![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Проект направлен на решение фундаментальной научной проблемы в области молекулярной микробиологии: изучения роли белков в формировании молекулярной структуры и поддержании целостности в различных условиях, многокомпонентного и полифункционального компартмента дрожжевой клетки - клеточной стенки. В результате выполнения работы по проекту в рамках указанной фундаментальной проблемы предполагается решение масштабной задачи – изучения роли белков со свойствами амилоидов, локализованных в КС дрожжей в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки в процессе ответа клеток дрожжей на стресс, а также их способность взаимодействовать с клетками высших эукариот (на примере мышей) и участвовать в процессе индукции амилоидоза у организма-хозяина. последнее придает дополнительный масштаб планируемому исследованию поскольку в результате проведенной работы помимо получения фундаментальных знаний, позволяющих глубже понять как устроена и как функционирует КС дрожжей будут получены результаты, которые позволят разрабатывать новые подходы к профилактике и лечению микозов, основанные на ингибировании фибриллообразующей активности амилоидов клеточной поверхности дрожжей, а также к снижению рисков развития заболеваний человека и животных обусловленных развитием амилоидозов в том случае, если они индуцированы амилоидными белками клеточной стенки дрожжей.
Studying of the microorganisms’ cell surface is one of the most actual problems of molecular microbiology. Cell wall (CW) is the outer part of this compartment in yeast. CW is very dynamic: rearrangements in its molecular structure accompany growth of cells, budding, mating, and many other processes. CW plays an important role in the stress response of yeast. At the same time, CW is very stable, the general plan of its structure and functional capacity are supported by cells under various, even extreme conditions. To date, the mechanisms of these processes remain poorly understood. There is no clarity about how the yeast cell wall is structured and how it functions. Numerous data, including ones obtained in our laboratory, indicate that proteins covalently and non-covalently attached to CW are an important structural component that binds polysaccharides and / or polysaccharide blocks of CW into a single molecular ensemble and play a major role in the rearrangements listed above. Recently, in our laboratory (Kalebina et al., 2008) protein with amyloid properties capable of fibrilizing (possibly reversibly) and forming CW strength modules and elements — were found in yeast CW promoting cell adhesion. One of these proteins is the glucan-remodeling enzyme - glucan transferase Bgl2p. The substrate of the protein is the main structural polysaccharide of yeast CW. The list of yeast cell surface glucantransferases with amyloid properties is expanding. Amyloid properties have recently been described for Gas1p. We hypothesized that proteins with amyloids properties are substantially responsible both for stability and for dynamic rearrangements of the molecular ensemble of CWs and play an important role in the response of yeast cells to stress. In the work, mutants lacking CW proteins with amyloid properties will be obtained, as well as mutants in which these proteins are present with deletions and mutations in those parts of the molecules that are important (the site of the active center of enzymes) or according to the results of previous studies, we identified as potentially the most important for the functional activity of these proteins (amyloidogenic sites, sites of significant post-translational modifications). A comparative analysis of protein sets and their post-translational modifications in the CW of these mutant yeast strains and the parent strain will be carried out when they are cultivated under normal growth conditions and under stress (temperature, oxidative stress, other types of stress). The physiological and biochemical (survival, resistance to inhibitors of the formation of the molecular ensemble of CW, ability to grow on various nutrient media, resistance to the effects of lytic enzymes with different substrate specificity) and morphological parameters of the cells and CW of these strains will be also characterized. The obtained results will allow us to characterize the role of these proteins in the formation of the molecular ensemble of CW, as well as in the response of yeast to stress, namely: is their enzymatic activity important without which rearrangements in the glucan framework of CW cannot occur and other proteins, that are important for this response, cannot be fixed or their conformational features, in particular the ability to fibrillate, play a key role. From the medicine point of view, the special significance of yeast CW amyloids can be manifested when these microorganisms come into contact with cells of higher eukaryotes and humans, both during the development of mycoses and in the induction of amyloidoses. For example, it is known that proteins of bacteria cell surface, that are capable of forming amyloid fibrils, are a determining factor in the ability of cells to attach to host cells and possibly provoke amyloidosis. The proposed project is aimed at solving a fundamental scientific problem in the field of molecular microbiology: studying the role of proteins in the formation of molecular structure and maintaining integrity under various conditions, multicomponent and multifunctional yeast cell compartment - cell wall. The key question of the study: what is the role of proteins with amyloid properties of the cell surface of yeast in the formation of a molecular ensemble of the cell wall under normal and stress conditions, as well as in the ability to provoke amyloidization of proteins of higher eukaryotes.
