![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
В проекте за основу взято предположение, что патологический фенотип, с точки зрения участия в нем митохондрий, возникает как следствие накопления доли неправильно функционирующих митохондрий в общей популяции клеточных митохондрий. Функциональным критерием, по которому можно судить о нарушении митохондриальных функций, является величина трансмембранного потенциала на внутренней митохондриальной мембране. Исходя из этого предстоит определить, во-первых, причины, по которым для митохондрий является очень важным поддержание гомеостаза мембранного потенциала, во-вторых, связать гетерогенность митохондриальной популяции по значению трансмембранного потенциала с возникновением патологий, прежде всего, ассоциированных с окислительным стрессом, и, в-третьих, найти пути нормализации митохондриальной деятельности, в основном за счет регуляции процесса утилизации неправильно функционирующих органелл (аутофагии) в норме и при патологии.
The project is based on the assumption that the pathological phenotype, in terms of participation of mitochondria, arises as a result of the accumulation of the share of malfunctioning mitochondria in the general population of cellular mitochondria. The functional criterion by which one can judge on the violation of mitochondrial functions is the value of the transmembrane potential on the internal mitochondrial membrane. Based on this, it is necessary to determine, firstly, the reasons by which for the mitochondria it is very important to maintain the homeostasis of the membrane potential and, secondly, to link the heterogeneity of the mitochondrial population by the value of the transmembrane potential with the emergence of pathologies, primarily associated with oxidative stress, and, thirdly, to find ways to normalize mitochondrial activity, mainly due to the regulation of the process of disposal of malfunctioning organelles (autophagy) in the norm and pathology.
Большинство патологий, рассматриваемых и моделируемых в проекте, имеет самое важное место в структуре смертности по всему миру, а сам процесс старения - усугубление в появлении именно этих патологий, то результаты работы по выяснению механизма возникновения и тяжелого течения этих патологий имеют крайне важное фундаментальное и биомедицинское значение. Специфика этого проекта состоит в уникальном утверждении, что появление неправильно функционирующих компонентов в системе (будь то клетки или органеллы) приводит к неправильной работе всей системы при достижении порогового значения содержания этих функционирующих в неправильном режиме компонентов. Доказательство такого постулата само по себе будет очень значительным прогрессом в фундаментальных биологических науках мирового уровня, а именно это, как предполагается, станет результатом данной работы. При этом возможно, что законы, по которым возникла частная патология, могут носить либо универсальный, либо индивидуальный характер, и доказательство того или иного характера (или обоих одновременно) также будет очень сильным результатом. Еще одним важным результатом будет оценка того, что нарушается в системе (всей митохондриальной популяции), в результате чего не произошло запрограммированное уничтожение неправильно функционирующей органеллы, а именно это, как было выявлено членами коллектива, происходит в митохондриальной популяции при старении. Во-вторых, в результате работы на основе знаний архитектуры сигнальных защитных путей будут указаны «болевые точки» в этой сигнализации, которые стали основой патогенности, и это даст фармакологическим наукам мишень для будущий воздействий с целью лечения через коррекцию в направлении нормы. В третьих, профилактика появления этих неправильно функционирующих органелл, равно как и их уничтожение - есть ни что иное как предложение стратегии борьбы с данной патологией. В четвертых, ограниченная методическая возможность, позволяющая оценить митохондриальную активность лишь по величинам мембранного потенциала, поможет исследовать альтернативные, никем не рассматриваемые роли этого потенциала, что имеет важное фундаментальное значение. В результате ожидается, что работа по проекту будет проведена на самом высоком уровне, соответствующем мировым стандартам.
Наш коллектив имеет большой опыт работы на тканях и культуральных клетках, где максимально важен аспект гетерогенности митохондрий.Открытие фрагментации митохондриального ретикулума (FEBS letters,1983) было подтверждено группой уже в тканях почки после ишемического стресса (Kidney International, 2007). Впоследствии наличие по крайней мере двух популяций митохондрий после повреждающего воздействия было подтверждено методом проточной цитометрии и флуоресцентной корреляционной спектроскопии (Биохимия, 2015, Цитология, 2016). Мы считаем,что в нормальной клетке есть очень узкий интервал, в пределах которого митохондриальная структура и энергетические функции могут меняться без фатальных последствий для клетки (Journal of Gerontology, 2018). Важным подкреплением этой идеологии стало обнаружение группой изменения активности аутофагосомального процесса в условиях патологий, включая старение (Scientific Reports, 2017, 2018, Antioxidants, 2018, Cell Cycle, 2018).Группой разработан целый комплекс разнообразных мер по защите тканей от последствий повреждения. Подходы, примененные в наших работах, (Chemical Communications, 2014, Chem. Biol.Interactions, 2015, Biochim Biophys Acta 2016, Molecules, 2015) будут очень уместными для работы по данному проекту.Значительная часть клеточных экспериментов будет основана на обнаруженном и описанном нами процессе переноса митохондрий между различными типами клеток (Journal of Cell. Mol. Medicine, 2007, Exp Cell Res., 2010, Stem Cells Transl Med. 2015).
