ИСТИНА

В настоящее время для описания функционирования системы окислительного фосфорилирования (ОКСФОС) удобно использовать модель так называемого «динамического суперкомплекса», согласно которой система ОКСФОС, в зависимости от условий, относительно легко переходит из состояния суперкомплекса в диссоциированную форму и обратно. Ранее, в 1984 году, нами было показано, что слабый осмотический стресс, возникающий в условиях пониженной тоничности среды инкубации митохондрий, стабилизирует, переводит, систему ОКСФОС в режим функционирования суперкомплекса. На основании этого результата нами был сделан вывод о формировании суперкомплекса системы ОКСФОС под действием сигнала осмотического стресса. Недавно основное содержание этой работы, образование полного суперкомплекса в системе ОКСФОС, был подтверждён другими авторами. Целью настоящего исследования является изучение механизма формирования суперкомплекса ОКСФОС в митохондриальной мембране. При этом планируется получить доказательство возникновения в мембране митохондрий глобальной структурной перестройки, которая теоретически должна происходить при формировании крупных белковых комплексов в процессе образования полного суперкомплекса в системе ОКСФОС. Конкретной задачей настоящей работы является обнаружение глобальной структурной перестройки в митохондриальной мембране с использованием метода малоуглового рентгеновского рассеяния на мембранах функционально активных митохондрий. С целью визуализации структурной перестройки в мембранах митохондрий, будет использован метод атомносиловой микроскопии. Таким образом, на основании результатов этих опытов существование теоретически предсказанной глобальной структурной перестройки в митохондриальных мембранах будет доказано экспериментально. На следующем этапе работы планируется изучение особенностей функциональной активности системы транспорта ионов водорода при работе ОКСФОС в режиме работы суперкомплекса. Планируется получить экспериментальные доказательства участия транслокатора нуклеотидов в системе переноса ионов водорода, в которой осуществляется перенос энергии между протонными помпами и АТФ-синтазой. Для выполнения этой задачи в лаборатории разработан специальный метод ингибиторного анализа.

To describe the oxidative phosphorylation system (OxPhos) functioning it is convenient to use the so-called "dynamic supercomplex" model. According to it the OxPhos system under appropriate conditions can easily transforms from the dissociated form to the supercomplex state and back. As early as 1984 in our laboratory was shown that weak osmotic stress (reduced tonicity of the mitochondrial incubation medium) translates OxPhos system to the supercomplex functioning mode and stabilizes it. Recently, the main content of this work, the formation of a complete OxPhos system supercomplex, was confirmed by other authors. The purpose of this work is to study the mechanisms of the supercomplex formation in mitochondrial membrane. It is planned to obtain evidences of the structural rearrangement in the mitochondrial membrane which should theoretically occur accompanying aggregation of large protein complexes during complete supercomplex formation. One of the specific tasks of this work is the detection of structural rearrangement in membranes of functioning mitochondria using small-angle X-ray scattering method. To visualize structural rearrangements in mitochondrial membranes, the method of atomic force microscopy will be used. Thus, based on the results of these experiments, the existence of a theoretically predicted global structural rearrangement in mitochondrial membranes will be proved experimentally. At the next stage of the work, it is planned to study the features of the hydrogen ion transport system during the OxPhos system operation as a supercomplex. It is planned to experimentally clarify the role in the hydrogen ion transport system of adenine nucleotide translocator, which presumably participates in the energy transfer between proton pumps and ATP synthase. To accomplish this task, a special method of inhibitory analysis has been developed in the laboratory.

1. Получение экспериментального доказательства возникновения глобальной структурной перестройки в мембране митохондрий в условиях перехода ОКСФОС в режим работы суперкомплекса. 2. Обнаружение в этих условиях резкого снижения белок-липидных контактов в мембранах митохондрий. 3. Выявление отдельных стадий процесса структурной перестройки в мембранах митохондрий. 4. Решение вопроса возможности прямого участия транслокатора нуклеотидов в системе транспорта ионов водорода в условиях работы ОКСФОС в режиме суперкомплекса.

Методом малоуглового рассеяния нейтронов был обнаружен эффект глобальной перестройки в мембранах митохондрий сердца под действием осмотического стресса в условиях гипоксии. Однако этот метод не позволил провести прямые измерения эффекта частичного отделения белковой фракции от липидной компоненты. В результате этого была разработана программа изучения рентгеновского рассеяния на мембранах митохондрий сердца в аналогичных условиях. В отличие от нейтронов метод рентгеновского рассеяния в аналогичных условиях должен позволить зарегистрировать резкие изменения интенсивности рассеяния, связанннные с образованием крупных белковых комплексов в составе суперкомплексов. 2. Метод визуализации структурной перестройки в мембранах митохондрий с помощью атомносиловой микроскопии в настоящее время относительно полно разработан. При этом получены удовлетворительные изображения складок поверхности мембран митопластов. Эти результаты показывают возможность использования атомносиловой микроскопии для регистрации изменений ультраструктуры мембран митохондрий, происходящих при глобальной перестройке. 3. Ранее было показано, что при работе протонных помп на поверхности мембран митопластов и митохондрий формируется особая фракция протонов, которая имеет характерные особенности. Эта фракция лабильно связанна с поверхностью мембран митопластов и митохондрий, обладает избытком свободной энергии и поэтому может быть легко удалена с поверхности мембраны с помощью катализаторов. Таким образом было установлено, что протонные помпы продуцируют «меченые» протоны, которые можно отслеживать специальным методом, разработанным и многократно проверенным в нашей лаборатории. Настоящая программа позволяет использовать фракцию «меченых» протонов для установления участия транслокатора адениннуклеотидов в системе транспорта ионов водорода между протонной помпой и АТФ-синтазой.

В результате проделанной работы будет получена новая конкретная информация, которая служит доказательством существования полного суперкомплекса ОКСФОС, но, главное, будет получена информация о механизме формирования этого комплекса, в основе которого лежит эффект разрушения и перестройки Белок-липидных контактов. Детальное исследование процессов формирования суперкомплексов в перспективе позволит прогнозировать специфические изменения характера функционирования ОКСФОС при различных, в том числе и патологических, состояниях клетки и организма в целом.