Основным результатом реализации проекта будет проверка высказанной научной идеи и получение ответа на фундаментальные научные вопросы - какова роль белков с амилоидными свойствами в ответе клеток дрожжей на стресс и в преодолении его последствий, а также участвуют ли белки с амилоидными свойствами в индукции амилоидозов у высших эукарит. Прикладная значимость предлагаемого исследования заключается в формулировании предложений по созданию штамма дрожжей, несущего набор мутаций, следствием которого клетки будут в минимальном количестве содержать в составе своей КС белки способные участвовать в индукции амилоидоза у высших эукариот в сочетании с относительной устойчивостью к стрессу и условиям выращивания, весьма желательной при использовании такого штамма в микробиологической и пищевой промышленности. Также будут получены данные по анализу влияния на фибрилизацию изучаемых белков полианионов и поликатионов, а также ионов двухвалентных металлов, хелатирующих соединений, компонентов клеточной стенки и полисахаридов позволит выявить соединения, ингибирующие и активирующие процесс формирования фибрилл. Эксперименты по использованию выявленных соединений и условий, способствующих или препятствующих фибриллизации изучаемых белков, а также изучение воздействия указанных условий и соединений на целые клетки дрожжей, клеточные стенки в различной степени депротеинизованные, а также на модельные системы состоящие из синтетических пептидов (фрагментов изучаемых амилоидов) и\или выделенных амилоидов, позвлолят выявить и охарактеризовать морфологические и функциональные изменения клеток, клеточных стенок и фибриллярных структур, формирующихся в модельных системах. В результате этого будет дополнен основной вывод работы о том каким образом амилоиды участвуют в формировании молекулярного ансамбля КС дрожжей и каков механизм динамичных изменений его структуры, происходящих с участием амилоидов. В предлагаемом проекте помимо получения фундаментальных знаний, позволяющих понять какова роль амилоидов в молекулярной организации КС дрожжей, будут получены результаты, описывающие способность клеток дрожжей, обработанных соединениями, ингибирующими фибриллизацию изучаемых амилоидов, закрепляться на различного рода субстратах, включая клетки культур тканей высших эукариот и человека. Это позволит сформулировать предложения по развитию новых подходов к профилактикке и лечению микозовб основанных на ингиби ровании способности белков с амилоидными свойствами фибрилизоваться. Последнее также позволяет оценить результаты проекта как значимые для медицины. Полученные результаты будут являться новыми, приоритетными и будут соответствовать мировому уровню работ в данной области.
К началу наших исследований как в отечественной так и в зарубежной литературе практически полностью отсутствовали представления о том каким образом из полимеров, синтезированных внутри клетки и на цитоплазматической мембране происходит сборка и формирование уникального молекулярного ансамбля клеточной стенки, находящейся вне цитоплазмы, снаружи от цитоплазматической мембраны и отделенной от нее периплазматическим пространством. Изученные в процессе работы дрожжи Hansenula polymorpha и Candida utilis демонстрировали сходный с Saccharomyces cerevisiae общий план строения клеточной стенки и при исследовании ее структуры могли, наряду с последними, рассматриваться как типичные представители аскомицетных дрожжей. В процессе работы было получено и частично охарактеризовано более 100 мутантных штаммов дрожжей, относящихся к родам Saccharomyces и Hansenula в геноме которых были нарушены последовательности, входящие в состав генов, кодирующих ферменты биосинтеза и сборки компонентов клеточной стенки в единый молекулярный ансамбль. Получены первые свидетельства об участии КС дрожжей в формировании специфического ответа клетки на изменяющиеся условия окружающей среды, носящего название апоптоз. Разработан методический подход, основанный на использовании протеиназ с различной субстратной специфичностью, для выявления роли белков в формировании КС дрожжей. С использованием указанного подхода получены данные, свидетельствующие о возможности существования некоторых белков клеточной стенки в фибрилляррной (так называемой амилоидной) форме. Одним из наиболее приоритетных результатов, полученных в процессе работы явилось обнаружение способности глюкантрансферазы Bgl2p (одного из важных по результатам наших исследований структурного белка КС дрожжей) формировать фибриллы, первичная характеристика которых позволила отнести их к новой, ранее неизвестной группе амилоидных фибрилл клеточной стенки дрожжей.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2020 г.-26 декабря 2020 г. | Белки с амилоидными свойствами клеточной поверхности дрожжей:способы закрепления в клеточной стенке, роль в ответе на стресс, посттрансляционные модификации |