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 29 апреля 2019 г.-31 декабря 2019 г. | Нарушение митохондриального соответствия как основа патогенеза |
Результаты этапа: В результате работы в 2019 году было подтверждено, что гетерогенность митохондриальной популяции определяет патологический фенотип клетки. Появление в клетке плохо функционирующих или нефункциональных митохондрий, что является результатом нарушения системы контроля качества митохондрий. Это приводит к тому, что в клетке появляются поврежденные митохондрии, доля которых по мере прогрессии патологии возрастает. Анализируя данные по использованию митохондриально-направленных антиоксидантов при лечении патологий, опосредованных окислительным стрессом, был сделан вывод о необходимости пересмотра принципов, на которых основана мишень в митохондриях для транспорта терапевтических агентов. Учитывая то, что повреждение митохондрий в клетке приводит к ухудшению их биоэнергетических свойств, что прежде всего определяет уменьшение трансмембранного потенциала на внутренней мембране, а митохондриально-направленные антиоксиданты распределяются пропорционально величинам этого потенциала, прежде всего направляясь в митохондрии с высоким потенциалом, поврежденные митохондрии не получают должной дозы антиоксиданта, а нормальные, наоборот, получают избыток антиоксиданта, в котором нет нужды. Это может привести к состоянию так называемого восстановительного стресса, то есть ситуации, в которых уровень необходимых оксидантов оказывается ниже физиологически допустимого уровня. Предлагается в будущем использовать другую стратегию, основанную на том, что мишенью являются уникальные компоненты, имеющиеся только, например, в митохондриях, и которые изменяются при окислительных воздействиях. К таким компонентам можно отнести, в частности, кардиолипин, окисление которого в условиях окислительного стресса приводит к ухудшению биоэнергетических и других функций митохондрий. Другой нежелательный аспект, проявляющийся при использовании митохондриально-направленных антиоксидантов состоит в доказанном различии действия митохондриальных и немитохондриальных активных форм кислорода. Избирательное уничтожение одного источника может резко менять функционирование всей клеточной системы. Это требует развитие стратегии оценки мишеней для активных форм кислорода производимых митохондриями. Признавая эффективность использования митохондриально-направленных антиоксидантов в острых патологиях, было проведено исследование, в котором острое повреждение почек вызывалось септическим шоком, моделируемым введением липополисахарида (ЛПС) из клеточной стенки бактерий. Показано, что введение ЛПС приводит к острой почечной недостаточности, что проявляется в появлении в моче маркеров почечного повреждения: мочевины, креатинина и NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin-2). Одновременно с этим, введение ЛПС приводит к резкому изменению ультраструктуры митохондрий как почечных клеток, так и лейкоцитов и эндотелиальных клеток. При этом во всех указанных клетках наблюдалось повреждение ультраструктуры митохондрий, которое выражалось в набухании межкристного пространства и матрикса органелл. Введение животным митохондриально-направленного антиоксиданта SkQR1 приводило к уменьшению паталогических эффектов: в крови и моче маркеры почечного повреждения падали, а ультраструктура митохондрий упомянутых типов клеток восстанавливалась. Из нашей работы следует, что применение антибиотиков, которые всегда используются в клинике для лечения сепсиса, не позволит устранить все наблюдаемые патологические проявления, так как они опосредованы не только самими бактериями, но и их продуктами. Одной из основных компонент сепсиса является воспаление, как продукт взаимодействия иммунной системы с составными частями бактерий и, возможно, митохондриями, имеющими ряд сходных компонентов. Для терапии септических патологий мы предлагаем использование антиоксидантов, которые защищают митохондрий. Приведение структуры и функций митохондрий к состоянию нормы, которое можно определить термином «митохондриальное соответствие», является одним из основных условий существования здоровой клетки. Важной составной частью патогенеза является превышение уровня активных форм кислорода митохондриального происхождения. Уменьшение их содержания приводит к нормализации функционирования митохондрий, клеток и органа в целом. Ранее доказав, что клеточная популяция митохондрий гетерогенна, мы начали работу по оценке параметров этой гетерогенности. Мы исследовали митохондрии стволовых и дифференцированных клеток. Основным параметром функциональности митохондрий был выбран их трансмембранный потенциала (ТМП). Были проанализированы первичные культуры клеток эпителия почечных канальцев, полученных от трансгенных животных с зеленым флуоресцентным белком GFP, закодированным под промотором нестина. Клетки были окрашены TMRE – флуоресцентным зондом на ТМП и за поведением флуоресценции следили во времени при постоянном освещении, которое, в частности, вызывало фотодинамический эффект, сопровождаемый генерацией активных форм кислорода. При этом во времени в зависимости от устойчивости каждой конкретной митохондрии к повреждающему воздействию в определенный момент времени происходит открытие митохондриальной поры, что приводит к сбросу ТМП