![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Зрительная система человека находится в зоне особого риска развития ятрогенных заболеваний. Хронические повреждения тканей глаза могут возникать как осложнения офтальмологических процедур, применяемых для хирургического лечения разнообразных зрительных нарушений. Так, повреждения роговицы под действием ультрафиолетового излучения являются частыми осложнениями фоторефракционных кератэктомий (ФРК) – широко распространенных операций для коррекции близорукости (в РФ аномалии рефракции встречаются примерно у 40% граждан). Необратимые ятрогенные повреждения сетчатки могут возникать в офтальмологии в результате облучения глаза видимым светом высокой интенсивности при диагностических и хирургических процедурах, в особенности при операциях, сопровождающихся временным отсутствием его экранирующих и преломляющих сред. Наконец, ятрогенные эрозии роговицы могут возникнуть при вмешательствах, не связанных напрямую со зрительным анализатором, являясь распространенным осложнением длительной общей анестезии при проведении любы инвазивных процедур (27-44% хирургических пациентов). Все указанные осложнения могут приводить к значительному ухудшению зрения вплоть до его потери. Поскольку количество хирургических вмешательств, проводимых в офтальмологии и других областях медицины, с каждым годом неуклонно растет, поиск подходов к предотвращению ятрогенных повреждений тканей глаза и ускорению их регенерации, который планируется продолжить в рамках Проекта, является актуальной и востребованной задачей. На предыдущих этапах Проекта нами были разработаны и охарактеризованы (на клиническом, гистологическом, биохимическом и функциональном уровнях) модели трех распространенных ятрогенных заболеваний, а именно эрозий роговицы в условиях длительной общей анестезии (периоперационный синдрома сухого глаза, ПССГ), УФ-повреждений роговицы, а также фотоповреждений сетчатки (светоиндуцированная ретинопатия, СР). Было отмечено, что помимо окислительного стресса общим проявлением патологического процесса в рассматриваемых моделях является выраженное локальное воспаление, что согласуется с клиническими данными, полученными при обследовании пациентов с аналогичными патологиями. Действительно, воспаление тканей глаза является наиболее распространенным из ятрогенных осложнений, которое в случае присоединения инфекции (а также наличия аутоиммунных/системных факторов) может охватить не только ткани, но и сосудистые оболочки глаза, приводя к развитию специфических воспалительных заболеваний – увеитов. В связи с этим, противовоспалительная (в том числе, гормональная) терапия является стандартным и обязательным подходом к лечению ПССГ, а также послеоперационных осложнений у пациентов, перенесших ФРК, операции витреоретинальной хирургии и другие офтальмологические операции. На предыдущих этапах Проекта с использованием разработанных моделей нами была впервые установлена высокая эффективность митохондриально-адресованного антиоксиданта ПДТФ при ятрогенных офтальмологических заболеваниях, который проявлял выраженные протекторные свойства в отношении тканей глаза и ускорял их регенрацию. Однако применение ПДТФ не позволило полностью подавить развитие воспалительных процессов, а в некоторых случаях (УФ-повреждения роговицы) даже ускоряло их манифестацию. На сегодняшний день, стандартом противовоспалительного лечения ятрогенных осложнений является гормональная (кортикостероидная) терапия, однако рассматриваются и другие, в том числе, комплексные подходы, такие как применение иммуномодуляторов (ПССГ) и нестероидные противовоспалительные средств (НПВС) (УФ-повредждения после ФРК, СР). Однако в случае развития увеитов лечение, как правило, включает применение высоких доз кортикостероидов которое имеет целый ряд побочных эффектов. Таким образом, существует высокий запрос на новые эффективные негормональные методы лечения увеитов. С учетом вышесказанного особую актуальность приобретает разработка и испытание комплексной терапии ятрогенных заболеваний глаза, в которой антиоксидантное действие ПДТФ усиливалось бы за счет применения специфических противовоспалительных препаратов. Решению этой проблемы, а также ряда ассоциированных задач планируется посвятить исследования в рамках дополнительной фазы Проекта. Для достижения максимальной эффективности комплексного лечения ятрогенных заболеваний глаза, важно определить сигнальные механизмы развития воспалительного ответа в тканях глаза. Кроме того, для обеспечения совместимости и синергичности действия планируемых антиоксидантной (митохондриально-адресованной) и противовоспалительной терапий необходимо охарактеризовать механизм выявленного противовоспалительного действия ПДТФ. Исследования, проведенные на предыдущих этапах Проекта, показали, что динамика развития воспалительного процесса в глазу существенно различается даже при ятрогенном поражении одной и той же ткани. Так, УФ-повреждение роговицы сопровождаются быстроразвивающимся воспалительным ответом (кератитом и кератоконъюнктивитом), в то время как при ПССГ воспаление отличается более медленным и менее выраженным течением. Однако в обоих случаях воспалительная реакция может быть сравнительно легко выявлена путем биохимического анализа слезы, отвечающей за транспорт воспалительных молекул к роговице. При ятрогенных фотоповреждений сетчатки эффективным подходом для мониторинга воспалительных процессов будет биохимический анализ водянистой влаги (ВВ, жидкость передней камеры глаза), которая, также как и слеза, играет ключевую роль обеспечении антиоксидантной активности и локального иммунитета. Таким образом, что измерение содержания сигнальных молекул в слезе и ВВ может быть удобным инструментом для мониторинга провоспалительных сигналов и механизмов развития воспаления. В подтверждение этого предположения изменения уровней про- и противовоспалительных цитокинов было обнаружено у пациентов с при различных вариантах ССГ, диабетической ретинопатии, возрастной макулодистрофии, а также (наиболее выраженные) при увеитах. Помимо цитокинов, воспаление тканей глаза характеризуется увеличенной продукцией сигнальных липидов – эйкозаноидов и других оксилипинов, выброс которых активирует рост и увеличивает проницаемость кровеносных сосудов, а также стимулирует инфильтрацию тканей глаза иммунными клетками. Большинство из этих соединений образуются путем ферментативной трансформации полиненасыщенных жирных кислот, при участии трех основных ферментативных путей – циклооксигеназного, липоксигеназного и эпоксигеназного. С помощью определения паттернов воспалительных липидов, секретируемых в слезу или ВВ, можно детектировать специфический ферментативный механизм, обуславливающий развитие воспалительного процесса в каждом конкретном случае. Более того, с использованием полученной информации можно осуществить подбор высокоспецифичных противовоспалительных препаратов, селективно таргетирующих ферменты, отвечающие за метаболизм сигнальных липидов, или применяя в качестве лекарственного средства сами сигнальные липиды (например, резольвины), стимулирующие разрешение воспаления. К подобным препаратам относятся нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), которые являются ингибиторами циклооксигеназного пути и в последнее время все шире используются в офтальмологии. Таким образом, с помощью изучения воспалительного липидома слезы и ВВ можно выявить тенденции изменения концентраций тех или иных метаболитов, и, на основании полученных данных, предсказать, таргетирование какого из метаболитов/метаболических ферментов будет иметь наиболее выраженный эффект в отношении вторичного (ассоциированного с ятрогенными заболеваниями) или первичного (увеиты) воспаления тканей глаза вне и на фоне