Двойные конъюгаты диагностических агентов и противоопухолевых препаратов с лигандами простатического специфического мембранного антигена.НИР

Dual conjugates of diagnostic agents and anticancer drugs with prostate-specific membrane antigen ligands.

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 23 августа 2019 г.-23 августа 2020 г. Двойные конъюгаты диагностических агентов и противоопухолевых препаратов с лигандами простатического специфического мембранного антигена.
Результаты этапа: В рамках проекта проведена разработка синтетических подходов к аффинным и селективным платформам для адресной доставки тераностических агентов к ПСМА рецептору на основе лиганда DCL и полипептидных линкеров. Общая структура синтезируемых соединений приведена на Рисунке 1. Целевые молекулы состоят из двух частей: (1) векторный фрагмент, обеспечивающий направленную доставку конъюгата в клетки рака простаты и (2) полипептидный линкер, обеспечивающий возможность последующего связывания векторного фрагмента с терапевтическим и диагностическим агентами и увеличивающий аффинность к ПСМА рецептору. В работе было проведено варьирование структуры линкера и сравнение методов синтеза целевых молекул с использованием жидкофазной и твердофазной последовательностей. Рис. 1 Общая структура синтезированных соединений. Для возможности последующего получения тераностиков, в рамках данной работы в линкерный фрагмент были введены две функциональные группы разной природы, обеспечивающие возможность последующего постадийного введения в состав молекулы диагностического и терапевтического фрагментов в ортогональных условиях. В качестве таких функциональных групп были выбраны модифицируемые в мягких условиях группы: NH2, позволяющая присоединять необходимый структурный фрагмент реакциями пептидного синтеза, и N3, легко вступающая в азид-алкиновое присоединение (Рис. 1). При синтезе целевых соединений последовательно решались три основные задачи: 1) синтез векторного фрагмента, представляющего собой производное мочевины, модифицированное азидосодержащим фрагментом (Схема 1); 2) получение получение трипептида с использованием жидкофазного или твердофазного (SPPS) методов (пути 1 и 2, Схемы 2, 3); и 3) соединение векторного фрагмента с трипептидным линкером (Схемы 2, 3). Ключевой задачей исследования являлось сравнение эффективности и стереоселективности жидкофазного и твердофазного методов сборки векторов с пептидными линкерами для получения DCL-модифицированных трипептидов 28-30. Реагенты и условия: (a) (1) thriphosgene, DCM, -78oC; (2) H-Lys(Cbz)-O-tBu·HCl, Et3N, 20oC; (b) H2, Pd/C (10%), MeOH; (c) (1) 4-Br-C6H4-CHO or 3-Cl--C6H4-CHO, DCM (2) NaBH4; (d) PyBOP, DIPEA, DMF, N3(CH2)5COOH; (e) THF/H2O, Ph3P, 50oC; (f) (1) Succinic anhydride, DCM, DIPEA; (2) MeOH; (3) HCl (0.1M). Схема 1 Синтез векторных фрагментов Реагенты и условия: (a) (1) HBTU, HOBt, DIPEA, DMF; (2) N3(CH2)3NH2; (b) Et2NH, DMF; (c) FmocOSu, NaHCO3, acetone/H2O; (d) HBTU, HOBt, DIPEA, DMF; (e) Et2NH, DMF; (f) (1) 11; 12; 13, HBTU, HOBt, DIPEA, DMF; (2) 18; (g) DCM/TFA. Все аминокислоты имеют L-конфигурацию. Схема 2 Синтез целевых соединений 28-30 с использованием жидкофазного метода синтеза по пути 1 Реагенты и условия: (a) (1) FmocK(L)(NHBoc), DIPEA, DMF; (2) 4-methylpiperidine/DMF; (b) (1) FmocF(L), HBTU, HOBt, DIPEA; (2) 4-methylpiperidine/DMF; (c) (1) FmocF(L), HBTU, HOBt, DIPEA; (2) 4-methylpiperidine/DMF; (d) (1) 11; 12; 13, HBTU, HOBt, DIPEA, DMF; (2) DCM/TFA; (e) (1) HBTU, HOBt, DIPEA, DMF; (2) N3(CH2)3NH2; (f) DCM/TFA/TIPS/H2O. Обозначение 1/2 относится к различным диастереомерам. Схема 3 Синтез целевых соединений 28-30 с