и выходу TMRE из митохондрии. Это регистрировалось как резкое падение флуоресценции митохондрии почти до уровня фона в пределах нескольких секунд. Факт открытия поры, а также время, за которое это происходит служит определенной характеристикой устойчивости митохондрии к повреждающему воздействию, вызванному фототоксичностью. Клетки в культуре делились на 2 популяции – одна экспрессировала GFP, а другая - нет. Это позволило в автоматическом режиме приписать каждую митохондрию к нестин положительным или нестин отрицательным клеткам. Было проведено сравнение ряда митохондриальных параметров между двумя субпопуляциями клеток. Было обнаружено, что митохондрии экспрессирующих нестин клеток (gfp положительных) в среднем были больше митохондрий клеток не экспрессирующих нестин (gfp отрицательных). Анализ показывает, что нестин+ клетки более устойчивы к стрессу, а их митохондрии меньше подвержены процессу дробления. Анализ ТМП выявил различия в популяциях нестин+ и нестин- клеток. Популяционный анализ показал, что у нестин- клеток распределение митохондрий по флуоресценции TMRE было одномодальным, тогда как у нестин+ клеток имелось две моды. Первая субпопуляция митохондрий у нестин+ клеток имела среднее значение флуоресценции, аналогичное субпопуляции нестин- клеток, однако было более «узким»: у нестин- клеток в этой субпопуляции присутствовала фракция митохондрий (выраженная как широкое плечо на гистограмме) с большим ТМП (флуоресценцией TMRE). Вторая субпопуляция митохондрий нестин+ клеток выделялась как отдельный широкий пик и имела более высокие значения флуоресценции TMRE. Подобное распределение позволяет говорить о том, что у клеток, экспрессирующих нестин, есть две субпопуляции митохондрий, одна из которых имеет значительно более высокие значения флуоресценции TMRE, что может быть связано с более высокими значениями ТМП данной субпопуляции митохондрий. Есть основания утверждать, что наблюдаемые различия обусловлены именно биологическими причинами, а не являются артефактами трансгенной системы. Динамика поведения флуоресценции TMRE выявила ряд закономерностей. У некоторых митохондрий в популяции происходил упомянутый процесс резкого обвала значений флуоресценции, который мы интерпретируем как индукцию неспецифической проницаемости митохондрий (открытие митохондриальной поры). У нестин- клеток резкое падение флуоресценции (открытие поры) наблюдалось в меньшем числе клеток чем у нестин+. При этом сами характеристики падения (процент падения) не отличались между двумя типами клеток. Это позволяет говорить о том, что мы имеем дело с одним и тем же событием, происходящим с разной вероятностью. У небольшого количества клеток наблюдалось несколько таких событий, что можно объяснить неоднократным открытием и закрытием поры. Эти события (падение и восстановление несколько раз) также чаще происходили у нестин+ клеток. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что митохондрии в стволовых и нестволовых клетках сильно различаются по степени устойчивости к окислительному стрессу. В результате анализа и практической работы мы предлагаем еще одну физиологическую функцию ТМП (кроме известного участия в синтезе АТР и в системе контроля качества митохондрий). Устоявшаяся парадигма сводится к тому, что вся энергопродукция в митохондриях реализуется исключительно за счет запасания протонного градиента на внутренней митохондриальной мембране с последующим прохождением протона через АТРсинтазный комплекс. Однако, АТРсинтаза использует протоны матрикса митохондрий, где рН в районе 8–8,5, то есть концентрация протона в активном центре АТРсинтазы меньше 10-8 М. В то же время концентрация в матриксе ионов К+ больше 10-1 М, то есть превышает концентрацию Н+ более чем в 10 миллионов раз. Такое превышение ставит вопрос о реальности использования транспорта К+ для синтеза АТР в митохондриальной АТРсинтазе, используя мембранный потенциал, создаваемый переносом протона. На протеолипосомах с АТР синтазой можно было не только обнаружить транспорт ионов К+ , но и обеспечить синтез АТР исключительно за счет градиента К+ , причем оба процесса тормозились ингибиторами АТР синтазы. Такой сопряженный процесс в митохондриях можно вызвать добавлением активаторов АТРзависимого К+ канала, что говорит о том, что АТР синтазу можно рассматривать как митохондриальный АТРзависимый К+ канал. Механизм транспорта ионов калия не требует наличия его градиента на внутренней мембране митохондрий, а осуществляется за счет ТМП, генерируемого переносом протонов. Таким образом наряду с существованием протонной энергетики, в митохондриях может присутствовать и калиевая энергетика, которая имеет целый ряд преимуществ, прежде всего связанных с тем, что перенос ионов калия в матрикс митохондрий сопрягается с переносом воды, что вызывает небольшое набухание митохондрий, что в свою очередь вызовет активацию дыхания, то есть в конечном счете приведет к увеличенному синтезу АТР за счет тех же значений свободной энергии. | ||
2 | 1 января 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Нарушение митохондриального соответствия как основа патогенеза |
