NAAG) до глутамата (также нейротрансмиттер) и N-ацетил-L-аспартата (NAA) (Рисунок 20). Рис. 20. Схема реакции расщепления N-ацетиласпартилглутамата, катализируемой ПСМА Ингибирование ПСМА происходит в результате связывания со специфическими лигандами. Таким образом, аффинность синтезированных векторов с линкером коррелирует с эффективностью ингибирования ПСМА вектором. В исследованиях был использован протокол оценки количества, отщепляемого глутамата в грубом клеточном экстракте, основанный на каскадном ферментативном усилении сигнала от глутамата с флуоресцентной детекцией. Этот протокол требует достаточно высокого содержания ПСМА в клетках. Проанализировав несколько клеточных линий доступных в нашей лаборатории методом проточной цитофлуориметрии (опухолевые линии простаты LNCap и PC3, линия рака молочной железы MCF7, линия почки эмбриона HEK293T), и в соответствии с литературными данными, было установлено, что наибольший уровень ПСМА оказался в клеточной линии LNCap, которая была взята для дальнейшей работы20,21. Контрольный анализ проводился на синтезированном нами аналоге препарата DCL трифторацетате (Рисунок 21). Контроль специфичности детектируемого сигнала проводился по ПСМА-негативной клеточной линии PC3, в которой детектировался только эндогенный глутамат. PС3 – ПСМА-отрицательная линия аденокарциномы человека, являются адгерентными эпителиальными клетками22. Рисунок 21. Общая структура лигандов. Анализ ингибирования препаратами ПСМА проводился по нерадиоактивному протоколу с детекцией высвобождаемого в ходе реакции глутамата. Экстракт клеток линии LNCaP (10 μL) смешивался с 2 μL препарата соответствующего разведения. Для первичного тестирования использовалась серия разведений препаратов 2 нМ-100 мкМ с шагом разведения 3-5 раз. К полученной смеси добавлялся 1 μL 100 мкM раствора NAAG. Полученная смесь инкубировалась 2 часа при 37°C. После инкубации смесь разводилась вдвое реакционным буфером (13 μL) из набора Amplex Red Glutamic Acid Kit (Molecular Probes Inc., Eugene) и добавлялась многокомпонентная реакционная смесь для детекции глутамата, приготовленная в соответствии с протоколом производителя (26 μL). Проводилась инкубация 1 час при 37°C. Флуоресценция резоруфина, полученного в результате сопряженных реакций глутамат-детектирующего набора детектировалась на планшетном мультидетекторе VICTORX5 (Perkin Elmer Inc.) при длине возбуждения 555 нм и детекции при 580 нм. В качестве контроля эндогенного уровня глутамата в каждом эксперименте ставился контроль с заменой раствора NAAG на воду. Каждый препарат тестировался в 3 биологических репликах, каждая по две технических реплики. На графиках для каждой концентрации приведены межэкспериментальные погрешности. На первом этапе работы была исследована серия из 9 новых лигандов путем ингибирования реакции расщепления N-аспартил-ацетилглутамата на клеточной линии LNCaP. Результаты представлены в таблице 1. Таблица 1. Результаты биологических испытаний in vitro на клеточной линии LNCaP, путем ингибирования реакции расщепления N-аспартил-ацетилглутамата В данной таблице также приведены данные лигандов, полученных ранее (в таблице выделены серым цветом)2. В их структуре вектор-молекула также представлена мочевиной DCL с мета-хлорзамещенным ароматическим фрагментом при атоме лизина. Серия лигандов Gly/Phe Согласно полученным данным можно сделать вывод о том, что наличие ароматического фрагмента в терминальном положении критично и сильно влияет на аффинность лиганда