использованием твердофазного метода синтеза по пути 2 1. Получение ПСМА- векторов 11, 12, 13 Начальные стадии синтеза векторного фрагмента включали в себя получение соединений 1-13 (Схема 1) по методикам, аналогичным разработанным нами ранее [1]. Соединения 11, 12, 13 получали присоединением янтарного ангидрида по амино-группам соединений 8, 9, 10 соответственно (Схема 4); образующиеся продукты содержали свободную карбоксильную группу, необходимую для дальнейшего присоединения пептидного фрагмента. Схема 4 Синтез соединений 11, 12, 13 Для облегчения последующей интерпретации ЯМР спектров целевых соединений 28-30 мы провели подробное ЯМР исследование соединений 11-13. Поскольку соединения 12 и 13 имеют в своем составе дизамещенную амидную группу, которая обладает большим барьером вращения вокруг связи С-N, в их ЯМР 1Н и 13С спектрах при комнатной температуре наблюдаются сигналы двух ротамерных форм в соотношении m:n ~ 3:2 (здесь и далее m – мажорный ротамер, n – минорный ротамер) (Рис. 2). В то же время, при повышении температуры взаимное превращение двух ротамерных форм ускоряется, и спектрах ЯМР происходит частичное или полное слияние пиков, соответствующих двум ротамерным формам, что мы наблюдали на примере соединения 12 при Т = 296 и 333 K (Рис. 2а-b). Рис 2. Температурная зависимость ЯМР 13С (b) и 1Н (a)спектров соединения 12. m – мажорный ротамер, n – минорный ротамер. Следует отметить, что температурная зависимость проявляется по-разному для сигналов в различных областях ЯМР 1Н и 13С спектров. Так, можно выделить: «область медленного обмена», в которой при повышении температуры происходит лишь уширение сигналов без изменения их химического сдвига – это наблюдается, например, для пиков атомов фрагментов X9C(n) and X9C(m) и K2C(m) and K2C(n) (рис. 2b), (здесь и далее обозначения структурных фрагментов соответствуют приведенным на Рис. 2), «область промежуточного обмена», в которой сигналы двух ротамеров, смещаются по направлению друг к другу с одновременным уширением – это характерно, например, для пиков протонов фрагментов X3C(n) and X3C(m) (рис. 2b), и «область быстрого обмена», для этих протонов сигналы двух ротамеров при повышении температуры сливаются в один усредненный сигнал – такая картина наблюдается, например, для атомов фрагментов K2C(n) and K2C(m), K2C(n) and K2C(m), X9H(m) and X9H(n) (рис. 2а,b). 2. Сборка пептидной последовательности. В качестве пептидной последовательности для получения высокоспецифичных векторов PSMA мы синтезировали трипептиды (Phe(L)-Phe(L)-Lys(L)-(CH2)3-N3) на основе природных аминокислот L-фенилаланин и L-лизин. 2.1. Сборка трипептидной последовательности (путь 1, жидкофазный метод). По данной синтетической схеме сборку пептидной последовательности осуществляли следующим способом (Схема 5): α-Fmoc,ε-Boc-(L)-Лизин вводили в реакцию пептидного синтеза с аминопропилазидом с получением соединения 14, с которого в дальнейшем удалили Fmoc и в результате получили продукт 15, содержащий свободную амино-группу. Параллельно был синтезирован Fmoc-защищенный дипептид Phe(L)-Phe(L) 16; реакция пептидного синтеза между соединениями 15 и 16 дало продукт 17, удаление Fmoc защиты с которого позволило получить целевое соединение 18 в виде индивидуального стереоизомера. Схема 5 Жидкофазная сборка трипептида 18 2.2. Сборка трипептидной последовательности (путь 2, твердофазный метод). Данный подход заключался в сборке пептидной последовательности с применением SPPS на 2-Хлортритильной смоле (2-CTC) – см. Схему 6. По своей химической сути выбранная последовательность реакций представляет собой классическую схему пептидного синтеза: 1) иммобилизация