премедикации ПДТФ. С учетом вышесказанного, в рамках дополнительной фазы Проекта будет решаться целый ряд новых задач, посвященных подробному исследованию воспалительной компоненты ятрогенных заболеваний тканей глаза (роговицы и сетчатки) и сопряженного воспаления сосудистой оболочки глаза (увеитов), определению механизма противовоспалительной активности митохондриально-адресованного антиоксиданта ПДТФ в отношении тканей глаза, а также разработке и испытанию комплексных подходов к терапии ятрогенных заболеваний и увеитов, совмещающих выраженное протекторное действие ПДТФ и специфическую противовоспалительную активность специально подобранных препаратов. Для решения этих задач планируется использовать значительный научный задел, произведенный нами на предыдущих этапах Проекта, а именно разработанные и охарактеризованные на клиническом, гистологическом, биохимическом и функциональном уровнях модели трех широко распространенных в офтальмологической практике ятрогенных заболеваний: ПССГ, индуцируемого в условиях длительной общей анестезии, УФ-повреждений роговицы как осложнения ФРК, а СР, вызванной высокими дозами светового облучения, характерными для воздействия офтальмологических осветительных систем. Для всех трех моделей методами ИФА, а также тандемной масс-спектрометрии, сопряженной с ВЭЖХ, планируется изучить паттерны накопления в слезе и ВВ про- и противовоспалительных сигнальных молекул белковой (воспалительные цитокины) и липидной (оксилипины) природы, т.е. полностью охарактеризовать воспалительный протеом и липидом. Указанные исследования планируется произвести вне и на фоне профилактической терапии (премедикации) с использованием ПДТФ. На основе полученных данных, планируется определить метаболические пути развития воспаления в случае всех трех видов воздействия на орган зрения, с учетом которых подобрать противовоспалительный препарат, обладающий наибольшей потенциальной эффективностью в этих условиях. В итоге планируется разработать комплексную терапию с использованием ПДТФ и отобранного противовоспалительного препарата, эффективность которой планируется испытать в отношении всех трех типов повреждения тканей глаза на клиническом и функциональном уровнях. Наконец, планируется разработать экспериментальные модели переднего и заднего увеитов как воспалительных осложнений ятрогенных заболеваний/самостоятельных ятрогенных заболеваний. С использованием полученных моделей планируется всесторонне (на клиническом, гистологическом и функциональном уровнях) охарактеризовать развитие патологического процесса, определить метаболические пути развития воспаления, а также провести разработку и испытание новой моно (ПДТФ) и комплексной (ПДТФ плюс специфический противовоспалительный компонент) терапии для предотвращения/лечения этих заболеваний. В целом, тематика дополнительной фазы Проекта полностью соответствует научному приоритету П13 (восстановительная, регенеративная и адаптационная медицина), решает задачи социального аспекта (П13-4) и направлена на разработку мер профилактики ятрогенной утраты органов (П13-4-1) и совершенствование методов реабилитации, направленных на восстановление организма после ятрогенных воздействий (П13-4-2). При этом поставленные задачи имеют важнейшее фундаментальное и медико-социальное значение, а также планируемые результаты Проекта – широкие перспективы применения в клинической практике.
Human visual system is at particular risk of developing iatrogenic diseases. Chronic damage of eye tissues can occur as a complication of ophthalmic procedures applied for surgical treatment of a variety of visual impairments. Thus, corneal damage induced by ultraviolet radiation is a frequent complication of photorefractive keratectomy (PRK) - common operation for correcting myopia (in Russia, refractive errors occur in about 40% of citizens). Irreversible iatrogenic damage to the retina can occur in ophthalmology as a result of irradiation of the eye with visible light of high intensity in diagnostic and surgical procedures, especially in operations involving temporary absence of the shielding and refractive media of the eye. Finally, iatrogenic corneal erosion can occur due to interventions that are not directly related to vision, as it is a common complication of prolonged general anesthesia during any invasive procedures (27-44% of surgical patients). All of these complications can lead to significant impairment or even loss of vision. The number of surgical interventions carried out in ophthalmology and other areas of medicine is steadily increasing every year. Thus, within the framework of this Project, we plan to continue the search for approaches to prevent iatrogenic damage to eye tissues and accelerate their regeneration, which remains an urgent and relevant task. At the previous stages of the Project, we developed and characterized three models of common iatrogenic diseases on clinical, histological, biochemical and functional levels: namely, corneal erosion under conditions of prolonged general anesthesia (perioperative dry eye syndrome, PDES), UV damage to the cornea, and retinal photodamage (light-induced retinopathy, LIR). It was noted that in addition to oxidative stress, the pathological process in these models generally manifests as pronounced local inflammation, which is consistent with the clinical data obtained in patients with similar pathologies. Indeed, inflammation of ocular tissues is the most common iatrogenic complication, which, when aggravated by an infection (as well as in presence of autoimmune/systemic factors), can encompass not only the tissues of interest, but also the choroid, leading to the development of a group of specific inflammatory diseases - uveitis. In this regard, anti-inflammatory (including hormonal) therapy is a standard and mandatory approach to treating PDES, as well as postoperative complications in patients undergoing PRK, vitreoretinal surgery and other ophthalmic surgeries. At the previous stages of the Project, using the developed models, we established for the first time high efficiency of mitochondria-targeted antioxidant PDTP for treating iatrogenic ophthalmic diseases. PDTP showed pronounced protective qualities towards eye tissues and accelerated their regeneration. However, the use of PDTP did not completely suppress the development of inflammatory processes, and in some cases (UV damage to the cornea) even accelerated their manifestation. Today, the standard anti-inflammatory treatment of iatrogenic complications is hormonal (corticosteroid) therapy, but other strategies are considered, including integrated approaches, such as the use of immunomodulators (PDES) and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (UV damage after PRK, CP). However, in the case of uveitis, the treatment usually includes the use of high doses of corticosteroids, which have a number of side effects. Thus, there is a high demand for new, effective non-hormonal treatment for uveitis. In view of the above, the development and trial of an integrated therapy for iatrogenic eye diseases, in which the antioxidant effect of PDTP is enhanced by the use of specific anti-inflammatory drugs, is of particular relevance. The solution to this problem, as well as a number of associated objective, is the main focus of the research, planned in the framework of the additional phase of this Project. To maximize the effectiveness of integrated treatment of iatrogenic eye diseases, it is important to determine the signaling mechanisms for the development of the inflammatory response in ocular tissues. In addition, to ensure compatibility and synergy of the planned antioxidant (mitochondria-targeted) and anti-inflammatory