| Результаты этапа: Шельф Баренцева моря - один из наиболее экономически перспективных регионов Арктики с точки зрения его ресурсов и географического положения. Здесь присутствуют множественные газопроявления, а также ряд крупных месторождений, в том числе одно из крупнейших в мире – Штокмановское. Углеводороды, как природного, так и техногенного происхождения, являются субстратами микроорганизмов, в том числе обитающих в низкотемпературных морских биотопах, причем некоторые из них используют углеводороды как единственный источник углерода и энергии, и, следовательно, могут являться индикаторами нефтепроявлений. В данном проекте мы изучали распространение, разнообразие, численность микроорганизмов Баренцева моря и их взаимосвязь с факторами окружающей среды, а также способность к окислению углеводородов.
По результатам трех экспедиций была сформирована обширная коллекция образцов воды и осадков различных регионов Баренцева моря, образцы были детально охарактеризованы с геологической и геохимической точки зрения. С использованием количественных и качественных данных, полученных современными методами молекулярной экологии, на основе широкомасштабного статистического анализа более 250 образцов было дано детальное и структурированное описание естественных микробных сообществ Баренцева моря. Прежде всего эти данные могут быть в будущем использованы для оценки воздействия различных антропогенных факторов, например, при нефтяных загрязнениях, связанных как с нефтедобычей, так и с другими областями деятельности человека. По результатам проведенной работы был выявлен целый ряд достоверных корреляций состава микробных сообществ с геологическими факторами (толщина осадочного слоя, рельеф дна и тд.) и геохимическими факторами (pH и Eh осадков, состав углеводородов-биомаркеров) их среды обитания.
За период исследования нами было поставлено 199 аэробных накопительных культур, в качестве единственного источника углерода и энергии в которых выступала сырая нефть, н-нонан, н-ундекан, н-октадекан, пристан, циклогексан, бифенил и фенантрен. Большинство культур пересевалось от одного до трех раз и было проанализировано методами высокопроизводительного профилирования по гену 16S рРНК. На основе полученных данных с использованием статистических методов нами был выявлен широкий ряд таксонов микроорганизмов Баренцева моря, чей рост достоверно стимулируется присутствием различных групп углеводородов в среде и которые тем самым могут служить индикаторами соответствующих соединений в природе. Для наиболее активных и стабильных накопительных культур был проведен метагеномный анализ, в результате которого была создана база данных из 121 генома бактерий и 1442 последовательностей ключевых генов деградации углеводородов.
Из полученных накопительных культур было выделено 73 штамма чистых культур углеводородокисляющих микроорганизмов, 32 из которых были идентифицированы по гену 16S рРНК. Это представители родов Pseudoalteromonas, Pseudomonas, Halopseudomonas, Stutzerimonas, Dietzia, Rhodococcus, Janibacter, Microbacterium, Rhodoglobus и Psychrobacter. Для ряда культур с помощью газо-жидкостной хроматографии был определен спектр потребляемых углеводородов сырой нефти и проведено полногеномное секвенирование. Анализ полных геномов чистых культур позволил описать их энзиматический аппарат окисления углеводородов.
На основе анализа полученных геномных и метагеномных данных в качестве генов-маркеров присутствия в сообществе аэробных углеводородокисляющих микроорганизмов были выбраны гены цитохром P450 алкан-гидроксилазы (cyp153) и алкан-1-монооксигеназы (alkB). Для анализа присутствия в сообществе аэробных метанокисляющих микроорганизмов использовался ген метан монооксигеназы (pmoA), последовательности которого были получены из метагеномных данных, предоставленных нашими норвежскими партнёрами в рамках реализации данного проекта. В результате были разработаны, протестированы и использованы на всей коллекции образцов системы праймеров для ПЦР “в реальном времени” для численной оценки копийности этих трех маркерных генов как в природных экотопах, так и в накопительных культурах, что позволило дать оценку как фоновым, так и предельным значениям количества углеводородокисляющих микроорганизмов в среде.
Таким образом, в ходе реализации проекта нами были получены все основные фундаментальные научные предпосылки для создания практических систем мониторинга численности углеводородокисляющих микроорганизмов в акватории Баренцева моря для использования их в качестве индикаторов углеводородных высачиваний или для оценки воздействия антропогенных факторов на природные экотопы.
|