N-замещенной аминокислоты на твердофазную подложку; 2) снятие защитной группы; 3) модификация NH2-группы аминокислоты (стадии 2 и 3 повторяются необходимое количество раз для сборки необходимой пептидной последовательности); 4) удаление модифицированной аминокислотной последовательности с подложки. [2] Схема 6 Твердофазная сборка трипептида На первом этапе cмола 2-CTC была активирована по описанной методике [3]. На втором этапе была осуществлена иммобилизация аминокислоты на полимерный носитель. На третьем этапе проводили удаление Fmoc защиты с Lys(NHBoc) при помощи 20% раствора 4-метилпиперидина в DMF. В дальнейшем операции повторялись с необходимыми аминокислотами для получения соединения 24. 3. Получение целевых DCL-модифицированных трипептидов 28-30. 3.1. Соединение векторных фрагментов с пептидными последовательностями по пути 1. При осуществлении основанной на жидкофазном синтезе пептидов синтетической последовательности (Схема 2), для соединения трипептида с векторами соединения 11, 12, 13 растворяли в DMF и предактивировали при помощи системы HOBt/HBTU/DIPEA в течение 2 ч, далее прибавили пептид 18 в растворе в DMF, после чего оставили при перемешивании на 24 часа. Продукты реакции присоединения LLLLL-19, LLLLL-20, LLLLL-21 (Схема 7) были выделены колоночной хроматографией и охарактеризованы комплексом физико-химических методов анализа. Все полученные вещества представляли собой индивидуальные стереоизомеры. Схема 7. Получение модифицированных трипептидов LLLLL-19, LLLLL-20, LLLLL-21 по пути 1. 3.2. Соединение векторных фрагментов с пептидными последовательностями по пути 2. При использовании SPPS (Схема 3), векторный фрагмент присоединяли к закрепленному на смоле 2-CTC трипептиду 24 при помощи активирующих агентов HOBt/HBTU/DIPEA. После этого модифицированный трипептид удаляли с полимерной подложки обработкой DCM/TFA (Схема 8). В результате были выделены соединения LLLLL-25, LLLLL-26, LLLLL-27, по данным спектров 1Н NMR, 13С NMR, LCMS, HRMS представляющие собой индивидуальные стереоизомеры. Схема 8. Пептидный синтез и снятие со смолы с получением соединений LLLLL-25, LLLLL-26, LLLLL-27 по пути 2. Осуществляя синтетическую Схему 3, далее по свободной карбоксильной группе соединений 25, 26, 27 необходимо было присоединить 3-аминопропилазид. На основании литературных данных [4], подобные реакции на практике обычно осуществляют одним из трех возможных методов: 1) добавление активирующего агента (карбодиимид, соли фосфония и карбения, и т. д.) и третичного амина, если необходимо, к смеси кислоты и амина; 2) добавление амина к раствору активирующего агента и кислоты. 3) добавление амина к одной из активированных форм кислоты (активированный эфир, ацилазид, ангидриды и т. д.); Рассматривая метод 1, необходимо учитывать, что HBTU способен реагировать с N-концевой аминокомпонентой, что в свою очередь ведет к образованию гуанидиновых производных; этот побочный процесс препятствует созданию пептидной последовательности. [5]. Чтобы избежать этой побочной реакции рекомендуется предварительная активация компонента карбоновой кислоты. При использовании метода 3 следует учитывать, что не существует общего метода для создания активированных аминокислот [4], кроме того, в этом методе необходимо проводить активацию кислоты, а затем выделять активированную форму, что добавляет лишнюю стадию синтеза и, кроме того, может привести к нежелательным реакциям по нецелевым функциональным группам. При рассмотрении метода 2 ожидаемо могут возникнуть следующие трудности. В данной реакции защищенный по амино-группе пептид A активируется по своей карбоксильной группе соответствующим реагентом