therapies, it is necessary to characterize the mechanism of the identified anti-inflammatory action of PDTP. Studies conducted at the previous stages of the Project showed that the scenarios of ocular inflammation differ significantly even for iatrogenic damage of the same tissue. Thus, UV damage to the cornea is accompanied by a rapidly developing inflammatory response (keratitis and keratoconjunctivitis), while with PDES, inflammation has a slower and less pronounced course. However, in both cases, the inflammatory response can be detected relatively easily by biochemical analysis of tear fluid, which is responsible for the transport of inflammatory molecules to the cornea. For retinal iatrogenic photodamage, an effective approach for monitoring inflammation is the biochemical analysis of aqueous humor (AH, anterior/posterior chamber fluid), which, like tears, plays a key role in ensuring antioxidant activity and local immunity. Thus, measuring the content of signaling molecules in the tears and AH can be convenient for monitoring pro-inflammatory signals and mechanisms of inflammatory response. In support of this assumption, changes in pro- and anti-inflammatory cytokine levels were found in patients with different variants of DES, diabetic retinopathy, age-related macular dystrophy, and (most pronounced) in uveitis. In addition to cytokines, inflammation of the eye tissues is characterized by an increased production of signal lipids — eicosanoids and other oxylipins, which upon release activate the growth and increase the permeability of blood vessels and also stimulate the infiltration of eye tissue by immune cells. Most of these compounds are formed via enzymatic transformation of polyunsaturated fatty acids, involving the three main enzymatic pathways - cyclooxygenase, lipoxygenase and epoxygenase. By determining the patterns of inflammatory lipids secreted in tears or AH, specific enzymatic mechanisms of inflammation can be detected in each particular scenario. Moreover, using the obtained information, it is possible to select highly specific anti-inflammatory drugs, selectively targeting enzymes responsible for the metabolism of signal lipids/ Those include non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), which act as inhibitors of the cyclooxygenase pathway and have recently been increasingly employed in ophthalmology. Some signal lipids (for example, resolvins) can by themselves stimulate the resolution of inflammation when applied therapeutically. Thus, by studying the inflammatory lipidome of tears and AH, it is possible to identify alterations in the concentration of certain metabolites, and, based on the obtained data, to predict which metabolites/metabolic enzymes would have the most pronounced effect on secondary (associated with iatrogenic diseases) or primary (uveitis) inflammation of ocular tissues with and without premedication with PDTP. In view of the above, within the framework of the additional phase of the Project, we announce new objectives, aimed at a detailed investigation of the inflammatory component of iatrogenic diseases of ocular tissues (cornea and retina) and associated inflammation of the choroid (uveitis); the mechanism of the anti-inflammatory action of mitochondrial targeted antioxidant PDTP in ocular tissues; the development and trialing of integrated approaches to treating iatrogenic diseases and uveitis, combining the marked protective action of PTDP and specific activity of the selected anti-inflammatory agents. The solution of these tasks would require the accumulated scientific background produced at the previous stages of the Project. Namely, we plan to use the developed models of three iatrogenic diseases ubiquitous in ophthalmological practice, which have already been developed and characterized at clinical, histological, biochemical and functional levels. These include: PDES associated with prolonged general anesthesia, UV damage to the cornea as a complication of PRK, CP, caused by high doses of light exposure, characteristic of lighting systems employed in ophthalmology. For all three models, using ELISA, as well as tandem mass spectrometry coupled with HPLC, we plan to study the accumulation dynamics of pro- and anti-inflammatory signaling proteins (inflammatory cytokines) and lipids (eicosanoids) in tears and AH, i.e. fully characterize the inflammatory proteome and lipidome. These studies will be performed with and without preventive therapy (premedication) using PDTP. Based on the obtained data, we plan to determine the metabolic pathways of inflammation in the case of all three types of ocular damage, leading to the selection of an anti-inflammatory drug that under these conditions would have the greatest potential efficacy. As a result, we plan to develop an integrated therapy using PDTP and the selected anti-inflammatory drug, and trial its effectiveness towards all three types of ocular damage with regards to preservation of tissue integrity and function. Finally, we plan to develop experimental models of anterior and posterior uveitis as inflammatory complications of iatrogenic diseases/independent iatrogenic diseases. Using the obtained models, we plan to comprehensively (at clinical, histological and functional levels) characterize the development of the pathological process, determine the inflammatory metabolic pathways of, and develop and trial a novel antioxidant (PDTP) or integrated (PDTP plus a specific anti-inflammatory component) therapy to prevent/treat these diseases. In general, the subject of the additional phase of the Project fully corresponds to the scientific priority of P13 (rehabilitation, regenerative and adaptive medicine), solves the tasks of the social aspect (P13-4) and aims at developing measures to prevent iatrogenic organ loss (P13-4-1) and improving rehabilitation methods aimed at restoring the body after iatrogenic effects (A13-4-2). At the same time, the assigned objectives are of high fundamental and medico-social importance, while the anticipated results of the Project have broad prospects for application in clinical practice.
По итогам выполнения работ в рамках дополнительной фазы Проекта (2019-2020 годы) будут представлен набор научных статей (не менее 8-ми) в российских и зарубежных изданиях, индексируемых в базах данных «Сеть науки» (Web of Science) или «Скопус» (Scopus), а также научный отчет, содержащий следующие результаты. С использованием разработанных на предыдущих этапах Проекта экспериментальных моделей будут охарактеризованы молекулярные механизмы развития воспаления как компонента патогенетического процесса трех ятрогенных офтальмологических заболеваний, а именно эрозий роговицы в условиях длительной общей анестезии (периоперационный синдрома сухого глаза, ПССГ), УФ-повреждений роговицы как осложнения ФРК, а также фотоповреждений сетчатки (светоиндуцированная ретинопатия, СР), вызванных высокими дозами светового облучения, характерными для воздействия офтальмологических осветительных систем. Для всех трех моделей на разных фазах патологического процесса будут получены образцы слезной жидкости (ПССГ и УФ-повреждения роговицы) или ВВ (фотоповреждения сетчатки) животных, с помощью которых будут определены паттерны накопления воспалительных сигнальных молекул белковой и липидной природы. В частности, методами иммуноферментного анализа будет определено содержание в указанных биологических жидкостях провоспалительных цитокинов TNF-alpha и IL-6, а также противовоспалительного цитокина IL-10 (в случае ПССГ указанные измерения проведены на предыдущих этапах Проекта). Кроме того, будет разработан метод экстракции и количественной идентификации липидов слезной