ИСТИНА

Настоящий проект направлен на детальное исследование роли аутофагии и митофагии в регуляции механизмов миграции/инвазии аденокарциномы легких и выявление новых сигнальных путей и ключевых белков, регулирующих метастатический потенциал. Целью данного Проекта является изучение роли белка BNIP3 в регуляции механизмов миграции/инвазии клеток аденокарциномы легких и взаимосвязи с развитием аутофагии и митофагии в клетках данного типа опухоли.

Metastasis or cancer cell migration from the primary site with the further formation of secondary site of the tumor is one of the main causes of cancer-related mortality. Autophagy is an evolutionary conserved process that provides the degradation of cytoplasmic components in the lysosomes of the cell. Autophagy plays an important role in regulation of carcinogenesis. For example, autophagy can contribute to tumor invasiveness providing tumor cell survival during stress conditions, i.e. hypoxia. Furthermore, autophagy may also contribute to the regulation of tumor metastasis. Last years the attention of the researchers is focused on mitochondria, multifunctional organelles involved in different vital processes. Furthermore, mitochondria play important role in carcinogenesis, and specifically in regulation of metastatic dissemination. Mitophagy is the selective form of autophagy in which damaged mitochondria are degraded in autophagosomes. BNIP3 is one of the main mitophagy adaptors. It was shown that upregulation of BNIP3 in solid tumors with the poor prognosis leading to the autophagy activation contributing to the tumor cell survival therapy resistance. BNIP3 was also shown to contribute to the metastatic dissemination but the mechanisms remain poorly understood. In this project we have demonstrated that mitochondrial dysfunction induced by BNIP3 deletion and further accumulation of reactive oxygen species led to the activation of the molecular pathway involving FOXO3 protein and its target C/EBPb, that in turn provided activation of epithelial-mesenchymal transition program and increased migration properties of lung adenocarcinoma cells. Obtained data will contribute to our understanding of metastasis mechanisms. Furthermore, obtained results could be beneficial for new approaches in personalized medicine.

В результате выполнения проекта будут получены новые научные данные о механизмах регуляции миграции/инвазии в клетках аденокарциномы легких. В частности будет установлена взаимосвязь между подавлением или индукцией аутофагии/митофагии и миграцией. Также будет установлено соотношение между экспрессией ВNIP3 и способностью к миграции в клетках аденокарциномы легких. Для этого в клетках аденокарциномы легкого дикого типа и нокаутных по ВNIP3 in vitro будет проведен scratch test при помощи анализа «на зарастание раны». Будет оценен вклад аутофагии в регуляцию механизмов миграции/инвазии в клетках аденокарциномы легких. Для этого будут проведены эксперименты с ингибитором аутофагии Бафиломицином 1 и индуктором аутофагии рапамицином. Через 24 часа после обработки клеток будет проведен scratch test при помощи анализа «на зарастание раны». Кроме того, будут проведены эксперименты на клеточных линиях дикого типа и нокаутных по белкам-регуляторам аутофагии (Atg13). Также будет установлено влияние индукции/подавления аутофагии на экспрессию маркеров ЭМП, таких как E-cadherin, N-cadherin, Slug, Snail. Для выяснения механизмов, лежащих в основе влияния митофоагии на процессы миграции/инвазии в клетках аденокарциномы легких, митофагия будет индуцирована сбросом мембранного потенциала митохондрий под действием разобщителя окислительного фосфорилирования, CCCP. Оценку потенциала будет проведена с помощью проточной цитометрии после окраски клеток красителем TMRE. Миграция опухолевых клеток в контрольных образцах и после обработки CCCP будет оценена при помощи анализа scratch test «на зарастание раны». Также будет оценена экспрессия маркеров ЭМП, таких как: E-cadherin, N-cadherin, Slug, Snail в контольных образцах и обработанных CCCP. Известно, что