связывания и превращается в активный аналог B (Схема 9). Если это активное соединение не подвергается быстрому аминолизу целевым NH2-нуклеофилом (из-за медленной кинетики аминолиза, слабой нуклеофильности соединения C, стерическим затруднением NH2 группы, низкой температурой реакции, низкой концентрацией C или его отсутствием в реакционной системе в случае предактивации), оно будет частично превращаться в соответствующий оксазол-5(4H)-он F с сохранением конфигурации по хиральному атому. Хотя промежуточный оксазолон F также обладает реакционной способностью в отношении аминокислоты C для конструирования целевого пептида D, рацемизация его производного происходит с гораздо более высокой скоростью по сравнению с аминолизом посредством соединения C. -Протон в оксазолоне F в этом процессе отщепляется основанием с получением аниона G (и его резонансных форм H и I). Рацемизация происходит, когда оксазолоновый анион G подвергается протонированию с образованием рацемической смеси J, которая может быть подвергнута дополнительному аминолизу производным аминокислоты C с образованием пептидных диастереомеров K. [6] Следует отметить, что данный механизм не возможен, когда в качестве С компонента выступают N-алкоксикарбониламинокислоты (одиночные аминокислоты, защищенные по -аминогруппе Fmoc, Boc и др защитами, как Fmoc-Phe(L)-OH) Хотя использование системы HOBt/HBTU в данном случае должно снизить вероятность рацемизации, так как известно, что HOBt обладает свойствами супрессора рацемизации. [4] Схема 9. Механизм рацемизации аминокислотного фрагмента при пептидном синтезе через образование оксазолонa [6]. Учитывая приведенные выше аргументы, мы выбрали для получения соединений LLLLL-19, LLLLL-20, LLLLL-21 метод 2 (Схема 10) с предварительной активацией карбоксильной компоненты соединений LLLLL-25, LLLLL-26, LLLLL-27. Схема 10 Реакция соединений LLLLL-25, LLLLL-26, LLLLL-27 с 3-аминопропилазидом. Однако, для всех трех реакций соединений (LLLLL)-25, (LLLLL)-26, (LLLLL)-27 с 3-аминопропилазидом, метод 2 в данном случае привел к получению смеси диастереомеров LLLLD-19-21 и LLLLL-19-21, отличающихся по данным спектров ЯМР 1Н. Соотношение диастереомеров в полученных смесях составляло от 2/3 до 1/1. Совокупность полученных данных говорит о протекании рацемизации хирального атома, вероятно, при фрагменте K7 пептидной последовательности, предположительно, через описанный выше механизм образования оксазалона и его последующего депротонирования. Для подтверждения протекания рацемизации по фрагменту K7 мы проверили синтез соединения LLLLL-37 (Схема 11), которое имеет в своем составе дополнительный по сравнению с соединением 30 аминокислотный фрагмент в составе тетрапептида NH2-FFK(NHBoc)G, и не способно к рацемизации при пептидном синтезе по методу 2 с 3-аминопропилазидом через образование оксазолона, так как при сочетании в качестве С-концевой аминокислоты выступает ахиральный глицин. В результате было получено соединение 37 в виде индивидуального стереоизомера, что подтверждается данными 1H NMR и LCMS. Реагенты и условия: (a) (1) FmocG(L), DIPEA, DMF; (2) 4-methylpiperidine/DMF; (b) (1) FmocK(L)(NHBoc), HBTU, HOBt, DIPEA; (2) 4-methylpiperidine/DMF; (c) (1) FmocF(L), HBTU, HOBt, DIPEA; (2) 4-methylpiperidine/DMF; (d) (1) FmocF(L), HBTU, HOBt, DIPEA; (2) 4-methylpiperidine/DMF; (e) (1) 13, HBTU, HOBt, DIPEA, DMF; (2) DCM/TFA; (f) (1) HBTU, HOBt, DIPEA, DMF; (2) N3(CH2)3NH2; (g) DCM/TFA/TIPS/H2O. Все аминокислоты имеют L-конфигурацию. Схема 11. Синтез соединения 37 с использованием SPPS метода. Учитывая рацемизацию, протекающую в ходе обсуждаемых реакций, мы сделали вывод о неоптимальности