ИСТИНА

Целью исследования является изучение роли цитидиндезаминазы Aid и родственных ей дезаминаз семейства APOBEC в нестабильности генома и мутагенезе опухолевых клеточных линий.

Cytidine deaminases of the AID/APOBEC family are key participants in the processes of induced mutagenesis and RNA editing. They also make a significant contribution to the work of the cellular antiviral systems, since they are capable of creating mutations (C-> U transitions) in single-stranded nucleic acids including viral ones. The increased activity of deaminases is characteristic of the cells of many tumors and is one of the mechanisms of genomic instability. The level of expression of human AID/APOBEC genes was determined in three tumor cell lines of B cell origin, one T cell line, and five tumor lines of epithelial origin. It turned out that the pattern of expression of deaminases is line-specific and very stable. This pattern does not change from activation signals through receptors of innate immunity. Using a green fluorescent protein gene with an introduced stop codon the mutagenic activity of AID deaminase was measured in several cell lines. The activity of AID in thease lines is proportional to the deaminase expression. Bioinformatic analysis was also carried out for codon frequencies in the genomes of viruses.Several codones after deamination transformed to stop codons (nonsense transitions: substitutions C-> U in codons CGA, CAG and CAA in the plus-strand, and substitutions C-> U in anticodone CCA in the negative strand). In the genomes of 83 viruses, the relative frequencies of the codons CGA (one of 6 arginine codons), CAG, CAA (both are glutamine codones) and UGG (tryptophan) were analyzed. For the arginine codon CGA, the percentage of utilization relative to all arginine codons was used, for the glutamine codons CAG + CAA and tryptophan UGG - the proportion of glutamine and tryptophan relative to the total length of the encoded sequences, respectively. It turned out that the strategy of protection against APOBEC deaminases and nonsense transitions caused by them by removing "dangerous" codons is characteristic of many human viruses, and viruses with +RNA genome and viruses with -RNA genome remove "dangerous" codons, depending on which thread (+ or -) are they dangerous. Also, selection against codons prone to nonsense transitions is characteristic of dsDNA viruses with large genomes, such as vaccinia viruses.

Будет проверена гипотеза о неспецифической активации AID вместе с другими белками семейства APOBEC в эпителиальных клеточных линиях в провоспалительных условиях в ответ на активацию клеток микробными PAMP. Будет проведена оценка мутагенного потенциала AID и вызываемой им генетической нестабильности в выбранных опухолевых клеточных линиях. Будет проведено сравнение механизма активации экспрессии AID в опухолевых клетках и нормальных В-лимфоцитах. Будет проверена гипотеза о прекращении экспрессии AID в опухоли в долгосрочной перспективе из-за возникновения мутаций в самом гене AICDA.

В ходе работы получены генетические конструкции для нокаута и сверхэкспресии AID, изучен паттерн экспрессии AID и других дезаминаз APOBEC в девяти клеточных линиях, получена репортерная конструкция, позволяющая детектировать мутации, вносимые дезаминазами в ДНК.