Результаты этапа: Первой частью работы по проекту в 2020 г было получение и обработка массива данных по гетерогенности структуры и функций митохондрий в первичных клетках эпителия почечных канальцев и мезенхимальных стромальных стволовых клетках на основе устойчивости этих клеток к окислительному стрессу. Тестовым параметром функциональности митохондрий являлись значения мембранного потенциала, оцененные по флуоресценции TMRE. Экспрессия в клетках нестина являлась репортером стволовости клеток, которые коэкспрессировали зеленый флуоресцентный белок GFP. Для анализа изображений была написана программа на языке python, которая выделяла индивидуальные митохондрии на изображении, анализировала форму, размер, а также динамику поведения флуоресценции каждой митохондрии, при этом в одном эксперименте анализировалось несколько сотен тысяч митохондрий. Из всех динамик изменений флуоресценции был выбран режим, наблюдаемый при умеренных режимах генерации фотодинамического ответа, при котором в отдельных митохондриях после резкого падения, соответствующего индукции неспецифической проницаемости, то есть открытию митохондриальной поры, флуоресценция снова восстанавливалась и начинала осциллировать в затухающем режиме, причем частота и характер осцилляций для каждой митохондрии в клетке были полностью индивидуальными, отражая характерную нестабильность мембранного потенциала, которую мы объяснили индивидуальной устойчивостью каждого члена митохондриальной популяции к окислительному стрессу, вызывающему неодинаковое и временное истощение редокс буфера в матриксе митохондрий из-за постоянной генерации активных форм кислорода, вызванной фотодинамическим эффектом. Время, необходимое для первого акта осцилляции, было признано характеризующим чувствительность данной митохондрии к окислительному вызову, и время, необходимое для восстановления исходного состояния проницаемых свойств внутренней мембраны митохондрий, указывало на репарирующую способность митохондрий. Кроме этого, мы предположили, что тем самым мы охарактеризовали не только индивидуальную чувствительность к окислительному стрессу, но и к различным другим вызовам. Часть клеток трансгенных животных экспрессировала нестин, о чем судили по флуоресценции GFP, причем в этих клетках размер митохондрий был вдвое большим, чем в нестволовых клетках. Возможно, это отражает устойчивость стволовых клеток и их митохондрий к стрессу, выраженную в малой эффективности патологической фрагментации митохондрий у стволовых клеток. Анализ флуоресценции TMRE выявил различия в популяциях нестин+ и нестин-клеток. У нестин-клеток распределение митохондрий по флуоресценции TMRE было одномодальным, тогда как у нестин+ клеток имелось две моды. Первая субпопуляция митохондрий у нестин+клеток имела среднее значение флуоресценции, аналогичное субпопуляции нестин-клеток, однако у нестин-клеток было больше митохондрий с высоким мембранным потенциалом. Вторая субпопуляция митохондрий нестин+клеток выделялась в отдельный широкий пик и имела на порядки более высокие значения флуоресценции TMRE. Подобное распределение позволяет говорить о том, что у клеток, экспрессирующих нестин (то есть стволовых клеток), есть две субпопуляции митохондрий, одна из которых имеет значительно более высокие значения мембранного потенциала, свидетельствующие о высокой энергетической емкости системы. Мы считаем, что характер индукции митохондриальной поры, возникающей в результате фотодинамического эффекта, можно однозначно переносить на другие способы индукции поры (например, химическими агентами). И, учитывая уже признанный факт, что неспецифическая проницаемость митохондрий является одним из конечных этапов каскада программируемой гибели клетки через освобождение из митохондрий агентов, приводящих клеточную систему в необратимую фатальную фазу, мы вправе трактовать данные по характеру фотоиндуцированных изменений в митохондрий как параметрический фактор, характеризующий устойчивость к патогенному началу, при этом допуская, что критическим для индукции гибели клетки является процент низкотолерантных митохондрий в популяции. На основании полученных данных, наблюдаемый нами в клетках нестабильный митохондриальный мембранный потенциал является симптомом слабости клеточной системы и ее уязвимости к внешним и внутренним воздействиям. Наблюдаемые изменения происходили не у всех клеток, и в разной мере были выражены у стволовых и нестволовых клеток. Обнаружив особенности стволовых клеток почки, мы стали изучать различные параметры гетерогенности митохондрий у стволовых клеток, выделенных из костного мозга с использованием ряда соединений, влияющих на функцию митохондрий. Мы обнаружили, что ингибирование гликолиза с помощью 2-дезоксиглюкозы вело к увеличению гетерогенности популяции митохондрий по размеру на 12%, но к уменьшению гетерогенности по значению трансмембранного потенциала на 30%. Гетерогенность по обоим параметрам под воздействием циклоспорина А (ингибитора митохондриальной поры) уменьшалась на 20 и 50% для размера и трансмембранного потенциала соответственно. Гетерогенность трансмембранного потенциала под действием нигерицина (ингибитора К+/Н+ обмена) падала на 65% с одновременным ростом самого значения потенциала. Наконец mdivi-1 (ингибитор фрагментации) вызывал резкий рост размеров митохондрий почти в 2 раза, при этом наблюдалось падение гетерогенности митохондрий по размеру, что хорошо согласуется с приписываемым ему ингибированием фрагментации. Трансмембранный потенциал таких митохондрий возрастал, а его гетерогенность уменьшалась на 60%, что требует объяснения и дальнейших исследований данного вопроса. Приблизительно в 10% клеток наблюдалось открытие митохондриальной поры. Также выявляется зависимость открытия поры от степени набухания митохондрий, что хорошо согласуется с классическими представлениями. Лиганд митохондриального бензодиазепинового рецептора РК11195 ведет к более раннему открытию поры, а mdivi1 делает ее более устойчивой к открытию. Применяя стратегию сохранения нормального редокс гомеостаза митохондрий за счет применения т.