метода 2 (добавление амина к раствору активирующего агента, третичного амина и кислоты, Схема 10) для стереоселективного получения индивидуальных стереоизомеров соединений 19, 20, 21. В качестве альтернативного метода их получения мы проверили метод 1 (добавление активирующего агента и третичного амина к смеси кислоты и амина, Схема 12), который был протестирован на примере сочетания соединения LLLLL-27 c 3-аминопропилазидом. Действительно при использовании данного подхода нами был получен индивидуальный изомер LLLLL-21, что подтверждается данными ЯМР спектроскопии. Схема 12 Получение соединения LLLLL-21 при использовании метода 1 добавлением активирующего агента и третичного амина к смеси кислоты и амина. Следует отметить, что хотя метод 2 для соединения трипептидного и 3-аминопропилазидного фрагментов и оказался непригоден для стереоселективного получения индивидуальных стереоизомеров соединений 19-21 при использовании SPPS согласно пути 2 (Схемa 3), он успешно может быть использован для получения соединений LLLLL-19, LLLLL-20, LLLLL-21 при синтезе по пути 1 (Схемы 2, 7) с использованием жидкофазной методики. Это объясняется тем, что в случае жидкофазной сборки участвующая в образовании пептидной связи карбоксильная группа находится в векторном фрагменте и не имеет стереоцентра в -положении; следовательно, возможное образование оксазалона в ходе реакции не приводит к рацемизации. 4. Удаление защитных групп и получение целевых соединений. Заключительной стадией синтеза целевых платформ для получения двойных конъюгатов 28, 29, 30 являлось удаление защитных трет-бутильных групп с карбоксильных фрагментов и Boc-группы с ε-аминокислоты K7 (Схема 13). Снятие защиты проводили двумя методами: обработкой соединений 19-21 смесью TFA/DCM или системой DCM/TFA/TIPS/H2O. В результате получили целевые соединения LLLLL-28, LLLLL-29, LLLLL-30 (при введении в реакцию диастереомерно чистых LLLLL-19, LLLLL-20 LLLLL-21 по way 1) или смеси диастереомеров LLLLD&LLLLL-28, LLLLD&LLLLL-29, LLLLD&LLLLL-30 (в случае, если исходные соединения представляли собой смеси диастереомеров). Полученные пары диастереомеров LLLLD&LLLLL-28, LLLLD&LLLLL-29, LLLLD&LLLLL-30 могут быть разделены с использованием колоночной хроматографии. Таким образом нами были выделены все индивидуальные изомеры LLLLD-28, LLLLL-28, LLLLD-29, LLLLL-29, LLLLD-30, LLLLL-30 и охарактеризованы комплексом физико-химических методов анализа – 1Н NMR, 13C NMR, HRMS, LCMS. Результатом стало полное соотнесение сигналов в спектрах данных соединений. Схема 13. Удаление защитных групп c соединений 19, 20, 21. Помимо этого, с использованием двумерных техник ЯМР (1H-13C gHSOC, 1H-13C gHMBC, 1H-1H NOESY, 1H-1H COSY, 1H-1H (ROESY) было проведено полное соотнесение сигналов в спектрах соединений LLLLD-28, LLLLL-28, LLLLD-29 (Рис. 7, 8). На Рис. 4 и 5 представлено сравнение спектров двух индивидуальных изомеров соединения 28, отличающихся конфигурацией стереоцентра фрагмента K7. Наиболее ярко различия в спектрах проявляются в области амидных протонов NH и -СН-протонов аминокислотных фрагментов, представляющих собой the fingerprint-regions. На Рис. 6 цветом выделен структурный фрагмент целевой молекулы 28 с максимальными различиями, наблюдаемыми в химических сдвигах LLLLD- и LLLLL-диастереомеров в спектрах ЯМР 1H и 13С. Ожидаемо, наибольшие различия сконцентрированы в области трипептидной последовательности, однако примечательным кажется тот факт, что различия в химических сдвигах максимальны для фрагмента F5, сравнительно далеко удаленного от центра, подвергающегося рацемизации. Это может быть связано с конформацией, принимаемой молекулами в растворе. Рис 4. Фрагмент 1Н ЯМР спектра (область NH-протонов) соединений LLLLD-28 и LLLLL-28, отличающихся конфигурацией стереоцентра K7. DMSO-d6, δ м.