гипоксия может стимулировать некоторые виды митофагии, в частности зависимую от FUNDC1 и BNIP3L(Nix). Для выявления роли BNIP3 в условиях нормоксии и гипоксии будут использованы клетки аденокарциномы легкого A549 как дикого типа, так и с нокдауном по белку BNIP3. Миграция опухолевых клеток будет оценена при помощи анализа scratch test. Оценка развития митофагии будет проведена методом Вестерн Блоттинга анализируя накопление полноразмерной формы PINK1, который является маркёром митофагии. Так как важным процессом, предшествующим стимуляции митофагии, является дробление митохондрий (fission). Исходя из этого, в качестве модулятора митофагии использовали ингибитор митохондриального дробления – mdivi-1. Мишенью mdivi-1, является белок DRP1, ключевой фермент, ответственный за дробление митохондрий. Уровень этого белка, а также его фосфорилированной по серину 616 модификации, отвечающей за дробление митохондрий также будет оценен методом Вестерн Блоттинга. Миграция опухолевых клеток будет оценена при помощи анализа scratch test «на зарастание раны». Также будет оценена экспрессия маркеров ЭМП, включая E-cadherin, N-cadherin, Slug, Snail в контольных образцах и обработанных CCCP. Кроме того будет проведен анализ клеточного дыхания с помощью прибора SeaHorse XF в клеточных линиях аденокарциномы легкого как дикого типа, так и с нокдауном по белку BNIP3. Белок-белковые взаимодействия вовлеченные в регуляцию механизмов миграции/инвазии и аутофагии/митофагии в клетках аденокарциномы легких будут детектированы методом иммунопреципитации. В заключении проекта будут идентифицированы новые регуляторные взаимодействия генов/белков, вовлеченных в регуляцию способности к миграции/инвазии, механизмов устойчивости и перспективных для терапии данного вида онкопатологий. Все предполагаемые данные являются оригинальными и дадут возможность расширить знания по возможным механизмам метастазирования, химиорезистентности и клеточной гибели. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых подходов в персонифицированной медицине.

С помощью анализа экспрессии генов и системно-биологического анализа нами были идентифицирован белок BNIP3 как одна из основных мишеней Тюдор cтафилококковой нуклеазы (TSN). TSN является многофункциональным, высококонсервативным белком, который экспрессируют самые разнообразные организмы, находящиеся в эволюционном развитии достаточно далеко друг от друга. Было показано, TSN вовлечена в регуляцию различных механизмов канцерогенеза включая пролиферацию раковых клеток, ангиогенез опухолей, химиорезистентность. В нашей лаборатории была впервые показана роль TSN в регуляции чувствительности раковых клеток к апоптозу (Zagryazhskaya A, 2015). В частности, было установлено, что сайленсинг TSN приводит к увеличению клеточной гибели при индукции цисплатином. В тоже время подавление экспрессии TSN приводит к уменьшению экспрессии белка S100A11. В свою очередь негативное регулирование S100A11 приводит к сенсибилизации клеток аденокарциномы легких к цисплатину. Еще одним важным процессом, в котором участвует TSN, является регуляция инвазии окружающих тканей и метастазирование. С помощью технологии CRISPR/Cas9 была получена клеточная линия аденокарциномы легкого нокаутные по белку BNIP3 (A549 BNIP3Ko). Уровень экспрессии этих белков в клеточной линиии A549 и нокаутных линиях, был оценен методом Вестерн Блоттинг. Эти данные были также подтверждены используя siRNA технику для замалчивания генов. Нами также были получены предварительные данные показывающие, что выключение белка BNIP3 оказывает влияние на миграцию клеток аденокарциномы легкого. В клетках А549 нокаутных по BNIP3 способность к миграции значительно снижалась по сравнению с диким типом. Кроме того, нами разработаны основные методы и подходы для оценки развития аутофагии и митофагии в клеточных линиях аденокарциномы легких. Совершенно очевидно, что полученные результаты будут не только важны с точки зрения новизны, но также будут соответствовать высокому международному уровню исследований в данной области знаний.