В ходе работы был определен уровень экспрессии генов цитидин-дезаминаз AID/APOBEC человека в трех клеточных линях B-лимфобластного происхождения: IM-9 (CCL-159), Daudi (CCL-213) RPMI 8226 (CCL-155), Т-клеточной линии Jurkat, а также пяти опухолевых линиях эпителиального происхождения HeLa (рак шейки матки), А549 (рак легкого), MCF7, BT-474, MDA-MB-231 (все рак молочной железы). IM-9 по своему происхождению представляют собой клетки множественной миеломы, трансформированные вирусом EBV, Daudi ведут происхождение от лимфомы Бёркита, RPMI являются производными плазмацитомы. В работе с помощью РТ-ПЦР анализировался уровень экспрессии характерной для активированных В-лимфоцитов дезаминазы AID (ключевой фермент в процессах переключения изотипа антител и соматического мутагенеза, кодируется геном Aicda), а также APOBEC1, APOBEC2 и APOBEC3 (восемь паралогов, обозначаются буквами от A до H). Было показано, что в ряду RPMI 8226 – Daudi - IM-9 уровень экспрессии AID при каждом переходе повышается примерно на порядок, в эпителиальных клетках и линии Jurkat экспрессия AID отсутствует. Экспрессия APOBEC1 отсутствует во всех проанализированных клеточных линиях, а экспрессия APOBEC2 и паралогов APOBEC3 варьировала в зависимости от типа клеточной линии. При этом экспрессия дезаминаз в клетках являлась конститутивной и по-видимому ни в одном случае не зависела от сигналов активации через рецепторы врожденного иммунитета - обработка клеток при помощи липополисахарида E.coli, эмульсии полного адъюванта Фрейнда в культуральной среде, тотального лизата кишечной палочки и дрожжевого экстракта не приводила к принципиальным изменениям паттерна экспрессии дезаминаз, линиеспецифические профили экспрессии сохранялись. Таким образом, первая цель проекта была выполнена, хотя гипотеза об активации дезаминазы AID паттернами патогенности в опухолевых клеточных линиях не подтвердилась. Параллельно шла работа по получению генетических конструкций для определения функциональной активности дезаминазы AID, ее сверхэспрессии и ее нокаутирования с помощью технологии Cas9. Эта работа успешно завершена, причем проверка тест-системы для определения функциональной активности дезаминазы AID показала, что функциональная мутагенная активность AID коррелирует с ее уровнем экспрессии. Тест-система представляет собой плазмиду pKatushka2S-C (Евроген) для экспрессии последовательности флуоресцентных белков Katushka и GFP, в которой в рамке считывания GFP находится стоп-кодон, возникший благодаря внесенной с помощью ПЦР замены (A->G для кодирующей нити, T->C для комплементарной). Рамки считывания Katushka и GFP сопряжены при помощи Т2А-пептида, поэтому белок Katushka позволяет выявить клетки, получившие искомую конструкцию. Если в stop-GFP произойдет реверсия (C->U в комплементарной нити), то мы увидим оба флуоресцентных белка, если не произойдет – только красный флуоресцентный белок Katushka. Из четырех плазмид с 4 разными стоп-кодонами (TAG-52, TGA-52, TAG-182, TGA-182) для дальнейшей работы была выбрана TGA-52, показывающая наибольший процент реверсий в клетках IM-9. При этом потенциально реверсия может произойти спонтанно, без участия дезаминазы, однако оказалось, что в ряду линий Jurkat – RPMI 8226 – IM-9 доля ревертировавших Stop-GFP клеток прямо пропорциональна уровню экспрессии AID (рисунок в приложении). Плазмида для сверхэкспрессии AID также была получена на основе pKatushka2S-C, в которую была клонирована кодирующая последовательность Aicda, полученная с кДНК IM-9. На основе плазмиды phU6-gRNA (Addgene) были получены две плазмиды с гидовыми РНК для Cas9, специфичными к гену Aicda. Таким образом, вторая цель проекта также была выполнена. Третья задача - проверка функциональной активности AID при сверхэкспрессии в моделях с детерминированной перестройкой MYC-IGH выполнена пока не была в связи ограничениями на работу в МГУ вследствие распространения COVID-19. Вынужденный перерыв в работе был посвящен биоинформатическому изучению противовирусного действия цитидин-дезаминаз семейства AID/APOBEC. Известно, что мишенями большинства дезаминаз APOBEC обычно являются динуклеотиды CC и TC. Теоретически отбор, направленный на уменьшение частоты таких динуклеотидов в геноме, позволяет вирусу уменьшить эффективность клеточных систем защиты и потенциально выгоден для патогена, однако для некоторых вирусов высокий уровень мутагенеза позволяет менять последовательность антигенных эпитопов и уходить от иммунного ответа. Поэтому с точки зрения последствий активности цитидин-дезаминаз хозяина для размножения патогена вирусы можно разделить на две группы: для первой группы высокий уровень мутагенеза не является проблемой, для второй группы минусы от катализируемых белками APOBEC транзиций C->U (и возникновения большого количества мутаций, в том числе негативных) превышают потенциальную пользу. При этом наиболее радикально и однозначно негативно на размножение вируса влияют нонсенс-транзиции: замены C->U в кодонах CGA, CAG и CAA в плюс-цепи, и замены C->U в антикодоне CCA в минус-цепи (соответствует кодону UGG плюс-цепи). В работе были проанализированы относительные частоты кодонов CGA (один из 6 аргининовых), CAG, CAA (оба кодируют глутамин) и ТGG (кодирует триптофан) в геномах 83 вирусов человека (сгруппированных в соответствии с классификацией Балтимора). Для сравнения использовались частоты тех же кодонов в геноме человека. Для кодона CGA использовался процент использования относительно всех аргининовых кодонов, для кодонов CAG + CAA и ТGG – соответственно доля глутамина и триптофана относительно суммарной длины кодируемых последовательностей. Оказалось, что стратегия защиты от APOBEC дезаминаз и вызываемых ими нонсенс-транзиций за счет удаления «опасных» кодонов характерна для многих вирусов человека. Было показано, что ретровирусы и вирусы с оцДНК имеют достоверно более высокую частоту всех четырех кодонов, способных к нонсенс-транзициям, по сравнению с человеком и другими группами вирусов, что указывает на положительную роль APOBEC хозяина в их жизненном цикле. В то же время дцДНК вирусы в целом не показывают отличий от человека по частотам кодонов, хотя и имеют очень большой размах вариабельности по этим частотам. Как плюс-РНК, так и минус-РНК вирусы показывают уменьшение частоты кодонов с возможными нонсенс-транзициями в плюс-нити (CAA, CAG, CGA) и возможную селекцию геномов против потенциальных мишеней дезаминаз APOBEC. Однако вирусы с плюс-РНК геномом и вирусы с минус- РНК геномом убирают «опасные» кодоны в зависимости от того, для какой из нитей (+ или -) они опасны, но при этом вирусы с плюс-РНК геномом накапливают безопасный для них триптофановый кодон TGG. Если выделять отдельные вирусы, у которых в максимальной степени проявляется избавление от узнаваемых дезаминазами APOBEC кодонов, следует назвать вирусы коровьей оспы и осповакцины (дцДНК), вирусы гепатита Е и гепатита А (+РНК), ортопневмавирус (-РНК) и ротавирусы (дцРНК).