ИСТИНА

Целью проекта является полнотранскриптомное профилирование и выявление на уровне экспрессии генов стероидного катаболизма у промышленного штамма Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д. Современное развитие стероидной индустрии связано с широким внедрением биотехнологических процессов, основанных на применении высокопроизводительных микробных штаммов, селективно осуществляющих реакции структурной модификации стероидов. Создание микробных биокатализаторов нового поколения невозможно без понимания особенностей функционирования ферментных систем, вовлеченных в метаболизм стероидов. В этой связи особо актуальным является изучение особенностей функционирования генов катаболизма стероидов у актинобактерий, осуществляющих ключевые реакции трансформации стероидных соединений.

Structural modification of steroid compounds by microorganisms is a base for obtaining highly demanded pharmaceutical compounds. Actinobacterial strain Nocardioides simplex VKM Ac-2033D possesses unique biocatalytical characteristics and is widely used in biotechnology to obtain valuable therapeutic 1-dehydrosteroids. However, molecular basis of steroid metabolism by this strain is unstudied. Earlier, we performed sequencing and assembly of the full circular genome of the strain and conducted a detailed bioinformatical analysis of the genome. Clusters of genes responsible for steroid degradation were determined, including a sterol uptake system, oxidative degradation of aliphatic side chain, opening and degradation of rings A/B and C/D. Previously unknown gene clusters that may participate in steroid metabolism were discovered. The current project aims to reveal genes that change expression under induction by various steroid compounds in the actinobacteria Nocardioides simplex VKM Ac-2033D and to confirm at the level of gene expression functioning of candidate genes discovered earlier. Based on the transcriptomic analysis, genes with highly differential expression will be revealed, distribution of such genes over the genome and their grouping in operons and clusters will be assessed. Sets of genes that change expression under different conditions will be compared. We plan to test, at the level of expression, functionality of clusters of steroid catabolism genes' orthologs, both having and not having binding sites of transcription factors known to regulate this process; to determine candidates for novel transcription factors - regulators of steroid catabolism. At the level of expression, functionality of genes that may be responsible for main biocatalytical activity of the strain will be determined. Results of the study will expand fundamental knowledge about pathways of steroid catabolism in actinobacteria and create base for genetic and metabolic engineering of the industrially valuable strain Nocardioides simplex VKM Ac-2033D.

Впервые будут отсеквенированы транскриптомы актинобактерии рода Nocardioides, выращенной на средах, содержащих и не содержащих холестерол, андрост-4-ен-3,17-дион и литохолевую кислоту. Впервые для бактерий Nocardioides будут получены полные экспрессионные данные по отдельным генам и кластерам генов, которые участвуют в процессе метаболизма этих стероидных соединений. Будут получены экспрессионные доказательства того, что гены данного генома, ортологичные ранее известным участникам стероидного катаболизма, участвуют (или не участвуют) в метаболизме указанных стероидов. Также будут выявлены кандидатные гены в метаболические пути утилизации данных стероидов, ранее неизвестные как участники стероидного катаболизма. Будет выяснено участие транскрипционных репрессоров kstR и kstR2 в регуляции метаболизма стероидов у изучаемого штамма, выявлены гены, регулируемые иными факторами транскрипции, предложены кандидатные гены на другие возможные регуляторы этого процесса, выявлены возможные сайты связывания регуляторов транскрипции у оперонов с повышенной экспрессией.

Коллективом заявителей данного проекта ранее было выполнено секвенирование и сборка полного кольцевого генома штамма N. simplex ВКМ Ас-2033Д и проведён детальный биоинформатический анализ генома. У штамма выявлено несколько кластеров генов, отвечающих за пути деградации стероидов, включая систему поглощения стеринов, окислительную деградацию алифатической боковой цепи, раскрытие и деградацию колец A/B и C/D. Проведён расчёт сайтов связывания известных регуляторов катаболизма стероидов и обнаружены ранее неизвестные кластеры генов, которые могли бы также принимать участие в метаболизме стероидных соединений. Кластеры содержат ортологи генов деградации стероидов: 3-кетостероид-дельта-1-дегидрогеназы, kshAB, 3-кетостероид-9-альфа-гидроксилазы, генов холат-деградирующего пути hsaD3, hsaB3, hsaC3 и ряд других генов. Опероны этих генов не содержат сайтов связывания известных транскрипционных факторов. Коллективы, в которые входят авторы проекта, обладают большим опытом работы в области биохимии, генетики микроорганизмов и молекулярной биологии, используют современный арсенал методов молекулярной биологии, имеют плодотворный опыт совместных исследований и научный задел по заявляемой проблематике проекта.