н. "мягких" разобщителей окислительного фосфорилирования, мы оценивали свойства производного флуоресцентного красителя 7-нитробензо-2-окса-1,3-диазола (NBD), конъюгированного с ТТР+ и линкером из 10 углеродных спейсеров, и, таким образом, принадлежащего к группе митохондриально-направленных соединений. Нами было показано, что данное вещество активно накапливается в митохондриях культивируемых клеток и, будучи введенным животным, подверженным ишемии мозга, значительно уменьшает нейродефицит, вызванный ишемическим повреждением. На следующем этапе мы подвергли критике данные современного популяционного анализа митохондрий в здоровых кардиомиоцитах, сфокусировав свой интерес на митохондриях в области ядер клетки, так как именно в этой части общей митохондриальной популяции особенно выраженно наблюдалось образование аутофагических митохондрий, что являлось свидетельством обновления митохондриального аппарата. В содружестве с группой электронной микроскопии, которая представила убедительные данные о существовании митохондрий в ядрах, мы, применяя прецизионную конфокальную микроскопию, обнаружили в ядерной зоне уникальную флуоресцентную зону, представленную трехмерной сетью флуоресцирующих объектов. Естественным предположением было обнаружение в зоне ядра митохондриальной сети, принизывающей всю толщу ядра, так как флуоресценция принадлежала TMRE, причем эта сеть обнаружена в живых клетках, в то время как электронная микроскопия допускала наличие артефактов, вызванных фиксацией образца. Была поставлена задача доказать, насколько флуоресценция TMRE однозначно относится к митохондриям, и, если эта сеть действительно принадлежит митохондриям, то насколько они функциональны, находясь в ядре. Во-первых, мы отметили, что окрашивание митохондрий клеток зондом, не зависимым от наличия в митохондриях мембранного потенциала, 10-нонилакридиноранжем, было идентичным, как и при окрашивании TMRE, что частично исключало возможность неспецифического взаимодействия с другими, немитохондриальными структур в клетке, например, ретикулумом. Во-вторых, принимая во внимание, что среди внутриклеточных структур только митохондрии обладают мембранным потенциалом, и в случае регистрации в системе осциллирующей флуоресцентной сети, она однозначно может быть отнесена только к митохондриям, мы применили подход, который позволял приписать митохондриям наблюдаемые осциллирующие свойства флуоресцентных зондов. Действительно, в нормальных кардиомиоцитах обнаруженная нами флуоресцентная сеть, вернее ее компоненты, начинали осциллировать при воздействии мягкого фотовозбуждения в затухающем режиме. Мы не только полностью описали характер такого осциллирующего режима, но и осуществили трехмерную реконструкцию при помощи конфокальной микроскопии в режиме frame scan по z-оси этой ядерной митохондриальной сети, при этом в каждом ядре такая сеть была уникальной. Таким образом, было получено доказательство того, что эта сеть представлена митохондриями, обладающими мембранным потенциалом, что говорит об их функциональности. В итоге, кроме популяций субсарколеммальных, межмиофибриллярных и околоядерных митохондрий с характерными свойствами для каждой из них, нам удалось обнаружить еще одну популяцию, представленную митохондриальной сетью, пронизывающую ядра клеток. Без сомнения, эти данные внесут серьезный вклад в понимание взаимодействия ядра и митохондрий через известную ретроградную и антероградную сигнализацию. В следующей части нашей работы мы осуществили анализ изменений в клетке при вариациях функциональных характеристик митохондрий. Для этого мы провели исчерпывающий анализ дыхательной активности, в котором традиционно рассматривается лишь один фактор, а именно потребление кислорода митохондриями, хотя митохондрии продуцируют огромное количество воды и СО2, которые должны освобождаться из матрикса митохондрий. Мы предположили, что основной массив воды выходит из митохондрий в значительной степени через VDAC внешней мембраны, который, как ранее было показано нами, совсем не равномерно распределен по внешней мембране митохондрий, что позволяет допустить неравномерность распределения реактивной силы выхода воды по поверхности митохондрий. При этом генерация воды в митохондриях должна соответствовать уровню энергизации митохондрий – при снижении функциональности митохондрий (снижение мембранного потенциала, вызванное разобщением окислительного фосфорилирования) образование воды возрастает. Мы выдвинули гипотезу, что такой векторный выброс воды из митохондрий может приводить к созданию силы для перемещения митохондрий в клетке, в дополнение к механизмам транспорта митохондрий в клетке, реализуемым через моторные белки. Важным аналитическим результатом было признание роли набухания митохондрий, при этом небольшое увеличение объема было нами признано как