жидкости и ВВ, включающий тандемную масс-спектрометрию, сопряженную с высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC-MS/MS), с помощью которого будут проанализировано содержание простагландиноы (PG), гидроксиэтокситетраеновых кислот (HETE), лейкотриенов (LT), гидроксиоктадиеновых кислот (HODE), гидроксиэйкозапентаеновых кислот (HEPE), гидроксидокозагексаеновых кислот (HDoHE), дигидроксиэйкозатетраеновых кислот (DiHETE), дигидроксиэйкозатриеновых кислот (DHET), дигидроксиоктадекановых кислотых (DiHOME) и оксо-эйкозатетраеновых кислотых (oxo-ETE). Таким образом, будут всесторонне охарактеризованы изменения воспалительного протеома и липидома, ассоциированные с исследуемыми ятрогенными офтальмологическими заболеваниями. Динамика развития молекулярных признаков воспаления будет соотнесена с клинической картиной развития повреждения и воспаления роговицы (офтальмоскопия с оценкой по шкале Дрейза; флуоресцеиновый тест с оценкой по расширенной флуоресцеиновой шкале) и сетчатки (офтальмоскопия с оценкой признаков воспаления на глазном дне; электроретинографическое исследование). На основе полученных данных будут определены метаболические механизмы развития воспаления в случае всех трех видов воздействия на орган зрения, в частности, предсказаны ферментативные пути (циклооксигеназный, липоксигеназный и эпоксигеназный), запускаемые в каждых из рассматриваемых условий. С помощью разработанного алгоритма будет исследована динамика изменения содержания воспалительных белков и липидов в слезе и ВВ животных, получавших премедикацию ПДТФ, на основании чего будут сделаны выводы о механизме противовоспалительного действия этого митохондриально-адресованного антиоксиданта. С учетом совокупности полученных данных будут определены направления селективной противовоспалительной терапии, необходимой для усиления действия ПДТФ. В частности, будет подобран противовоспалительный препарат, селективно ингибирующий воспалительные процессы в случае каждого из рассматриваемых ятрогенных заболеваний, т.е обладающий наибольшей потенциальной эффективностью. Наконец, на клиническом и функциональном уровне будет определена эффективность комплексной терапии с использованием ПДТФ и отобранного противовоспалительного препарата в рамках всех трех разработанных моделей, т.е. в отношении воспалительного компонента ПССГ, УФ-повреждений роговицы и СР. Кроме того, в рамках Проекта будут созданы экспериментальные модели переднего и заднего увеитов – потенциальных инфекционных и неинфекционных осложнений ятрогненных повреждений роговицы и сетчатки, а также самостоятельных ятрогенных заболеваний. Индукция переднего увеита будет осуществлена путем введения животным эндотоксина – термостабильного компонента наружной части клеточной мембраны грамотрицательных бактерий. В качестве модели заднего увеита будет индуцироваться аутоиммунный хориоретинит путем иммунизации животных фоторецепторным белком рековерином. Для обеих моделей будет полностью охарактеризована клиническая картина воспаления. В частности, помимо общеклинических наблюдений, в случае переднего увеита будут определены функциональные параметры радужной оболочки (по потере зрачкового рефлекса и реакции на введение мидриатиков), а в случае заднего увеита – электрофизиологические параметры сетчатки (изменение параметров ЭРГ: снижение амплитуды и повышению латентности a и b волн). Кроме того, будут получены гистологические препараты заднего сектора глаза животных, с помощью которых будут охарактеризованы патоморфологические изменения в тканях и сосудистой оболочке глаза, ассоциированные с развитием воспалительного процесса. С применением полученных моделей на клиническом и гистологическом уровнях будет определена эффективность премедикации с использованием ПДТФ для терапии увеитов. С использованием разработанного алгоритма исследования воспалительного протеома и липидома будут определены изменения содержания воспалительных цитокинов и оксилипинов (номенклатура соединений будет соответствовать таковой, описанной для моделей ятрогенных офтальмологических заболеваний) в ВВ при переднем и заднем увеитах вне и на фоне премедикации с использованием ПДТФ. На основании полученных данных будут подобран селективный противовоспалительный препарат, применение которого будет усиливать протекторное и противовоспалительное действие ПДТФ. Наконец, с помощью полученных моделей будет на клиническом и функциональном уровнях будет определена эффективность разработанной комплексной терапии для лечения увеитов. Таким образом, по итогам выполнения дополнительных этапов Проекта может быть существенно расширена стратегия профилактики и лечения широко распространенных ятрогенных повреждений тканей глаза, таких как эрозий роговицы в условиях длительной общей анестезии, УФ-повреждения роговицы и фотоповреждения сетчатки, а также передний и задний увеиты, которые могут являться как осложнениями указанных выше патологий, таки самостоятельными заболеваниями. В последние годы, в связи с увеличением количества инвазивных инструментальных методов в офтальмологии, частота встречаемости различных осложнений, в том числе воспалительного природы, существенно возросла, что предполагает важное практическое применение результатов Проекта. В целом, создание методик профилактики и терапии ятрогенных осложнений является необходимой составляющей дальнейшего развития медицинских технологий, позволяющих проводить многочасовые операционные вмешательства. Разрабатываемые в Проекте терапевтические подходы могут способствовать быстрой и безболезненной реабилитации пациентов после таких операций, позволяя достичь полного сохранения зрительной функции, что имеет выраженное социальное значение. Наконец, дополнительным преимуществом планируемых исследований является решение ряда ключевых общенаучных задач. В частности, результаты Проекта помогут расширить понимание молекулярных механизмов воспаления, затрагивающего различные ткани глаза, что может иметь выраженное фундаментальное значение.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2019 г.-31 декабря 2019 г. | ИССЛЕДОВАНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ КОМПОНЕНТЫ ЯТРОГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ РОГОВИЦЫ И СЕТЧАТКИ |
Результаты этапа: В 2019 году в рамках Проекта охарактеризованы воспалительные процессы, ассоциированные с развитием трех ятрогенных заболеваний глаза: синдрома сухого глаза, вызванного пребыванием в условиях общей анестезии (периоперационный синдром сухого глаза (ПССГ), повреждение роговицы), УФ-повреждений роговицы (УПР) и светонидуцированной ретинопатии (СР, повреждение сетчатки). Мониторинг этих процессов осуществлялся не только клинически и гистологичеки, но и с помощью биохимического анализа СЖ и ВВ, в которых, наряду с определением цитокинов и маркеров окислительного стресса, детектировались изменения содержания липидных маркеров воспаления. На первом этапе был проведен сравнительный анализ нормальных (базовых) профилей липидных медиаторов воспаления СЖ и ВВ людей и используемого нами вида экспериментальных животных – кроликов. Дальнейшие исследования проводились по следующей схеме. Создавалась группа животных, особям которой индуцировались повреждения ткани глаза в рамках одной из исследуемых моделей. До индукции и в течение последующих 3-7 дней проводился клинический мониторинг развивающегося повреждения, и выявлялись ассоциированные окислительные и воспалительные изменения в СЖ или ВВ, а именно изменения концентрации общего белка, содержания воспалительных цитокинов, уровня перекисного окисления липидов, общей антиоксидантной активности, активности ферментов антиоксидантной защиты, а также профилей липидных маркеров воспаления. На основе полученных данных делался вывод о механизме воспаления, ассоциированного с ятрогенным заболеванием, и производился выбор наиболее перспективного типа специфического противовоспалительного лечения. Далее животным индуцировались повреждения такни глаза в рамках каждой модели и проводилась премедикация ПДТФ, выбранное противовоспалительное лечение или обе терапии одновременно. Во всех случаях проводился мониторинг клинической картины и изменений биохимических свойств жидкостей глаза (СЖ/ВВ). В результате проведенных исследований были получены следующие результаты. СРАВНЕНИЕ НОРМАЛЬНОГО ЛИПИДОМНОГО СОСТАВА СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ И ВОДЯНИСТОЙ ВЛАГИ КРОЛИКА И ЧЕЛОВЕКА 1. Разработана методика получения фракции сигнальных липидов из СЖ и ВВ человека и кролика, включая PUFA, оксилипины и производные фософолипидов, для количественного масс-спектрометрического (UPLC-MS/MS) анализа. 