д., C = 32·10-3 M. Рис 5. Фрагмент 1Н ЯМР спектра (область альфа-протонов) соединений LLLLD-28 и LLLLL-28, отличающихся конфигурацией стереоцентра K7. DMSO-d6, δ м.д., C = 32·10-3 M. Рис 6. Значимые различия в химических сдвигах ядер 1H/13C соединений LLLLD-28, LLLLL-28 в DMSO-d6, δ м.д. (показаны изменения химсдвигов соответствующих атомов изомера LLLLD-28 относительно химических сдвигов изомера LLLLL-28; цветом выделена область максимальных различий). В Таблице 1 суммированы данные, полученные при сравнении различных испробованных методов синтеза векторного пептида 30 Приведено сравнение эффективности методик на основании общего выхода целевых соединений в расчете на исходную аминокислоту, входящую в состав линкера (Fmoc-Lys(L)(NHBoc)), и в расчете на исходный векторный фрагмент лиганда 13. Помимо этого, введен параметр трудоемкости синтеза, учитывающий общее количество синтетических стадий и количество стадий с хроматографическим выделением целевого продукта. Из представленных в Таблице 1 результатов могут быть сделаны следующие выводы. Синтетический путь 1 (жидкофазный, Схема 2) с применением метода 2 для создания пептидной связи между 18 и векторным фрагментом лиганда (11, 12, 13) (Схема 7) характеризуется максимальным выходом по соединению 13, однако минимальным выходом по исходной аминокислоте; помимо этого, общее количество стадий с применением трудоемкого хроматографического выделения также велико. Синтетический путь 2 (твердофазный, Схема 3) с применением метода 2 для создания пептидной связи между 25, 26, 27 и 3-аминопропилазидом (Схема 10), имеет наилучший выход по исходной аминокислоте, хороший выход по соединению 13, а также обладает преимуществом по сравнению с методом 1, заключающимся в менее трудоемком процессе получения целевых платформ, что характерно для всех методов с применением твердофазного синтеза, позволяющих добиться ускорения процесса синтеза веществ за счет упрощения выделения и исключения дополнительной очистки, как промежуточных соединений, так и целевых веществ. Однако использование данной последовательности на стадии присоединения 3-аминопропилазида приводит к эпимеризации и получению смеси диастереомеров 1 (LLLLD) и 2 (LLLLL) (Схема 10), которые возможно разделить, но выход целевого продукта 2 (LLLLL), резко падает, что является неудовлетворительным. Синтетический путь 2 (твердофазный, Схема 3) с применением метода 1 для создания пептидной связи между 27 и 3-аминопропилазидом (Схема 11) представляется оптимальным, так как позволяет получить необходимый индивидуальный LLLLL-изомер целевого соединений с хорошими выходами как по исходной аминокислоте, так и по соединению 13. Таблица 1 Сравнение исследованных подходов к получению платформ для адресной доставки диагностических/тераностических агентов. Путь 1 FFK (Схема 2) Метод 2 при взаимодействии 18 и 13 (добавление амина к раствору активирующего агента, третичного амина и кислоты, Схема 7) Путь 2 FFK (Схема 3) Метод 2 при взаимодействии 27 и 3-аминопропилазида (добавление амина к раствору активирующего агента, третичного амина и кислоты, Схема 10) Путь 2 FFK (Схема 3) Mетод 1 при взаимодействии 27 и 3-аминопропилазида (добавление активирующего агента и третичного амина к смеси кислоты и амина, Схема 12) Путь 2 FFK (Схема 11) Mетод 2 при взаимодействии 35 и 3-аминопропилазида ( добавление амина к раствору активирующего агента, третичного амина и кислоты, Схема 11) Выход по исходной аминокислоте Fmoc-Lys(L)(NHBoc), входящей в состав