регуляторное, способствующее активации митохондриального дыхания, в то время как высокоамплитудное набухание было признано патологическим предвестником гибели клетки. В целом наш анализ признавал, что регулируемая энергизация митохондрий может играть множество неэнергетических ролей, например, в теплопродукции, генерации активных форм кислорода и активности системы ауто(мито)фагии. Еще один аспект, который мы рассмотрели, состоял в прослеживании патологической роли митохондрий, в частности, основанной на системной активации компонентами митохондрий врожденной иммунной системы, например, при травме ткани. Для моделирования травматического повреждения с высвобождением в кровоток митохондриальных DAMPS мы внутрибрюшинно вводили крысам суспензию митохондрий из печени крысы, которая привела к более чем 4-кратному увеличению мтДНК в плазме. Сопутствующее острое почечное повреждение, вызванное почечной ишемией, не слишком зависела от воспаления, вызванного введением митохондрий. Однако, оценка другого критерия тяжести почечного повреждения - выживаемости животных в послеоперационном периоде, являющегося интегральным показателем функционирования всех жизненно важных систем, выявила, что введение митохондрий крысам, подвергнутым и/р почки, в 3 раза увеличивало смертность животных, при этом введение митохондриально-направленного антиоксиданта (SkQR1) нивелировало как вызванную и/р, так и увеличенную фактором воспаления смертность. Это в очередной раз подтвердило высказанный ранее нами тезис о том, что патологический фактор (в данном случае, ОПП или факторы воспаления), в норме не обязательно должен быть первопричиной смертности, а предполагается участие в гибели организма другой, пока еще не идентифицированной системы, собирающей сигналы от органов при обязательном участии митохондрий этой системы. Для реализации внедрения клеточных и митохондриальных технологий, мы разработали биоинженерные подходы, заключающиеся во введении в очаг повреждения ткани (в данном случае, мозга, подверженного травме) инертных синтетических материалов, на структуре которых могли бы иммобилизоваться донорские клетки, или митохондрии. Мы показали, что биоинженерные каркасы поддерживают нейрогенез в области повреждения. Исследуя нейропротекторную активность рекомбинантного аналога спидроина 1 rS1/9 после его введения в поврежденный мозг, мы отметили более высокую скорость пролиферации и увеличение выживаемости стволовых клеток (с нестиновым репортером) в гиппокампе с одновременным увеличением митохондриального мембранного потенциала в клетках гиппокампа, что могло быть вызвано образовавшимися биологически активными продуктами биодеградации rS1/9. Высокая биологическая активность rS1/9 позволяет предположить, что он является отличным материалом для терапевтического использования, направленного на повышение пластичности мозга путем взаимодействия с нишами стволовых клеток. На основании развитой нами концепции, что в основе большинства патологий лежат изменения функционирования митохондрий в клетке, мы смогли обеспечить характеристику технологии и ее уместность в биомедицинском применении при помощи оценки функциональной активности митохондрий, в большой мере, отраженной в значении трансмембранного потенциала митохондрий. | ||
3 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Нарушение митохондриального соответствия как основа патогенеза |
Результаты этапа: В 2021 году работа по проекту в основном была сосредоточена на оценке физиологического значения мембранного потенциала, как одного из самых важных компонентов функционирования митохондрий и клетки. В клетке созданы все условия, чтобы поддерживать митохондриальный потенциал в рамках, допустимых физиологией, и даже в те моменты, когда митохондрия неспособна обеспечить его поддержание за счет работы протонных помп (например, при ишемии), мембранный потенциал искусственно поддерживается за счет обращения АТР-синтазной реакции. Это говорит об исключительной важности мембранного потенциала, и это требует не только признания, но и правильной его оценки, используя самые разные подходы. В работе мы преследовали по крайней мере три задачи. Во-первых, оценить, насколько адекватны современные методы оценки мембранного потенциала при использовании флуоресцентных зондов. Во-вторых, понять, насколько такие оценки могут помочь различить функционирование митохондрий в нормальной и опухолевой клетке, отслеживая процессы, сопряженные с предполагаемым гомеостазом мембранного потенциала и те факторы, которые могут вносить нежелательный вклад в экспериментальную оценку значений мембранного потенциала. В-третьих, рассмотреть, насколько желательной и безопасной является предлагаемая стратегия лечения большого ряда патологий за счет т. н. «мягкого» разобщения окислительного фосфорилирования. Основными методическими подходами оценки значений мембранного потенциала в клетке, его изменений при разных условиях и в разных типах клеток, и сопряженных метаболических процессов, влияющих на интерпретацию полученных данных, в работе были: флуоресцентная микроскопия, включая лазерную конфокальную микроскопию, проточная цитометрия, масс спектральный анализ и аналитическая работа. Учитывая, что основным инструментом для определения мембранного потенциала в клетке являются положительно заряженные флуоресцентные красители, например