2. С применением UPLC-MS/MS в СЖ и ВВ человека идентифицировано 23 липида, включая 3 PUFA (AA, DHA и EPA), 18 оксилипинов (производные AA (PGA2-PGJ2, PGE2, LTB4, 20-carboxy-LTB4, TBX3, 12-HETE), LA (13-HpODE/13-HODE/13-KODE, 9-HpODE/9-HODE/ 9-KODE, 9,10-DiHOME/9,10-EpOME, 12,13-DiHOME/12, 13-EpOME) и ALA (9-HOTRE, 13-HOTRE)) и 2 производных фосфолипидов (OEA и Lyso-PAF). Показано сходство профилей выявленных соединений в анализируемых жидкостях глаза. 3. Методом UPLC-MS/MS в СЖ и ВВ колика идентифицировано 24 соединения, включая 3 PUFA (AA, EPA, DHA), 18 оксилипинов (восемь производных АА (PGA2 + PGJ2, PGD2, PGE2, LTB4, TXB2, 5-HETE, 11-HETE, 12-HETE), восемь производных LA (9-HODE/9-KODE, 13-HODE/13-KODE, 9,10-DiHOME/9,10-EpOME, 12,13-DiHOME/12,13-EpOME) и два производных ALA (9-HOTRE и 13-HOTRE)) и 3 производных фосфолипидов (AEA, OEA и lyso-PAF). Показано сходство профилей выявленных соединений в анализируемых жидкостях глаза. 5. Показано, что в целом липидный профиль СЖ и ВВ кролика соответствует таковому у человека (18 общих соединений), однако некоторые соединения (TXB3 у человека и 5-HETE, 11-HETE и TXB2 у кролика), являются уникальными для соответствующих видов. 6. Предсказано существование общих механизмов биосинтеза сигнальных липидов в глазу млекопитающих, что подтверждает применимость кроликов в качестве модельного вида животных для исследования офтальмоогических заболеваний человека. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ КОМПОНЕНТЫ И ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ СВЕТОИНДУЦИРОВАННОЙ РЕТИНОПАТИИ (СР) 1. Показано, что развитие СР и ассоциированного воспаления не имеет клинической симптоматики, однако проявляется в виде снижения амплитуды и увеличения латентности a- и b-волн скотопической ЭРГ, что отражает снижение функциональности фоторецепторов и других нейронов сетчатки. 2. Показано, что развитие СР сопровождается изменениями биохимических свойств ВВ, включая симптомы внутриглазного воспаления (повышение общей концентрации белка и содержания провоспалительного цитокина TNF-α) и окислительного стресса (увеличение концентрации малонового диальдегида, падение общей антиоксидантной активности и снижение концентрации супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы). 3. Методом UPLC-MS/MS в ВВ идентифицировано 17 сигнальных липидов (три PUFA, два производных фосфолипидов и двенадцать оксилипинов) и показано, что при СР происходит увеличение содержания AA и DHA и снижение уровней EPA во время облучения, длительное увеличение концентрации lyso-PAF и простагландинов PGE2, PGD2 и PGF2α, а также кратковременное увеличение концентрации производных LA. С учетом специфики путей биосинтеза выявленных соединений, в качестве перспективной противовоспалительной терапии СР предложена пермедикация антиоксидантом ПДТФ с последующей терапией НПВП непафенаком. 4. Показано, что в результате премедикации ПДТФ и/или терапии непафенаком происходит снижение частоты встречаемости гистологических признаков воспаления в сетчатке, а также предотвращается (ПДТФ, комбинированная терапия) или ингибируется (непафенак) снижение ее активности, связанное с СР. Применение всех вариантов лечения снижает выраженность проявлений окислительного стресса в ВВ, причем наибольший эффект наблюдается в случае комбинированной терапии, что указывает на синергетическое действие ПДТФ и непафенака в отношении механизмов СР. 5. Показано, что применение как непафенака, так и ПДТФ препятствует повышению всех COX-зависимых оксилипинов (простагландины) в ВВ, в то время как накопление производных LA подавляется только в случае применения ПДТФ или комбинированной терапии. Лечение непафенаком специфично препятствует повышению lyso-PAF, а оба варианта терапии вызывают рост EPА. Сделан вывод о выраженном противовоспалительном эффекте разрабатываемой терапии (в особенности, ее комбинированного варианта), которая, с учетом того, что оба препарата разрешены к применению в офтальмологии, может быть рекомендована для лечения воспалительных компонентов СР и других дегенеративных заболеваний сетчатки. 6. На основании полученных данных предсказаны возможные механизмы развития СР-ассоциированного воспаления, которое может запускаться за счет выброса lyso-PAF и/или его предшественника/продукта PAF и увеличения концентрации COX-2 в сетчатке, что, в совокупности, стимулирует повышение АА и простагландинов. Эти изменения сопровождаются активацией TNF-α, а также снижением уровня EPA, обладающей противовоспалительной активностью. Указанным процессам предшествует светоидуцируемый окислительный стресс, который может способствовать воспалению через инициацию АФК-зависимого синтеза провоспалительных оксилипинов 9-HODE/13-HODE. 7. Высказано предположение, что выявленные новые свойства непафенака, такие как подавление синтеза/секреции lyso-PAF и стимуляция выработки/секреции EPA (помимо ингибирования синтеза простагландинов) могут лежать в основе его терапевтического эффекта при интраокулярном воспалении. 8. Высказано предположение, что механизм противовоспалительного действия ПДТФ при СР может быть связан с подавлением АФК-зависимого окисления LA с образованием провоспалительных оксилипинов 9-HODE и 13-HODE, а также опосредованным ингибированием синтез простагландинов. 9. Высказано предположение, что защитные свойства ПДТФ в отношении митохондрий включают ингибирование АФК-зависимого синтеза оксилипинов EpOME/DiHOME, обладающих выраженным токсическим действием в отношении этих органелл. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ КОМПОНЕНТЫ И ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ УФ-ПОВРЕЖДЕНИЯ РОГОВИЦЫ (УПР) 1. Показано, что патологический процесс в роговице, вызванный УФ-светом, сопровождается воспалением и отеком, который сохраняется на 3-4 сутки после облучения и может быть детектирован как повышение гидратации роговицы с помощью инновационного метода ТГц-сканирования. 2. Показано, что развитие УПР сопровождается изменением биохимического состава СЖ, включающим падение концентрации белка, изменение редокс-статуса (снижение концентрации ферментов антиоксидантной защиты и кратковременное повышение общей антиоксидантой активности), а также изменение концентрации маркеров воспаления (повышение TNF-α и снижение IL-10). 3. Показано, что при УПР происходит изменение профиля сигнальных липидов СЖ, включая снижение AA и PGЕ2, значительное увеличение PGD2/15-d-PGJ2, снижение 12-HETE, и существенный рост 5-HETE. 4. Высказано предположение, что регуляция PGD2 и PGE2 в СЖ при УПР происходит на уровне процессирования PGH2 с участием простагландин-D-синтазы и простагландин-Е-синтазы. 5. Высказано предположение, что снижение 12-HETE в СЖ, в целом нехарактерное для интраокулярного воспаления, является специфическим признаком воспалительного процесса, вызванного УФ-излучением. 