Задачей первого этапа проекта стало получение и характеристика нокаутных по гену BNIP3 клеток аденокарциномы легкого (АКЛ) методом редактирования генома CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR-associated sequence). Для этого было необходимо оптимизировать условия трансфекции плазмидами, кодирующими систему CRISPR/Cas9, клеток АКЛ А549; получить устойчивые линии А549, нокаутные по гену BNIP3 и контрольные к процедуре CRISPR/Cas9, из максимально возможного количества клонов, а также популяции тотального сортинга, содержащего не менее 2-5 тысяч клонов; провести анализ специфичности редактирования генома методом CRISPR/Cas9 в отобранных клеточных линиях А549. Так, методом CRISPR/Cas9 были получены клетки А549, нокаутные по гену BNIP3, а также контрольные к процедуре CRISPR/Cas9. Способность к миграции клеточных линий АКЛ (A549, U1810) дикого типа и лишенных белка BNIP3 (полученных по технологии CRISPR/Cas9) была оценена при помощи анализа «на зарастание раны» (wound healing assay), в котором клетки, прикреплённые к подложке, заполняют сформированную «рану» на монослое. Степень зарастания царапины клетками вычисляли как отношение площади царапины через 24 часа к площади через 0 часов после повреждения. В клетках линии A549 нокаутных по BNIP3 (koBNIP3) заживление искусственно нанесенной царапины в течение 24 часов происходило значительно медленнее, чем в клетках дикого типа (Рисунок 1). Таким образом, установлено влияние белка BNIP3 на процесс миграции клеток АКЛ. Для изучения роли BNIP3 в регуляции аутофагии в клетках АКЛ была проведена оценка содержания липидированной формы белка LC3, а также главного раннего субстрата необходимого для конвертации LC3-I в LC3-II, белка p62/SQSTM1 с помощью Вестерн Блоттинга (Рисунок 2). Во время аутофагии аутофагосомы поглощают содержимое клетки, включая цитозольные белки и органеллы. Одновременно цитозольная форма LC3 (LC3-I) конъюгируется с фосфатидилэтаноламином с образованием конъюгата LC3-фосфатидилэтаноламина (LC3-II), который встраивается в мембрану аутофагосом. Таким образом, LC3-II можно использовать как маркер интенсивности аутофагии. Для оценки экспрессии белковых маркеров аутофагии использовался метод Вестерн-блот. Анализ экспрессии маркера аутофагии LC3-II (Рисунок 2) выявил повышение уровня LC3-II и деградацию p62 в клетках АКЛ с нокаутом по BNIP3. Была также протестирована способность химических агентов, ингибиторов и индукторов аутофагии (Бафиломицина 1 и рапамицина), влиять на миграцию и инвазию клеток АКЛ (трансфицированных и контрольных). Добавление бафиломицина - ингибитора аутофагии, подавляющего активность вакуолярных H+-АТФаз, приводило к подавлению миграции клеток АКЛ (Рисунок 1). Полученные данные подтвердились в экспериментах по подавлению аутофагии путем инактивации белка Atg13, который необходим для процесса макроаутофагии. Заживление «раны» клетками АКЛ с нокаутом по Atg13 (U1810ATG13KO) происходило значительно медленнее, чем в клетках дикого типа. Однако, активация аутофагии ингибитором белка mTOR рапамицином не оказывала существенного влияния на миграционную активность клеток АКЛ (нокаутных по BNIP3 и дикого типа). Таким образом, подавление аутофагии значительно снижало миграционный потенциал клеток АКЛ А549, как нокаутных по BNIP3, так и дикого типа. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) – сложный динамический процесс, в результате которого эпителиальные клетки постепенно приобретают обратимый мезенхимальный фенотип необходимый для миграции опухолевых клеток. Для изучения роли BNIP3 в регуляции ЭМП была оценена экспрессия белков-регуляторов ЭМП, в клеточных линиях рака легких (A549, U1810) дикого типа и нокаутных по белкам BNIP3 с помощью Вестерн Блоттинга..