Результаты этапа: Цели и задачи первого года исследований по проекту выполнены в полном объеме. Проведен ряд дополнительных экспериментов, результаты которых в совокупности с результатами, полученными в запланированных исследованиях, развить сформулированную нами ранее гипотезу, согласно которой нековалентно закрепленные в полисахаридном матриксе белки клеточной стенки, в первую очередь белки с амилоидными свойствами Bgl2p и Gas1p, являющиеся объектом исследования в данном проекте, представлены в клеточной стенке несколькими пулами молекул, свойства, закрепление и посттрансляционные модификации которых различаются. Получены приоритетные и ранее не публиковавшиеся в открытой печати результаты о локализации этих белков на поверхности клеток дрожжей. Впервые убедительно продемонстрировано мозаичное расположение указанных глюкантрансфераз в клеточной стенке дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Результаты работы опубликованы. Для получения указанных результатов, а также для проведения экспериментов на следующих этапах работы над проектом, в течение первого года исследований была проделана следующая работа. 1 - Были получены штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с одновременной делецией генов, кодирующих глюкантрансферазы Bgl2p и Gas1p, а также штаммы в которых указанные белки лишены С-концевой аминокислотной последовательности различной длины - от двух до десяти аминокислотных остатков, а также штаммы с делециями активного центра глюкантрансфераз Bgl2p и Gas1p. 2 - Полученные штаммы за исключением штаммов с делециями активного центра глюкантрансфераз Bgl2p и Gas1p, а также их родительский штамм были выращены на стандартных средах для культивирования дрожжей в нормальных условиях и в условиях стресса (этанольный стресс, температурный шок) проведена предварительная характеристика их физиолого-биохимических свойств (скорость роста, устойчивость к соединениям, ингибирующим формирование КС таким, как Конго Красный, Калькофлуор Белый, ДСН в различных концентрациях), способность расти на различных источниках углерода в среде. Из клеток полученных штаммов, выращенных в различных условиях изолированы клеточные стенки и получены препараты белков ковалентно и нековалентно закрепленных на полисахаридах. С помощью LC-MS/MS анализа проанализированы наборы белков, входящих в состав КС, выявлена корреляция их закрепления с наличием посттрансляционных модификаций их молекул (глутатионилирование, фосфорилирование). Результаты данного этапа работы выявляют различия в устойчивости к стрессу и неблагоприятным условиям выращивания клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae дикого типа по сравнению с клетками штаммов с делетированными генами, кодирующими глюкантрансферазы Bgl2p и Gas1p и штаммов, в которых указанные белки лишены С-концевой аминокислотной последовательности. Получены данные, которые позволяют выявить корреляцию между устойчивостью к факторам стресса и наборами белков, обнаруживаемых в КС клеток дикого типа и мутантных штаммов, а также спланировать работу по получению мутантных штаммов на последующих этапах исследования. 3 - С помощью электронной и флуоресцентной микроскопии показано, что Bgl2p, экстрагированный из клеточной стенки с помощью 6М гуанидингидрохлорида, формирует ассоциаты с фибриллярной структурой. 4 - В процессе работы получены препараты КС и выделенные из них белки – как частично очищенные Bgl2p и Gas1p, так и наборы других белков, экстрагируемых вместе с ними, с использованием различных методов их экстракции (ДСН различной концентрации, коммерческие препараты глюканаз, растворы с повышенным значением рН и гуанидингидрохлорид). Полученные препараты предназначены для использования в экспериментах по воздействию белковых экстрактов из клеточных стенок дрожжей лабораторных животных. Эксперимент начат. Условия данного эксперимента подразумевают получение результата на следующем году исследований, поскольку согласно нашим предварительным результатам и данным, опубликованным в литературе, эффект от воздействия может быть достоверно детектирован по истечении нескольких месяцев. Анализ воздействия изучаемых препаратов на поведение мышей будет оценен в совместных экспериментах с сотрудниками кафедры Высшей нервной деятельности биологического факультета МГУ, возможное развитие амилоидоза в их органах будет изучено с помощью красителя Тиофлавина Т после вскрытия животных и приготовления препаратов, которые будут проанализированы во флуоресцентном микроскопе. Планируется повторение данного эксперимента на втором году выполнения проекта. 5 – В данной работе были продолжены серии экспериментов с применением нового подхода в исследованиях локализации белков клеточной стенки дрожжей с применением дисукцинимидилсуберата (DSS) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида HCl (EDC). Методика работы с данными соединениями применительно к белкам клеточной стенки дрожжей была разработана в нашей лаборатории ранее. Применение указанных "сшивающих" реагентов позволило повысить достоверность результатов, полученных в экспериментах, демонстрирующих мозаичность расположения изучаемых белков с амилоидными свойствами Bgl2p и Gas1p. Локализацию этих белков в клеточной стенке детектировали с применением антител. 6 - Результаты проведенных исследований позволили определить посттрансляционные модификации белка Bgl2p как ключ к пониманию роли белков с амилоидными свойствами в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки. 7 – При исследовании штаммов дрожжей, имеющихся в лаборатории на момент начала проекта, а также полученных в процессе его реализации, выявлено, что белками, важными для выживания клеток в условиях изученных видов стресса, могут являться глюкантрансфераза Bgl2p и кислая фосфатаза Pho3p. Более детальное изучение дополнительно запланировано на следующих этапах работы. Результаты предварительных экспериментов показали, что ферментативная активность Bgl2p и Gas1p важна для клеток в процессе формирования их ответа на стресс. | ||