6. С учетом роста концентрации COX-зависимых оксилипинов в СЖ при УПР, а также ранее показанной высокой эффективности COX-специфической терапии при СР, в качестве препарата для противовоспалительной терапии УПР предложен НПВП непафенак. Однако показано, что он не оказывает существенного эффекта на развитие заболевания (включая изменения состава СЖ) и не дает дополнительных лечебных эффектов на фоне пермедикации ПДТФ. С учетом этого, применение непафенака для терапии УПР признано нецелесообразным. 7. Показано, что применение ПДТФ предотвращает развитие УПР, подавляя изменения в СЖ, характерные для окислительного стресса (компенсационный подъем общей антиоксидантной активности) и воспаления (рост TNF-α и снижение IL-10). 8. Высказано предположение, что поскольку УПР ассоциировано с воспалительными изменениями в передней камере глаза, мониторинг развития этих изменений, а также исследование механизма противовоспалительного действия ПДТФ могут быть осуществлены путем биохимического анализа ВВ. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ПДТФ ПРИ УФ-ПОВРЕЖДЕНИИ РОГОВИЦЫ (УПР): БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДЯНИСТОЙ ВЛАГИ (дополнительные ранее не анонсированные работы) 1. Показано, что УПР сопровождается изменениями содержания воспалительных (повышение концентрации тотального белка и падение концентрации IL-10) и антиоксидантных (снижение общей антиоксидантной активности и активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы) маркеров в ВВ. 2. Методом UPLC-MS/MS в ВВ идентифицировано 22 сигнальных липида, включая три PUFA, два производных фосфолипидов и 18 оксилипинов, и показано, что при УПР происходят выраженные изменения воспалительного характера, включающие значительный рост АА, Lyso-PAF, а также рост провоспалительных производных АА (11-HETE, 15-HETE, LTB4, PGD2, PGE2 и PGI2) и снижение противовоспалительных производных ALA (9-HOTRE, 13-HOTRE). 3. Показано, что премедикация ПДТФ подавляет воспалительные изменения в ВВ, предотвращая повышение общего белка и падение IL-10, повышая активность супероксиддисмутазы, ингибируя рост АА, Lyso-PAF и эйкозаноидов (11-HETE, 15-HETE, LTB4, PGD2, PGE2 и PGI2), а также предотвращая падение оксилипинов 9-HOTRE и 13-HOTRE. Кроме того, в результате премедикации снижается концентрация производных LA (12,13-EpOME/12,13-DiHOME), содержание которых не меняется при УПР. 4. Сделан вывод о том, что противовоспалительная активность ПДТФ при УПР имеет более комплексный характер, чем при СР, поскольку подавляет такие признаки воспаления в ВВ, как повышение общего белка и цитокиновый ответ, а также предотвращает рост не только простагландинов и производных LA, но и провоспалительных медиаторов Lyso-PAF, 11-HETE и 15-HETE. Предполагается, что эффект ПДТФ также связан с предотвращением снижения 9-HOTRE и 13-HOTRE, которые обладают противовоспалительным действием. 5. С использованием модели УПР, подтверждено, что защита митохондрий под действием ПДТФ может быть частично обусловлена подавлением синтеза LA-производных 12,13-EpOME/12,13-DiHOME, обладающих токсическими свойствами в отношении этих органелл. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ КОМПОНЕНТЫ И ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ ПССГ 1. Показано, что выраженные повреждения роговицы при ПССГ происходят на первые сутки после анестезии, и сопровождается падением слезопродукции, однако к 3 суткам наблюдается самопроизвольная регенерация этих симптомов. 2. Установлено, что воспалительный ответ при ПССГ отличается от такового при УПР и СР и включает падение и последующий рост общего белка и снижение IL-10 при отсутствии повышения TNF-α в СЖ. При этом наблюдаются признаки окислительного стресса, включая снижение антиоксидантной активности и активности антиоксидантных ферментов в СЖ. 3. Методом UPLC-MS/MS-анализа в препаратах СЖ животных с ПССГ идентифицировано 17 метаболитов AA, LA и ALA. Показано, что изменения липидомного состава СЖ при ПССГ имеют отложенный характер, а номенклатура липидных маркеров отличается от таковой при УПР и СР. В частности, отсутствуют изменения концентрации COX-производных AA (простагландины), однако происходит существенный рост метаболитов LA (13-HODE и 9-HODE/9-KODE) и ALA, (9-HOTrE и 13-HOTrE), синтезирующиеся под действием LOX и/или неферментативного АФК-зависимого окисления. На основании полученных данных высказано предположение о перспективности применения антиоксиданта (ПДТФ) и селективного ингибитора LOX-5 (Зилеутон) для терапии воспалительной компоненты ПССГ. 4. Создан прототип лекарственной формы на основе Зилеутона для местного применения в виде глазных капель. Полученная форма приготовлена на основе 0,9% (изотонического) растворе натрия хлорида и содержит 0,5% Зилеутона и 50% ДМСО (конъюнктивальные инстилляции 50-70% растворов ДМСО не имеет побочных эффектов). 5. Показано, что премедикация ПДТФ подавляет развитие ПССГ, однако дополнительная терапия Зилеутоном практически не вносит вклад в реэпителиализацию роговицы. В то же время, монотерапия Зилеутоном ускоряет заживление этой ткани и улучшает слезопродукцию у животных с ПССГ. 6. Установлено, что премедикация ПДТФ предотвращает рост общего белка и падение антиоксидантой активности, а также усиливает активность супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, однако не влияет на содержание воспалительных цитокинов в СЖ. Монотерапия Зилеутоном имеет выраженное противовоспалительное действие, поскольку ускоряет восстановление уровня противовоспалительного цитокина IL-10 в СЖ. При этом комбинированная терапия является менее эффективной, чем действие каждого из препаратов в отдельности. 7. Установлено, что терапия Зилеутоном производит специфический эффект на профили LOX-зависимых щксилипинов в СЖ, не влияя на уровень 12-HETE (продукт 12-LOX), но подавляя рост 5-HETE и LTB4 (продукты 5-LOX), а также снижая уровни 9-HOTrE и 13-HOTrE (продукты 5-LOX). Премедикация ПДТФ снижает концентрацию 13-HODE/13KODE и 9-HODE/9-KODE, которые могут образовываться в результате АФК-зависимого окисления. Это наблюдение является косвенным повреждением того, что противовоспалительное действие ПДТФ основано его антиоксидантной активности. Совместная терапия ПДТФ и Зилеутоном не влияет или снижает эффективность действия каждого из препаратов в отдельности. 8. Высказано предположение о целесообразности разработки и испытания глазных капель на основе Зилеутона. Полученная лекарственная форма может быть использована в составе комплексной терапии ПССГ. Поскольку действие Зилеутона несколько ингибирует анитиоксидантную активность ПДТФ, а премедикация последним снижает противовоспалительное действие Зилеутона, проведение комбинированной терапии с использованием обоих указанных препаратов признано нецелесообразным. | ||
2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | СОЗДАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ ПЕРЕДНЕГО И ЗАДНЕГО УВЕИТОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИМЕНИМОСТИ КОМПЛЕКСНОЙ (МИТОХОНДРИАЛЬНО-АДРЕСОВАННОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ/ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ) ТЕРАПИИ ДЛЯ ИХ ЛЕЧЕНИЯ |
