ИСТИНА

Стойкое сохранение за ишемическим инсультом лидирующей позиции среди причин смертности и инвалидизации населения обеспечивает актуальность исследования механизмов гибели клеток в ишемизированной области и поиска новых путей терапии мозговых повреждений. Представленный проект направлен на исследование механизмов повреждения мозга при нарушении функции системы гемостаза, в частности, при тромбировании церебральных сосудов. В ходе исследования планируется выяснить какова роль рецепторов, активируемых протеазами 1 типа (ПАР1) в процессах дегенерации и протекции клеток мозга при фокальной фотоиндуцированной ишемии. Центральное внимание будет уделено выяснению роли нового механизма активации ПАР1 в регуляции повреждения клеток мозга при фотоиндуцированной ишемии у грызунов. В ходе исследования будет установлен характер влияния канонических и неканонических агонистов ПАР1 на выраженность повреждения мозговых функций при фокальной фотоиндуцированной ишемии. Будут выяснены особенности влияния ключевых повреждающих факторов фотоиндуцированной ишемии (депривации кислорода, депривации глюкозы, высоких концентраций тромбина) на разные типы клеток мозга (нейроны и астроциты) крыс и мышей in vitro. Впервые будет проанализировано значение паннексина1 для ПАР1-опосредованной регуляции выживаемости клеток мозга при фокальной фотоиндуцированной ишемии. Полученные в результате выполнения проекта данные будут представлять несомненный интерес как для фундаментальной физиологии, обеспечивая расшифровку механизмов гибели клеток при ишемии и особенности функциональной селективности ПАР1, так и для практической фармакологии и медицины, предоставляя новые возможные мишени для адресной протекторной терапии ишемических повреждений.

The fact that ischemic stroke keeps the persistent leading position among the causes of death and disability within population ensures the relevance of the study of cell death mechanisms in the ischemic zone and the search for the new ways of treating brain damage. The aim of the presented project is to investigate the mechanisms of brain damage in case of violation of the hemostasis system function, in particular, during the thrombosis of cerebral vessels. During the study it is planned to determine the role of protease activated receptor 1 (PAR1) in the processes of degeneration and protection of brain cells during focal photoinduced ischemia. The main attention will be paid for clarifying the role of the new mechanism of PAR1 activation in the regulation of brain cells damage in photoinduced ischemia in rodents. The study will establish the nature of the influence of canonical and non-canonical PAR1 agonists on the severity of brain functions damage during focal photoinduced ischemia. The features of the influence of key damaging factors of photoinduced ischemia (oxygen deprivation, glucose deprivation, high thrombin concentrations) on different types of brain cells (neurons and astrocytes) of rats and mice in vitro will be studied. For the first time we will analyze the role of pannexin1 for PAR1-mediated regulation of brain cell survival in focal photoinduced ischemia. The data obtained as a result of the project will be undoutebly interesting both for fundamental physiology, providing the mechanisms of cell death during ischemia and features of functional PAR1 selectivity , as well as for practical pharmacology and medicine, providing new possible targets for protective therapy of brain damage.

В ходе выполнения проекта будут получены новые данные о механизме гибели клеток при ишемическом повреждении мозга в результате тромбоза. Будет впервые выявлена функциональная селективность («biased agonism») активации ПАР1 и изучены особенности влияния канонических и неканонических агонистов данного рецептора на развитие поражения мозговой ткани, выраженность воспалительной реакции мозга и нарушение неврологического статуса животных в результате фокальной фотоиндуцированной ишемии. На основании комплексного анализа повреждающего действия отдельных факторов фотоиндуцированной ишемии будет выявлен ключевой, приводящий к выраженному характерному для фототромбоза повреждению нервных клеток. Будет проведён анализ ответа основных типов нервных клеток (астроцитов и нейронов) на изолированное действие ишемических факторов. В результате будет оценен уровень реактивности и чувствительности астроцитов и нейронов в ответ на исследуемые факторы ишемии. В ходе проведённых исследований будет охарактеризован один из аспектов механизма протекторного/дегенеративного действия агонистов ПАР1. С использованием специфических ингибиторного и нокаутных животных будет определена роль паннексина 1 в реализации функций агонистов ПАР1 при ишемии. Таким образом, результаты, полученные в ходе выполнения проекта, пополнят научное представление об особенностях ишемического повреждения мозга при тромбировании церебральных сосудов и о механизмах вовлечения рецепторов, активируемых протеазами в модулирование данной патологии ЦНС. Обнаруженные новые данные о смещённом механизме активации ПАР1 при ишемии выявят новые мишени для постинсультной фармтерапии и обеспечат новое направление поиска протекторных препаратов пептидной природы.

Ранее проведённые нами исследования свидетельствуют о вовлечении рецепторов ПАР в регуляцию выживаемости нейронов в условиях глутаматной эксайтотоксичности. Так нами показано, что: 1. В культивируемых гиппокампальных нейронах мозга крысы экспрессируется EPCR (эндотелиальный рецептор протеина С) и все четыре подтипа рецепторов, активируемых протеиназой (ПАР) – ПАР1, ПАР2, ПАР3 и ПАР4. Действие глутамата (100 мкМ, в течение четырех часов) приводит к повышению уровней экспрессии мРНК ПАР1 и ПАР 4 и снижению уровня экспрессии EPCR. Прединкубация с АПС (1нМ) и тромбином (10 нМ) приводит к восстановлению уровеня экспрессии мРНК ПАР 1, ПАР 4 и EPCR, нарушенной при глутаматной эксайтотоксичности. 2. АПС уменьшает размер инфаркта в модели окклюзии средней мозговой артерии крыс, снижая гибель нейронов и увеличивая количество глиальных клеток. 3. Пептиды-аналоги привязанного лиганда ПАР 1, освобождаемого АПС (пептид-9 (NPNDKYEPF-амид) и пептид-11 (NPNDKYEPFWE)), как и сам АПС, обладают нейропротекторным действием на культивируемые гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности, которое реализуется по пути, независимому от β-аррестина 2. 4. Энтеропептидаза в низких концентрациях (0,1 нМ) обладает нейропротекторным действием в условиях глутаматной токсичности. Действие энтеропептидазы в низких концентрациях реализуется через активацию ПАР 1, а энтеропептидаза в высоких концентрациях вызывает инактивацию этого рецептора. 5. АПС увеличивает выживаемость гиппокампальных нейронов в кокультуре с активированными тучными клетками, полученными в модели острого воспаления. 6. Эндогенные сериновые протеиназы – тромбин, ЭП, АПС и синтетические пептиды-аналоги привязанного лиганда ПАР 1, освобождаемого АПС, служат регуляторами выживаемости нейронов в условиях глутаматной эксайтотоксичности и могут быть использованы для разработки новых препаратов, направленных на коррекцию ишемических повреждений мозга.