| 1 |
13 мая 2019 г.-31 декабря 2019 г. |
Возвращение в клетку: выяснение механизма эндоцитоза апоптотической протеазы растений. |
| Результаты этапа: 1. Разработаны несколько подходов к выявлению рецептора фитаспазы (использование бифункциональных сшивающих реагентов; биотинилирование взаимодействующих белков). Обнаружены два белка-кандидата на роль рецептора фитаспазы: белки 120 кДа и 35 кДа.
2. Получены результаты, указывающие на возможность постоянного перемещения (рециклирования) фитаспазы из апопласта внутрь клеток и обратно. Нарушение ре-экспорта фитаспазы приводит к ее накоплению внутри клеток.
3. При действии широкого круга фитогормонов не было выявлено ре-локализации белка фитаспаза-mRFP из апопласта внутрь клетки в отсутствие ПКС-индуцирующих воздействий.
4. На двух модельных системах (индукция окислительного стресса; суперпродукция фитаспазы) показано, что клатрин-зависимый эндоцитоз играет важную роль в осуществлении гибели клеток растений. Интересно также, что для выполнения этой роли клатрин-зависимый эндоцитоз, несмотря на всю сложность этого процесса, должен быть достаточно стрессо-устойчив и продолжать функционировать даже в явно неблагоприятных для клетки условиях.
|
| 2 |
1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. |
Возвращение в клетку: выяснение механизма эндоцитоза апоптотической протеазы растений. |
| Результаты этапа: 1. Усовершенствован подход для идентификации белков, взаимодействующих с фитаспазой, с использованием биотин-лигазы TurboID. Обнаружено несколько дополнительных белков-потенциальных партнеров фитаспазы.
2. Разработаны способы выделения белков-партнеров фитаспазы из растительных экстрактов в количествах, достаточных для масс-спектрометрической идентификации.
3. С использованием масс-спектрометрического анализа идентифицировано несколько белков, взаимодействующих с фитаспазой в клетках растений. Наиболее перспективными из них нам представляются белки TLP8 и SLP. Гены (кДНК) этих белков амплифицированы и клонированы.
4. Для белка TLP8 показана преимущественно цитоплазматическая локализация, при этом часть белка могла быть ассоциирована с плазматической мембраной растительной клетки. В условиях окислительного стресса белок TLP8 менял локализацию, образуя многочисленные точки внутри клетки. В ряде случаев обнаружена ко-локализация импортированной фитаспазы и белка TLP8 в стрессированных клетках растений. Суперпродукция белка TLP8 сама по себе не приводила к значительному усилению интернализации фитаспазы.
5. Белок TLP8 не гидролизуется фитаспазой.
6. Фитаспаза, импортированная в клетку при индукции окислительного стресса, частично ко-локализуется с ранними эндосомами. В стрессированных клетках растений также обнаружено образование необычных внутриклеточных структур (фитосом), содержащих фитаспазу и маркер поздних эндосом белок ARA7. Эти структуры по размеру значительно превышают обычные мультивезикулярные тела (поздние эндосомы).
7. Показано, что окислительный стресс не только не нарушает, но стимулирует клатрин-зависимый эндоцитоз. Это может вносить дополнительный вклад в эффективную интернализацию фитаспазы в стрессированные клетки растений.
|
| 3 |
1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. |
Возвращение в клетку: выяснение механизма эндоцитоза апоптотической протеазы растений. |
| Результаты этапа: Показано, что РНК-интерференция мРНК белка Тюбик методом VIGS не влияет на секрецию фитаспазы и на клатрин-зависимый эндоцитоз в целом, но специфично подавляет интернализацию фитаспазы. Таким образом, найден партнер фитаспазы, участвующий в стресс-индуцированном ретроградном транспорте фермента.
Найден способ осуществить секрецию протеолитически неактивной фитаспазы. Показано, что фитаспаза не использует свою протеолитическую активность для ретроградного транспорта из апопласта в клетку.
Обнаружен новый партнер фитаспазы – белок-шаперон эндоплазматического ретикулума кальретикулин-3. Показано прямое взаимодействие кальретикулина-3 с фитаспазой.
Установлено, что фитаспаза специфично отщепляет короткий С-концевой пептид белка кальретикулин-3, содержащий сигнал возвращения в эндоплазматический ретикулум.
|