линкера 24.58% Общий 56.02% (1-24.09%; 2-31.93%) 44.81% 40.05% Выход по вектору 13 55.44% Общий 46.74% (1-20.01%; 2-26.64%) 37.39% 34.05% Общее количество стадий синтеза (в том числе с хроматографическим разделением) 13 (10) 16 (7) 16 (7) 18(7) 5. In vitro исследование аффинности соединений лигандов ПСМА Было исследовано взаимодействие полученных соединений 28-30, 37 с ПСМА-рецептором на клеточной линии LNCap (PSMA+). Изучалось ингибирование реакции расщепления ацетил-аспартил-глутамата. Из полученных данных можно сделать вывод о том, что конфигурация стереоцентра при аминокислотном остатке K7 не влияет на параметр аффинности к ПСМА-рецептору. Наиболее аффинным к ПСМА оказалось соединение 37 (LLLLL, X=3-Cl-C6H4-CH2, L-Phe-L-Phe, 0.54±0.1 μM). Таблица 1. IC50 соединений 28-30, 37 Номер соединения X IC50, μM 28(1) - LLLLD H 3.18±0.65 28(2) - LLLLL H 1.63±0.36 29(1) - LLLLD 4-Br-C6H4-CH2- 4.02±0.54 29(2) - LLLLL 4-Br-C6H4-CH2- 2.54±0.55 30(1) - LLLLD 3-Cl-C6H4-CH2- 2.79±0.44 30(2) - LLLLL 3-Cl-C6H4-CH2- 7.66±2.34 37 - LLLLL 3-Cl-C6H4-CH2- 0.54±0.1 Таким образом, в рамках выполнения проекта разработана стратегия стереоселективного синтеза векторных фрагментов на основе DCL для доставки к ПСМА-рецепторам с трипептидным линкером, имеющем в составе амидную и азидную терминальные группировки для последующего присоединения терапевтических и диагностических агентов. Определены условия стереоселективного проведения синтеза; проведено сравнение методик получения целевых молекул с использованием жидкофазной и твердофазной техник сборки полиамидных последовательностей, включающих от 13 до 16 последовательных стадий. Выявлена оптимальная методика стереоселективного синтеза полипептидных молекулярных платформ для адресной доставки тераностических агентов к ПСМА рецептору, заключающаяся в твердофазной сборке пептидной последовательности линкера, соединении полипептида с векторным фрагментом, последующем присоединении 3-аминопропилазида в оптимизированных условиях, и заключительном удалении защитных групп. Все полученные соединения охарактеризованы комплексом физико-химических методов анализа; для трех целевых соединений LLLLD-28, LLLLL-28 и LLLLD-29 проведено полное соотнесения сигналов в ЯМР 1Н и 13С спектров с использованием 2D NMR; на основании этих данных дано полное отнесение сигналов в ЯМР спектрах всех конечных соединений. Проведено биологическое тестирование всех соединений на параметр аффинности (IC50) на клеточной линии LNCap. 6. Список литературы 1) Machulkin A.E., Uspenskaya A.A. BAP et al. Peptide Agent Comprising a Urea Derivative Based PSMA-Binding Ligand, a Method for Preparing the Same, and Use for Producing a Conjugate with a Drug and Diagnostic Agent. RF patent 2697519, 2019. 2) Bollhagen R, Schmiedberger M, Barlos K, Grell E. Chloride Resin. J Chem Soc, Chem Commun 1994;2559. 3) García-Martín F, Bayó-Puxan N, Cruz LJ, Bohling JC, Albericio F. Chlorotrityl Chloride (CTC) Resin as a Reusable Carboxyl Protecting Group. QSAR Comb Sci 2007;26(10):1027–1035, DOI: 10.1002/qsar.200720015. 4) Benoiton NL. Chemistry of Peptide Synthesis. Ottawa: Taylor & Francis Group; 2006. 5) Carpino LA, Imazumi H, El-Faham A, Ferrer FJ, Zhang C, Lee Y, Foxman BM, Henklein P, Hanay C, Mügge C, Wenschuh H, Klose J, Beyermann M, Bienert M. The Uronium/Guanidinium Peptide Coupling Reagents: Finally the True Uronium Salts. Angew Chemie - Int Ed 2002;41(3):441–445, DOI: 10.1002/1521-3773(20020201)41:3<441::AID-ANIE441>3.0.CO;2-N. 6) Al-Warhi TI, Al-Hazimi HMA, El-Faham A. Recent Development in Peptide Coupling Reagents. J Saudi Chem Soc 2012;16(2):97–116, DOI: 10.1016/j.jscs.2010.12.006.