Полученные данные демонстрируют увеличение экспрессии указанных выше белков - маркеров ЭПМ, таких как N-cadherin, Slug, Snail, Twist и Zeb1/2 при подавлении экспрессии BNIP3 в клетках АКЛ (трансфецированных и контрольных) (Рисунок 2). Кроме того, инкубация с Бафиломицином в течение 24 часов приводила к подавлению экспресии маркеров ЭМП, включая N-cadherin, Slug, Snail, Twist и Zeb1/2 в клетках АКЛ как нокаутных по BNIP3, так и дикого типа. Так подавление экспрессии BNIP3 приводило к активации ЭМП, важного этапа метастатического каскада. Для оценки инвазивных свойств клеток АКЛ (трансфецированных и контрольных) использовали культуральные вставки диаметром 12 мм с размером пор 0,8 мкм (Corning, США). В каждую лунку планшета помещали культуральную вставку. Внутрь вставки вносили 0,5×106 клеток АКЛ линии А549 или U1810. Планшет с культуральными вставками инкубировали в течение 24 часов. Подсчет клеток, мигрировавших сквозь культуральную вставку, проводили с использованием высокоэффективной количественной микроскопии после окрашивания с красителем Diff-Quick согласно инструкции производителя. Клетки АКЛ нокаутные по BNIP3 демонстрировали более высокую инвазивную активность, чем клетки дикого типа (Рисунок 3). Таким образом, подавление экспрессии BNIP3 в клетках АКЛ приводило к увеличению инвазивных свойств и увеличению экспрессии транскрипционных факторов регулирующих ЭМП. Однако, тест «на зарастание раны» продемонстрировал снижение миграционных свойств в BNIP3 нокаутных линиях. Измерение пролиферативной активности в клетках дикого типа и нокаутных по BNIP3 с помощью ХТТ-теста показало, что подавление экспрессии BNIP3 приводит к заметному снижению пролиферативной активности клеток АКЛ (Рисунок 4). Таким образом, подавление экспрессии BNIP3 в клетках АКЛ приводит к повышению синтеза маркеров ЭМП, одного из основных этапов метастатического каскада и увеличению миграционных свойств, но снижает их пролиферативный потенциал. Угнетение аутофагии в клетках АКЛ, как нокаутных по BNIP3, так и дикого типа приводило к подавлению миграционных свойств и блокировке синтеза маркеров ЭМП. Принимая во внимание, что митохондрии играют важную роль в процессе канцерогенеза и в частности в регуляции метастазирования нами была оценена интенсивность митохондриального дыхания в клетках АКЛ дикого типа и нокаутных по белку BNIP3. Оценка проводилась с помощью прибора Seahorse Analyzer позволяющего прижизненно оценивать активность митохондрий. В процессе анализа к клеткам последовательно добавляли модуляторы деятельности митохондрий: ингибитор митохондриальной АТФ-синтазы олигомицин, разобщитель окислительного фосфорилирования CCCP (Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone), и ингибиторы дыхательной цепи антимицин и ротенон. Как видно из рисунка 5 подавление экспрессии BNIP3 в клеточной линии АКЛ с помощью технологии CRISPR/Cas9 приводило к снижению уровня митохондриального дыхания. Угнетение дыхания в нокаутной по BNIP3 линии АКЛ свидетельствует о нарушениях в работе митохондрий, что в свою очередь может приводить к накоплению АФК в клетках данной линии. Исследование продукции АФК проводили с помощью митохондриально-направленных АФК-чувствительных зондов. Так, продукцию супероксид радикала измеряли при помощи гидроэтидина, коньюгированного с катионом трифенилфосфония «Mitosox», а продукцию пероксид водорода при помощи сенсора «Hyper», состоящего из флюоресцентного белка YFP (yellow fluorescent protein), включенного в регуляторный домен OxyR: позитивный регулятор генов, индуцируемых перекисью водорода. Подавление экспресии BNIP3 приводило к накоплению супероксид радикала и пероксид водорода в клетках АКЛ (Рисунок 6). Важно отметить, что стимуляция ростовым фактором TGF-β увеличивала накопление АФК в клетках АКЛ нокаутных по BNIP3 через 18 часов по сравнению с необработанными клетками. Значительное накопление АФК в BNIP3 нокаутной клеточной линии можно объяснить дисрегуляцией процесса митофагии, которая происходит в результате подавления экспрессии BNIP3. Таким образом, подавление экспрессии BNIP3 в клетках АКЛ приводило к увеличению инвазивных свойств и увеличению экспрессии транскрипционных факторов, регулирующих ЭМП. Увеличение инвазивных свойств клеток АКЛ при подавлении BNIP3 можно объяснить накоплением активных форм кислорода. Однако, инкубация с антиоксидантами, такими как Тролокс, частично восстанавливала миграционные свойств клеток АКЛ как дикого типа, так и нокаутных по BNIP3 (Рисунок 7). Для исследования роли митофагии в регуляции метастазирования было подавлено дробление митохондрий добавлением ингибитора Mdivi-1 или путем нокаутирования белка DRP1, ключевого фермента ответственного за дробление митохондрий. Подавление дробления митохондрий приводило к значительному снижению миграционных свойств клеток АКЛ как дикого типа, так и нокаутных по белку BNIP3 (Рисунок 8). Важно отметить, что миграция клеток АКЛ при двойном нокауте BNIP3 и DRP1 не восстанавливалась даже при