родамин 123 (Р123), являющийся метиловым эфиром незамещенного родамина, мы предположили, что клеточные и внутримитохондриальные эстеразы могут обеспечить расщепление эфирной связи, приводя к образованию из катиона цвиттериона, в частности из Р123 может образоваться родамин 110 (Р110). Принимая во внимание то, что для клетки этот агент является чужеродными, нами также было предположено, что клетка либо выводит его (как ксенобиотик) наружу, используя неспецифические помпы, либо модифицирует молекулу с участием цитохрома Р450. Отдавая себе отчет в том, что в нормальных и опухолевых клетках эти модификационные процессы могут идти с разной интенсивностью, мы выбрали опухолевые клетки (культуру клеток глиомы С6) и нормальные астроглиальные клетки с целью оценки, насколько возможные процессы модификации зонда могут повлиять на экспериментальные значения флуоресценции красителя, на основании которых судят о значении мембранного потенциала, в качестве объектов исследования. Было обнаружено, что, в то время как после 1 часа воздействия разобщителя в астроцитах почти не остается Р123, в клетках глиомы флуоресценция присутствует на высоком уровне. Одновременно мы отметили повышенную гетерогенность флуоресценции окрашенных Р123 астроцитов по сравнению с клетками глиомы. Эти данные были подтверждены методом проточной цитометрии, показавшей, что популяция астроцитов более неоднородна с точки зрения мембранного потенциала митохондрий, по сравнению с глиомой. Разобщение приводит к резкому увеличению низкопотенциальных митохондрий в астроцитах, оказывая очень малое влияние на флуоресценцию Р123 в глиоме. Это говорит о том, что астроциты при разобщении теряют Р123 значительно быстрее, чем клетки глиомы и их митохондрии. Для оценки возможной модификации Р123 в разных клетках мы анализировали бутанольные экстракты клеток (после 2-часовой инкубации с Р123) и выделенных из них митохондрий методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Было обнаружено, что митохондрии астроцитов вырабатывают значительный уровень Р110, при этом в образцах глиомы присутствовали продукты, отличные от Р123 и Р110, которые полностью отсутствовали в образцах астроцитов. Мы также выявили, что в клетках глиомы после длительного культивирования наблюдается множество флуоресцентных продуктов, отличающихся от Р123 и Р110. С другой стороны, в образцах глиомы почти не было обнаружено Р110, что указывает на то, что модификация может происходить от Р110, образованного из Р123 путем деэстерификации. Все наблюдаемые модификации Р123 исчезали, если инкубация с Р123 проводилась в присутствии амиодарона, который способен как блокировать неспецифическую помпу откачки ксенобиотиков из клетки, так и ингибировать модификации, опосредованные цитохромом Р450. При оценке интенсивности флуоресценции Р123 в двух типах клеток с дальнейшим определением влияния на нее амиодарона в течение разных времен инкубации с использованием метода проточной цитометрии было выяснено, что, в то время как уровни флуоресценции в клетках глиомы, нагруженных Р123, были стабильными, меняясь незначительно при изменении времени инкубации и от присутствия амиодарона, те же условия для астроцитов вызывали значимые изменения общей флуоресценции. Анализ показал значительную гетерогенность флуоресценции в популяции астроцитов, проявляющуюся в более широком распределении интенсивности флуоресценции, в то время как в клетках глиомы гетерогенность была менее выражена. Можно сделать вывод, что значения мембранного потенциала митохондрий в глиоме более однородны, чем в астроцитах. Более того, длительная инкубация нагруженных Р123 астроцитов с амиодароном, привела к появлению популяции клеток с низкой флуоресценцией. Такая же длительная инкубация клеток глиомы без амиодарона также сопровождается присутствием небольшой популяции с низкой интенсивностью флуоресценции. Эти данные позволяют использовать митохондрии в качестве мишени в терапии рака с использованием нацеленных на митохондрии препаратов, включая флуоресцентные красители, такие как Р123. Этот токсический эффект может частично быть вызван феноменом длительного удержания митохондриальных красителей в опухолевых клетках, что мы наблюдали. На следующем этапе мы использовали метод масс-спектрометрии для обнаружения модифицированных форм родаминов, определяемых по их молекулярной массе. Этот анализ показал, что бутанольный экстракт из клеток глиомы, инкубированных в течение 2 часов с Р123, содержит в основном две фракции со временем удержания на колонке 1,39 и 1,43 мин (что соответствует Р110 и Р123) с явным преобладанием Р123 над Р110 в экстракте. Основной пик имел значение массы/заряда (m/z) 345,28, соответствующее смеси Р123 и 110. Кроме того, были разрешены еще два незначительных пика с молекулярными массами 327,44 и 151,94. Присутствие амиодарона в среде привело к тому, что в бутанольном экстракте из клеток глиомы наблюдаются только два пика, соответствующие Р123 (с молекулярной массой 345,53) и амиодарону (с молекулярной массой 646,62). Это указывает на то, что амиодарон предотвращает метаболизм Р123 в клетках глиомы. Аналогичные результаты были получены после инкубации астроглиальных клеток с Р123, причем в отсутствие амиодарона после 2-часовой инкубации клеток с Р123 наблюдались лишь Р123 и Р110, а присутствие амиодарона в среде приводило лишь