Результаты этапа: Ятрогенные повреждения тканей глаза могут возникать как осложнения хирургических процедур в офтальмологии, номенклатура и частота использования которых постоянно растет. Ранее нами были созданы модели трех ятрогенных заболеваний глаза – УФ-повреждений роговицы (УПР), светоиндуцированной ретинопатии (СР) и периоперационного синдрома сухого глаза (ПССГ), с применением которых было обнаружено, что общим проявлением патологического процесса в них является окислительный стресс и локальное воспаление. В случае присоединения инфекции или наличия аутоиммунных/системных факторов процесс может осложняться за счет вовлечения сосудистой оболочки глаза, приводя к развитию увеитов. В связи с этим, основными новыми задачами, решаемыми в проекте в 2019-2020 годах, являлись характеристика воспалительных процессов, ассоциированных с развитием ятрогенных заболеваний глаза, и поиск подходов к их предотвращению с помощью антиоксидантной терапии, а также путем выявления и таргетирования специфических сигнальных путей, регулирующих эти процессы. Для решения поставленных задач были использованы модели ПССГ, УПР и СР, а также были разработаны и внедрены модели переднего (бактериального) и заднего (аутоиммунного) увеитов. Животным индуцировалась каждая из исследуемых патологий и проводился мониторинг повреждения и воспалительного процесса на клиническом и функциональном уровне, с помощью гистологического исследования, а также анализа экспрессии воспалительных белков в тканях и выявления окислительных и воспалительных изменений в слезной жидкости (СЖ) и водянистой влаге (ВВ). Особенностью используемого подхода являлось выявление набора липидных медиаторов воспаления с помощью таргетного липидомного анализа. По результатам всего комплекса исследований определялся специфический механизм воспаления, ассоциированного с каждым из заболеваний (включая пути биосинтеза оксилипинов с участием ферментов COX, LOX или CYP – эффективных мишеней фармакотерапии), выбирался наиболее перспективный вариант таргетной терапии и осуществлялись ее доклинические испытания, в процессе которых уточнялись механизмы, лежащие в основе противовоспалительного действия каждого из ее компонентов (включая антиоксидант ПДТФ (SkQ1)). С учетом того, что конечной целью проекта являлся максимально полный охват и характеристика ятрогенных офтальмологических заболеваний человека, был также проведен ряд ранее не анонсированных экспериментов с использованием образцов тканей и жидкостей глаза, полученных непосредственно от пациентов. Это сравнительный анализ базовых профилей липидных медиаторов воспаления СЖ и ВВ людей и используемого нами вида экспериментальных животных (кроликов), а также определение изменения проетомного состава склеры пациентов, связанные с развитием открытоугольной глаукомы, медикаментозно-индуцированная форма которой является распространенным ятрогенным заболеванием. В результате проведенных исследований были получены следующие основные результаты. 1. Разработана методика выделения фракции сигнальных липидов из СЖ и ВВ человека и кролика, включая PUFA, оксилипины и производные фософолипидов, и их количественного масс-спектрометрического анализа. С применением этой методики в СЖ и ВВ человека идентифицировано 23 сигнальных липида и показано сходство их профилей в этих жидкостях глаза. Аналогичное исследование СЖ и ВВ кролика позволило идентифицировать 24 липида и также продемонстрировать сходство наборов выявленных соединений. С использованием статистического анализа установлено, что в целом паттерн сигнальных липидов СЖ и ВВ кролика соответствует таковому у человека (18 общих соединений). На основании этого предсказано существование общих механизмов биосинтеза этих соединений в глазу исследуемых видов, что подтверждает применимость кроликов для моделирования офтальмологических заболеваний человека. 2. Показано, что при СР снижение электрофизиологической активности фоторецепторов сопровождается воспалительной реакцией, которая не имеет клинической симптоматики, однако характеризуется изменениями биохимических свойств ВВ: повышением концентрации общего белка, TNF-α, и малонового диальдегида, снижением общей антиоксидантной активности и активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, а также ростом AA и DHA, снижением EPA, длительным увеличением lyso-PAF, PGE2, PGD2 и PGF2α, и кратковременным ростом производных LA. Механизм воспаления может включать выброс lyso-PAF (стимуляция АА), увеличение экспрессии COX-2 (стимуляция простагландинов), активацию TNF-α и снижение EPA, чему предшествует окислительный стресс и АФК-зависимый синтез 9-HODE/13-HODE. С учетом специфики путей биосинтеза выявленных соединений, предложено использовать антиоксидант ПДТФ (SKQ1) и ингибитор COX непафенак в качестве терапии СР. Показано, что в результате применения этих соединений происходит снижение проявлений воспаления в сетчатке, предотвращается нарушение ее активности, а также уменьшается выраженность изменений в ВВ, причем наибольший эффект наблюдается в случае комбинированной терапии. Как непафенак, так и ПДТФ (SKQ1) препятствуют повышению простагландинов, в то время как производные LA снижаются только под действием ПДТФ (SKQ1). Лечение непафенаком препятствует повышению lyso-PAF, а терапия ПДТФ (SKQ1) вызывает рост EPА. Выявленные новые свойства непафенака и ПДТФ (SKQ1) могут лежать в основе их терапевтических эффектов при СР. Защитный эффект ПДТФ (SKQ1) в отношении митохондрий может включать ингибировании АФК-зависимого синтеза оксилипинов EpOME/DiHOME, обладающих токсическим действием в отношении этих органелл. На основании полученных данных совместное применение ПДТФ (SKQ1) и непафенака рекомендовано в рамках комплексной терапии СР. 3. Показано, что УПР сопровождается воспалением и отеком роговицы, и изменениями биохимического состава СЖ, включающими падение концентрации белка и ферментов антиоксидантной защиты, повышение общей антиоксидантой активности, повышение TNF-α и снижение IL-10, а также снижение AA и PGЕ2, повышение PGD2, снижение 12-HETE, и рост 5-HETE. Высказано предположение, что регуляция PGD2 и PGE2 при УПР происходит на уровне процессинга их предшественника PGH2 простагландинсинтазами. Показана низкая терапевтическая эффективность непафенака при УПР. Напротив, ПДТФ (SKQ1) предотвращает развитие УПР, однако это лишь умеренно отражается на составе СЖ, что делает актуальным биохимический анализа ВВ при этом заболевании. Показано, что в ВВ происходит повышение концентрации белка, снижение IL-10, общей антиоксидантной активности и активности антиоксидантных ферментов, а также рост Lyso-PAF, АА и ее производных (11-HETE, 15-HETE, LTB4, PGD2, PGE2 и PGI2) и снижение производных ALA (9-HOTRE, 13-HOTRE). Большинство их этих изменений ингибируется ПДТФ (SKQ1), который дополнительно снижает уровень производных LA (EpOME/DiHOME). Таким образом, противовоспалительная активность ПДТФ (SKQ1) при УПР предотвращает рост не только простагландинов и производных LA, но и провоспалительных медиаторов Lyso-PAF, 11-HETE и 15-HETE, а также предотвращает снижение 9-HOTRE и 13-HOTRE, обладающих противовоспалительным действием. Подтверждено, что защита митохондрий под действием ПДТФ (SKQ1) может быть обусловлена подавлением им синтеза EpOME/DiHOME. 