2 23 августа 2020 г.-23 августа 2021 г. Двойные конъюгаты диагностических агентов и противоопухолевых препаратов с лигандами простатического специфического мембранного антигена.
Результаты этапа: В рамках выполнения проекта разработана стратегия стереоселективного синтеза векторных фрагментов на основе DCL для доставки к ПСМА-рецепторам с трипептидным линкером, имеющем в составе амидную и азидную терминальные группировки для последующего присоединения терапевтических и диагностических агентов. Определены условия стереоселективного проведения синтеза; проведено сравнение методик получения целевых молекул с использованием жидкофазной и твердофазной техник сборки полиамидных последовательностей, включающих от 13 до 16 последовательных стадий. Выявлена оптимальная методика стереоселективного синтеза полипептидных молекулярных платформ для адресной доставки тераностических агентов к ПСМА рецептору, заключающаяся в твердофазной сборке пептидной последовательности линкера, соединении полипептида с векторным фрагментом, последующем присоединении 3-аминопропилазида в оптимизированных условиях, и заключительном удалении защитных групп. Посел чего были проведены реакции биоконъюгирования с противоопухолевым препаратом доцетакселом и флуоресцентным красителем Sulfo-Cy5. Основываясь на данных биологических испытаний, можно сделать вывод, что разработанный конъюгат демонстрирует селективность и токсичность в отношении ПСМА-положительных клеток и, следовательно, перспективен для дополнительного более подробного исследования для направленной доставки, по крайней мере, в ПСМА-сверхэкспрессирующие клетки LNCaP. Важно подчеркнуть, что таким образом впервые был создан низкомолекулярный бимодальный ПСМА-направленный тераностический конъюгат с комбинацией флуоресцентной метки и цитостатического агента. Была показана общая возможность создания и селективного действия бимодальных конъюгатов для направленной доставки к ПСМА рецептору; при этом набор вводимых в молекулу функциональных фрагментов принципиально не ограничивается использованной в соединении 33 комбинацией «доцетаксел - SulfoCy5», и он может быть расширен с получением библиотеки бимодальных терапевтических, диагностических и тераностических конъюгатов с различным набором функциональных фрагментов. В ходе синтеза бимодального конъюгата был получен новый органогелатор и продемонстрирована его способность к эффективному гелеобразованию в некоторых органических растворителях. Морфология ксерогелей, полученных из этого гелеобразователя, сильно зависит от полярности гелеобразующего растворителя. Результаты FTIR-спектроскопии и SEM в различных растворителях показали, что межмолекулярные Н-связи являются основной движущей силой для образования супрамолекулярных цепей. Кооперация водородных связей, гидрофобных взаимодействий и ван-дер-ваальсовых взаимодействий является ключевым моментом самосборки. Конкурентное или совместное взаимодействие гелеобразователя-гелеобразователя и растворителя-гелеобразователя может контролировать морфологию однокомпонентных самоорганизующихся органогелевых материалов, которые открывают новые возможности для однокомпонентных низкомолекулярных материалов (LWM).

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".