L-Phe-Gly (821,0 ± 162,0 нМ). Отсутствие ароматического фрагмента в положении, ближнем к вектор-молекуле в целом также негативно сказывается на аффинности, но не столь выраженно Gly-L-Phe (293,0 ± 37,2 нМ). Таким образом, можно сделать вывод о том, что количество и положение ароматических фрагментов в структуре линкера оказывает существенную роль на биологическую активность, поэтому наличие именно дипептидых ароматических фрагментов является обязательным, для сохранения выскокой аффинности к ПСМА Серия лигандов Phe-Tyr(Phe) В данном блоке лигандов наилучшие результаты показывают лиганды с несмешанной структурой, в частности наивысшую аффинность показывает дипептидная цепочка L-Phe-L-Tyr (22,5 ± 6,0 нМ). Дипептидные цепочки смешанной структуры уступают, но позволяют сделать вывод о том, что фенилаланин в L-конфигурации оказывает благоприятное влияние на аффинность. Так наивысшие показатели принадлежат лигандам, содержащим как правило L-фенилаланин в первом положении (относительно вектор-молекулы): L-Phe-L-Tyr (22,5 ± 6,0 нМ), L-Phe-L-Phe (86,2 ± 23,9 нМ), L-Phe-D-Phe (279,0 ± 37,3 нМ). Серия лигандов Tyr-Tyr(Phe) Из данного блока лигандов испытания in vitro прошел лиганд с дипептидной цепочкой D-Tyr-L-Phe. Значение IC50 равное 741,0 ± 123,0 нМ показывает, что в данном случае введение тирозина в первое положение дипептидной цепочки снижает аффинность. Для более тщательного анализа соотношения структура/афинность в данном блоке лигандов необходимо получить еще 3 лиганда со следующими структурами дипептидных цепочек: D-Tyr-L-Tyr, L-Tyr-D-Phe, L-Tyr-D-Tyr. Также для более лучшего понимания влияния нахождения тирозина с N-конца дипептидной цепочки в процессе синтеза находится 2 лиганда несмешанной конфигурацией дипептидного линкера: L-Tyr-L-Phe, L-Tyr-L-Tyr. Серия лигандов с замещенными Phe/Tyr Получены данные о влиянии введения в структуру линкера замещенных фрагментов фенилаланина и тирозина. Замещенный ароматический фрагмент в данных структурах находится в терминальном положении. Введение второй 3-гидрокси-группы в структуру тирозина сказывается крайне негативно и практически делает молекулу неактивной. Однако результат для соединений D-Phe-D-Tyr(3-Br) (267,3 ± 151,8 нМ); L-Phe-L-Tyr(3-Br) (1390,0 ± 341,0 нМ) показывает, что конфигурация оказывает сильное влияние на аффинность. Поэтому в дальнейшем будут получены группы лигандов со схожими дипептидными цепочками (например, D-Phe-L-Tyr(3-OH)), чтобы проследить влияние обоих факторов. Таким образом, на данном этапе можно сделать вывод, что в первом положении относительно вектор-молекулы предпочтительнее вводить в структуру линкера L-фенилаланин, заместители при ароматических фрагментах в структуре линкера также могут оказывать значительное влияние, однако оно неразрывно связано и с конфигурацией аминокислотного остатка. В дальнейшем планируется дополнить результаты аффинности данными новых серий лигандов, чтобы сделать более точные выводы о влиянии тирозина в первом положении линкера. Синтез лигандов, находящихся в разработке В данной главе будут приведены уже синтезированные соединения для дальнейшего получения новых лигандов с дипептидными цепочками в структуре линкера. Соединения были получены как методами жидкофазного синтеза, так и методами твердофазного синтеза, которые были подробно описаны в предыдущих главах (Рисунок 22). Рис. 22. Синтез замещенных дипептидных цепочек Phe/Tyr Также в процессе получения находятся лиганды с дипептидными цепочками, где в первом положении