2 | 1 января 2021 г.-28 декабря 2021 г. | Белки с амилоидными свойствами клеточной поверхности дрожжей:способы закрепления в клеточной стенке, роль в ответе на стресс, посттрансляционные модификации |
Результаты этапа: В экспериментах по воздействию на мышей препаратов клеточных стенок (КС) дрожжей Saccharomyces cerevisiae и выделенных из них белков, показано, что во всех случаях, когда в инъецируемом препарате присутствовал белок Bgl2p, у мышей развивались нарушения кожного покрова различной степени тяжести. В случае инъекции КС, полученных из клеток дрожжей дикого типа наблюдались изменения в поведении животных, а именно, снижение параметров их исследовательской активности. Сделан вывод о токсичном воздействии Bgl2p на организм мышей, предполагается возможность индукции у животных амилоидоза, вызванного контактом с белком Bgl2p. Другие компоненты КС дрожжей, токсичные для животных, не выявлены, однако не исключается их усиливающее воздействие на проявление токсических свойств Bgl2p. Анализ воздействия изучаемых препаратов на поведение мышей был проведен в совместных экспериментах с сотрудниками кафедр высшей нервной деятельности и физиологии животных биологического факультета МГУ, изучение возможного развития амилоидоза в их органах, как и было запланировано, будет продолжено на завершающем этапе выполнения работ по проекту. Накоплен банк органов экспериментальных и контрольных мышей, ведется их цитологическое и биохимическое исследование с целью определения механизма выявленного токсического эффекта. Получены новые, принципиально значимые результаты о влиянии полифосфатов, содержание которых меняется в зависимости от наличия в клеточных стенках дрожжей фермента кислой фосфатазы, на способы закрепления в данной органелле изучаемых глюканозилтрансгликозилаз, в первую очередь белка Bgl2p. Показано, что один из пулов молекул этого белка в КС, экстрагируемый с помощью гуанидингидрохлорида отсутствует в случае делеции гена кислой фосфатазы PHO3 и накопления полифосфатов. Определение полифосфатов проводили в совместных экспериментах с Т.В.Кулаковской (ИБФМ РАН). План работ выполнен в полном объеме. Получены приоритетные результаты, ранее не публиковавшиеся в научных журналах. | ||
3 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Белки с амилоидными свойствами клеточной поверхности дрожжей:способы закрепления в клеточной стенке, роль в ответе на стресс, посттрансляционные модификации |
Результаты этапа: Сравнительное изучение способности к фибриллизации глюкантрансферазы Bgl2р из клеточной стенки дрожжей показало, что наиболее воспроизводимо происходит фибриллизация полноразмерного белка нежели его фрагментов. Исследование полученных в результате работы по проекту штаммов показало, что среди низкомолекулярных соединений только полифосфаты влияют на фибриллизацию Bgl2p. Влияния на фибриллизацию Gas1p как со стороны полифосфатов и так других низкомолекулярных соединений выявлено не было, поэтому на наш взгляд в дальнейшем исследование Gas1p и его фрагментов на организм мышей с целью изучения амилоидозов является малоперспективным. Был проведён первичный подробный скрининг изменений, происходящих в организме мышей в результате внутрибрюшинных инъекций суспензий клеточных стенок (КС) дрожжей Saccharomyces cerevisiae и экстрактов из КС, содержащих и не содержащих в своем составе белок с амилоидными свойствами Bgl2p. При воздействии на организм мышей в начале работы предполагалось два возможных механизма действия препаратов, содержащих Bgl2p: 1) токсическое воздействие возникает непосредственно при введении препарата, а после прекращении введения снижается и исчезает; 2) отсутствие токсического воздействия на стадии введения препарата, но его проявление только спустя несколько месяцев. Главной задачей было выяснить, какой из возможных механизмов реализуется. Динамика состояния мышей в процессе эксперимента демонстрировала реализацию второго механизма, что с высокой степенью вероятности свидетельствует о развивающемся амилоидозе. Токсического воздействия КС и экстрактов из КС, не содержащих Bgl2p, на организм мышей выявлено не было. Продолжаются исследования по воздействию интраназального способа обработки мышей препаратами КС, содержащих и не содержащих Bgl2p. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".