к тому, что в экстрактах были обнаружены только смесь Р123 с Р110 и амиодарон. Это подтвердило данные ТСХ о том, что астроцитарные клетки не обладают способностью модифицировать молекулу родамина, за исключением способности образовывать Р110 из Р123. Длительная инкубация клеток глиомы, обработанных Р123 привела к образованию 5 компонентов, предположительно производных Р123. Примечательно, что идентифицированные вещества не соответствуют веществам, обнаруженным в экстракте из клеток глиомы, инкубированных с Р123 в течение 2 часов. Это означает, что после 2 часов воздействия происходят дальнейшие модификации веществ, полученных из Р123. Масс-спектрометрический анализ образцов глиомы, обработанной Р110, выявил 3 вещества в образце, отличающихся от исходного Р110. Стоит отметить, что два из трех компонентов (время удерживания ~2,95 мин, преобладающий ион со значением m/z 501; время удерживания ~2,43 мин, преобладающий ион со значением m/z 350) совпадает с компонентами, содержащимися в образцах клеток глиомы после длительной инкубации. Это подтверждает образование модификаций Р123 в глиоме после его деэстерификации и образования Р110. Таким образом, мы полностью получили ответ на поставленные вопросы, насколько соответствуют полученные значения флуоресценции митохондриальных красителей тем значениям мембранного потенциала, которые присутствуют в живой клетке. Конечный вывод по окончанию этой работы сводится к предостережению не допускать простую интерпретацию и калибровку значений мембранного потенциала на основании интенсивности флуоресценции зонда на мембранный потенциал, а оценивать возможность вклада в суммарную флуоресценцию продуктов модификации флуоресцентного красителя. Вторая работа представляла собой анализ еще одной возможности регуляции митохондриальной и клеточной деятельности путем манипуляции со значениями мембранного потенциала митохондрий в сторону некоторого, не очень сильного его уменьшения за счет т. н. «мягкого» разобщения окислительного фосфорилирования. Этому подходу приписывалось максимально важное значение в лечении и профилактике целого ряда патологий, ассоциированных с неправильной или малофункциональной работой митохондрий, включая старение. Проведенный анализ показывает, что осуществить «мягкое» разобщение можно лишь при условии наличия изменений в небольших пределах, и у этой стратегии есть свои плюсы, и минусы. Плюсы мягкого разобщения сводятся к вызванному разобщением уменьшению генерации активных форм кислорода, так как зависимость генерации активных форм кислорода тем выше, чем выше значения мембранного потенциала, причем при относительно высоких значениях мембранного потенциала зависимость генерации начинает носить экспоненциальный характер, и в этом плане гиперполяризованные митохондрии, являясь мощными генераторами активных форм кислорода, могут быть потенциально опасными для клетки. Несомненная польза мягкого разобщения прослеживается при ожирении, когда в целом активируется клеточное дыхание, которое сопряжено с увеличенным потреблением субстратов, в частности жиров. В дополнение к этому, вызванное мягким разобщением активированное дыхание повлечет за собой общее снижение внутриклеточного кислорода, который является окислителем. Кроме этого, снижение мембранного потенциала митохондрий активирует ауто/митофагию, призванную удалять поврежденные и нефункционирующие структуры, при этом активируется митогенез, то есть образуются новые митохондриальные структуры, что говорит об обновлении системы. Активация дыхания приведет к усиленному образованию СО2, который не только значительно увеличивает рН буферных свойств системы, но и обеспечивает сигнализацию широкого действия. Еще одним преимуществом разобщенной системы является повышение в клетке как уровня АДР, так и АМР, который активирует АМР киназу, катализирующую широкий спектр защитных сигнальных каскадов. Одним из самых существенных недостатков мягкого разобщения является возможность возникновения ишемии в результате активации дыхания. Особенно это существенно для мозга, являющегося с одной стороны самым энергопотребляющим органом (на единицу массы), а с другой - быстро (в течение минут) и необратимо теряющим функциональность с последующей деградацией внутримозговых структур. Очень важно, что падение мембранного потенциала митохондрий неминуемо приведет к снижению продукции ими АТР, а это еще больше усилит актуальности проблемы энергоснабжения любого органа. Еще одним минусом является то, что вызванное разобщением уменьшение уровня АТР в клетке вызовет закисление, что инициирует активацию деградационных процессов. Уменьшение уровня активных форм кислорода, которые, как известно, являются важными составными частями насущных сигнальных систем, принимающих обязательное участие в процессах пролиферации, дифференцировки, необходимого устранения ненужных клеток и пр. может быть опасным для клеток за счет перестройки всей внутриклеточной сигнализации. Опасным мягкое разобщение является и для субъектов с нормальной и малой массой тела, приводя к потере клеточных ресурсов. Сопряженным с мягким разобщением повышенный термогенез, также является нежелательным. Подобный нашему анализ никогда не проводился и как вывод, мы рекомендует учитывать все за и против использования мягкого разобщения. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".