находится L-Tyr. Получение ведется методами твердофазного синтеза. На данный момент синтезируется 2 лиганда, представленные на рисунке 23. Рис. 23. Синтез серии лигандов твердофазными методами Таким образом была успешно получена, охарактеризована и исследована in vitro серия новых лигандов ПСМА с дипептидными линкерами смешанной конфигурации. Были сделаны предварительные выводы о влиянии линкерной структуры на соотношение структура-активность. Планы на следующий этап включают в себя завершение синтеза блока серии лигандов, где тирозин находится с N-конца пептидной последовательности: D-Tyr-L-Tyr, L-Tyr-D-Phe, L-Tyr-D-Tyr, L-Tyr-L-Phe, L-Tyr-L-Tyr и установление соотношения структура-активность. А также синтез нескольких блоков серий лигандов с замещенными фенилаланином и тирозином (L-Phe(4-Br), L-Phe(3-Br), L-Phe(2-Br), L-Phe(4-Cl), L-Tyr(3-OH), D-Phe(4-Cl), D-Phe(4-Br), D-Phe(4-F), L-Tyr(2-Br) и т.д.), где будет устанавливаться влияние количества заместителей, влияние их положения в ароматическом кольце и влияние их природы на свойства лиганда и его аффинности. Также, на основе самых активных соединений планируется получить терапевтический конъюгат на основе монометилауристатина Е и провести испытания на цитотоксичность. Список литературы 1 A. E. Machulkin, Y. A. Ivanenkov, A. V. Aladinskaya, M. S. Veselov, V. A. Aladinskiy, E. K. Beloglazkina, V. E. Koteliansky, A. G. Shakhbazyan, Y. B. Sandulenko and A. G. Majouga, J. Drug Target., 2016, 24, 679–693. 2 2019, RF patent 2697519. 3 J. E. East, K. M. Carter, P. C. Kennedy, N. A. Schulte, M. L. Toews, K. R. Lynch and T. L. MacDonald, Medchemcomm, 2011, 2, 325–330. 4 K. Yamada, D. Hashizume, T. Shimizu, S. Ohki and S. Yokoyama, J. Mol. Struct., 2008, 888, 187–196. 5 B. F. Lundt, N. L. Johansen, A. Vølund and J. Markussen, Int. J. Pept. Protein Res., 1978, 12, 258–268. 6 G. B. Fields, , DOI:10.1385/0-89603-273-6. 7 C. A. G. N. Montalbetti and V. Falque, Tetrahedron, 2005, 61, 10827–10852. 8 S. Y. Han and Y. A. Kim, Tetrahedron, 2004, 60, 2447–2467. 9 B. Lygo and G. Pelletier, Encycl. Reagents Org. Synth., , DOI:10.1002/047084289x.rh052.pub2. 10 S. A. Kularatne, Z. Zhou, J. Yang, C. B. Post and P. S. Low, Mol. Pharm., 2009, 6, 790–800. 11 D. A. Pearson, M. Blanchette, M. Lou Baker and C. A. Guindon, Tetrahedron Lett., 1989, 30, 2739–2742. 12 J. Howl, Peptide Synthesis and Applications, 2005. 13 L. C. Chen, Y. C. Chen, C. Y. Su, W. P. Wong, M. T. Sheu and H. O. Ho, Sci. Rep., , DOI:10.1038/srep37122. 14 N. L. Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, 2006. 15 L. Konnert, F. Lamaty, J. Martinez and E. Colacino, Chem. Rev., 2017, 117, 13757–13809. 16 F. Guillier, D. Orain and M. Bradley, Chem. Rev., 2000, 100, 2091–2157. 17 A. El-Faham and F. Albericio, Chem. Rev., 2011, 111, 6557–6602. 18 B. K. Chatzi Olga, G. Dimitrios and S. George, Int. J. Pept. Protein Res., 1991, 37, 513–520. 19 K. & K. Y. Fujiwara, Y., Akaji, Chem. Pharm. Bull., 1994, 42, 724–726. 20 T. M. Chu, G. P. Murphy, E. Kawinski and E. A. Mirand, Cancer Res., 1983, 43, 1809–1818. 21 A. Ben Jemaa, S. Sallami, J. Céraline and R. Oueslati, Cell Biol. Int., 2013, 37, 464–470. 22 S. Tai, Y. Sun, J. M. Squires, H. Zhang, W. K. Oh, C. Z. Liang and J. Huang, Prostate, 2011, 71, 1668–1679.
2 1 октября 2020 г.-30 сентября 2021 г. От оптимизации структуры линкера лигандов ПСМА до синтеза новых терапевтических конъюгатов против рака предстательной железы
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".