4. Показано, что развитие повреждений роговицы при ПССГ наблюдается на первые сутки после общей анестезии, и сопровождается падением слезопродукции и биохимическими изменениями в СЖ – снижением общей антиоксидантной активности и активности супероксиддисмутазы, снижением IL-10, длительным повышением АА и ее COX-зависимых (PGD2, PGE2, PGF2α) и LOX-зависимых (LTB4, 5-HETE, 12-HETE) производных, а также кратковременным подъемом LOX-зависимых производных LA (9-HODE/9-KODE и 13-HODE/13-KODE) и ALA (9-HOTrE, 13-HOTrE), CYP-зависмых производных LA (9,10-EpOME и 12,13-EpOME), и производного фосфолипида AEA. С учетом вклада окислительного стресса и воспалительных путей, регулируемых при участии АА и ее производных, высказано предположение, что для терапии ПССГ может использоваться ПДТФ (SkQ1) и зилеутон – селективный ингибитор 5-LOX, который дополнительно подавляет секрецию АА и синтез простагландинов. Создан прототип лекарственной формы (глазных капель) на основе зилеутона в 50% ДМСО и показано, что его применение, не влияя на продукцию СЖ, заметно ускоряет заживление роговицы, что является результатом совместного действия его компонентов. ДМСО дает заживляющие и общие противовоспалительные эффекты, предотвращая рост АА, простагландинов, LOX-зависимых производных LA и ALA, CYP-зависимых производных LA и производного фосфатидилэтаноламина AEA. При этом зилеутон снижает инфильтрацию роговицы, неоваскуляризацию и другие проявления острого воспаления за счет специфических эффектов: стимуляции IL-10, предотвращения снижения активности супероксиддисмутазы, а также подавления LTB4 (продукт 5-LOX) и увеличения содержания DHA (противовоспалительный медиатор). В отличие от этого, действие ПДТФ (SkQ1) может быть связано с улучшением слезопродукции, а противовоспалительный эффект этого соединения – с его антиоксидантной активностью, поскольку терапия усиливает антиоксидантные свойства СЖ и снижает уровень липидных медиаторов, которые могут синтезироваться в результате АФК-зависимого неферментативного окисления. Выявлено отсутствие синергии между премедикацией ПДТФ (SkQ1) и терапией зилеутоном при ПССГ. Монотерапия с использованием зилеутона/50% ДМСО впервые рекомендована для лечения синдрома сухого глаза. 5. Разработана модель переднего (бактериального) увеита. Показано, что инравитреальная инъекция ЛПС вызывает острое экссудативное воспаление, характеризующееся ослаблением зрачкового рефлекса, гиперемией конъюнктивы и радужной оболочки, инфильтрацией передней камеры глаза, цилиарного тела, радужной оболочки, стекловидного тела и сетчатки, отеком цилиарных отростков и радужной оболочки, а также опалесценцией, наличием преципитатов, ростом общего белка и накоплением лейкоцитов в ВВ. Изменения сопровождаются окислительным стрессом, поскольку наблюдается снижение общей антиоксидантной активности ВВ, увеличение экспрессии NO-синтазы в цилиарном теле и увеличение активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в ВВ. Развитие увеита характеризуется ростом воспалительных цитокинов в ВВ и цилиарном теле, значительным повышением содержания АА и ее COX-зависимых (простагландинов и тромбоксанов) и LOX-зависимых (HETE) производных в ВВ, а также ростом воспалительного медиатора lyso-PAF и противовоспалительных медиаторов DHA и EPA в ВВ. Сделан вывод, что регуляция воспалительного ответа осуществляется за счет АА и ее COX-зависимых оксилипинов, что дает основания для применения непафенака и ПДТФ (SkQ1) в качестве терапии увеита. Показано, что непафенак дает выраженный положительный эффект (улучшение зрачкового рефлекса, снижение гиперемии и количества лейкоцитов в ВВ) за счет предотвращения повышения как COX-зависимых (простагландинов и тромбоксана B2), так и LOX-зависимых (HETE) производных АА (последнее может быть вязано с тем, что некоторые HETE синтезируются по СОХ2-зависимому пути). Терапия ПДТФ (SkQ1) также улучшает клиническое состояние глаза, снижает количество лейкоцитов в ВВ и уменьшает инфильтрацию и отек вовлеченных тканей за счет снижения уровня простагландинов и HETE, производя при этом специфические эффекты, такие как повышение EPA. Применение ПДТФ (SkQ1) и непафенака рекомендовано в рамках комплексной терапии переднего (бактериального) увеита. 6. Разработана новая экспериментальная модель заднего (аутоиммунного) увеита. Показано, что через 4 недели после иммунизации рековерином развиваются признаки хронического аутоиммунного хориоретинита, такие как субретинальные кровоизлияния, нарушение активности фоторецепторов, очаговая инфильтрация сетчатки и стекловидного тела, набухание и атрофия фоторецепторов, активация Мюллеровской глии, истончение сетчатки, и формирование узелков Далена-Фукса в хориоидее. Эти изменения коррелируют с накоплением антител против рековерина в крови и сопровождаются изменениями в ВВ, включая снижение антиоксидантной активности и активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, повышение TNF-a и IL-6, повышение COX-зависимых (PGD2 и TXB2) и LOX-зависимых (11-HETE) производных АА, снижение производных LA, а также снижение DHA, EPA, и CYP-зависимых оксилипинов. Полученные данные дают основания для применения ингибитора COX непафенака и антиоксиданта ПДТФ (SkQ1) в качестве потенциальной терапии заболевания. Показано, что оба варианта терапии, не оказывая влияния на образование антител против рековерина, предотвращают нарушение активности фоторецепторов сетчатки и препятствуют развитию хронических воспалительных поражений глаза, что может быть связано с ингибированием окислительного стресса и синтеза провоспалительных цитокинов и COX-зависимых эйкозаноидов. При этом каждый их препаратов дает специфические эффекты, такие как активация противовоспалительных медиаторов EPA (ПДТФ (SkQ1)) и DHA (непафенак), а также ферментов антиоксидантной защиты (непафенак). Применение ПДТФ (SkQ1) и непафенака рекомендовано в рамках комплексной терапии аутоиммунного увеита. 7. На основании полученных данных обобщен механизм, лежащий в основе противовоспалительного действия ПДТФ (SkQ1) в тканях глаза, который в первую очередь включает подавление ключевых провоспалительных оксилипинов простагландинов, а также индукцию мощного противовоспалительного медиатора EPA (все модели). Кроме того, эффект может быть связан с антиоксидантным действием ПДТФ (SkQ1), которое приводит к ингибированию АФК-зависимого неферментативного окисления LA и образования провоспалительных оксилипинов HODE/KODE (СР и ПССГ), а также EpOME/DiHOME, обладающих токсическими свойствами в отношении митохондрий (СР и УПР). 8. С использованием образцов склеры пациентов с первичной открытоугольной глаукомой идентифицировано одиннадцать мажорных белков этой ткани и показано, что содержание шести из них (ALB, THBS4, APCS, ANXA2, ANGPTL7 и VIM) увеличивается по мере развития глаукомного процесса. По результатам биоинформатического анализа выявлены общие свойства этих белков, такие как их связь с изменением ВГД и аномалиями рефракции, а также локализация во внеклеточном пространстве, участие во взаимодействиях с внеклеточным матриксом и способность координировать ионы кальция и участвовать в белок-белковых взаимодействиях. Белки могут быть интегрированы в единую сеть, где выделяются три функциональных кластера, один из которых содержит компоненты системы коллаген/внеклеточный матрикс. С учетом полученных результатов и данных литературы предсказано, что патологические изменения при глаукоме могут включать нарушения структуры внеклеточного матрикса, гликозилирования белков, связывания ими кальция, и регуляции цитоскелета фибробластов склеры, а также окислительные и воспалительные реакции. В целом, результаты двухлетней работы позволили значительно расширить современные представления о механизмах, лежащих в основе воспалительных заболеваний глаза. Более того, впервые предложен алгоритм поиска методов селективного таргетирования этих механизмов, что в перспективе позволит разрабатывать эффективные варианты противовоспалительного лечения самых разнообразных офтальмологических патологий. Важнейшее фундаментальное и прикладное значение имеют разработанные и охарактеризованные модели увеитов, с использованием которых можно тестировать различные варианты терапии этих тяжелых воспалительных заболеваний. Предложены новые эффективные методы таргетирования воспалительного компонента широко распространенных ятрогенных повреждений тканей глаза, купирование которого позволит значительно ускорить регенеративные процессы в этих тканях и улучшить общую эффективность лечения. Наконец, в проекте впервые продемонстрированы молекулярный механизм противовоспалительного действия митохондриально-адресованного атиоксиданта ПДТФ (SkQ1), а также выявлен ряд новых эффектов напефенака и зилеутона, что позволит расширить спектр их применения. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".