добавлении TGF-β, ключевого индуктора ЭМП и миграции (Рисунок 9). Подавление дробления митохондрий приводило также к снижению экспрессии белков регуляторов ЭМП, таких как Snail и Twist (Рисунок 10). Таким образом, увеличение инвазивных и миграционных свойств клеток АКЛ при нокауте BNIP3 можно объяснить митохондриальной дисфункцией которая происходит при подавлении BNIP3, одного из ключевых белков-адаптеров митофагии, и последующим накоплением АФК. Известно, что АФК участвуют в регуляции различных сигнальных путей, включая PI3K/Akt/mTOR. Следующим этапом нашей работы было изучение роли BNIP3 в регуляции сигнального каскада PI3K/Akt/mTOR. Мы показали, что при нокауте BNIP3 снижается экспрессия фосфорилированной формы белка Akt и активность PI3K/Akt/mTOR-каскада в клетках, по сравнению с клетками дикого типа (Рисунок 2). Кроме того, нами ранее было показано, что клетки с нокаутом BNIP3 хуже переносят генотоксический стресс, индуцированный цисплатином. Полученные данные демонстрируют, что BNIP3 задействован в адаптации клеток АКЛ к различным видам повреждений. Таким образом, подавление экспрессии BNIP3 в клетках АКЛ привело к понижению скорости пролиферации и подавлению активности PI3K/Akt/mTOR каскада. Однако, в тоже время, подавление экспрессии BNIP3 привело к усилению активации аутофагии, программы ЭМТ и инвазивных свойств АКЛ. В свою очередь подавление активности PI3K/Akt/mTOR каскада существенно снижает уровень транскрипционного фактора FOXO3 (Forkhead box O), который является мишенью Akt (Рисунок 3). FOXO3 является членом семейства транскрипционных факторов FOXO, которые участвуют во множестве физиологических и патологических процессов, включая апоптоз, пролиферацию, метаболизм, иммунитет и опухолевый рост. FOXO3 является важным нисходящим эффектором в нескольких сигнальных путях, особенно тех, которые включают протеинкиназу B (Akt), c‐Jun терминальную киназу (JNK) и внеклеточные сигнально‐регулируемые киназы (ERK), которые особенно вовлечены в патологию опухолей. Интересно отметить, что подавление дробления митохондрий восстанавливает экспрессию FOXO3 (Рисунок 10). Таким образом, существует взаимосвязь между процессами митофагии, метастазирования и активацией PI3K/Akt/mTOR каскада в клетках АКЛ. Следующим этапом работы стало проведение масс-спектрометрического анализа клеток А549 дикого типа, клеток контрольных к CRISPR/Cas9 процедуре и нокаутных по BNIP3. Для этого нам было необходимо провести подбор условий для экстракции и лиофилизации белков для масс-спектрометрического анализа; осуществить пробоподготовку образцов клеток A549 дикого типа и нокаутных по BNIP3 для проведения масс-спектрометрического анализа; и провести масс-спектрометрический анализ белков клеток A549 дикого типа и нокаутных по BNIP3 минимум в трех повторностях, а также линий, контрольных к процедуре CRISPR/Cas9. Масс-спектрометрический анализ проводился совместно с коллегами Факультета клинической и экспериментальной медицины Университета г. Линчёпинг (Швеция). Согласно полученным данным, в клетках А549, нокаутных по BNIP3, понижен уровень белков, задействованных в регуляции клеточного роста и апоптоза таких как GADD45G (Growth arrest and DNA damage-inducible proteins-interacting protein 1). Кроме того, в клетках А549, нокаутных по BNIP3, наблюдалось значительное увеличение синтеза белка Радиксин. Радиксин - цитоскелетный белок, который, связывая актиновый цитоскелет с плазматической мембраной, определяет, наряду с моезином и эзрином, характер и скорость клеточной миграции. Интересно отметить, что в опухолевых клетках Радиксин регулирует переход от эпителиального фенотипа к мезенхимальному, регулируя активность белка Rac1. Для установления молекулярных сигнальных путей, в которых потенциально могут быть задействованы выявленные в ходе масс-спектрометрического анализа и протеомного анализа белки и FOXO3, а также функциональной связи с ними был проведен биоинформатический анализ в программе QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis. На основании полученного анализа мы показали, что в клетках АКЛ мишенью FOXO3 может быть белок C/EBPb. Этот белок является активатором транскрипции генов, участвующих в регуляции различных процессов включая пролиферацию, дифференцировку и воспалительный ответ. Кроме того, C/EBPb участвует в регуляции ЭМП. Используя метод ПЦР в реальном времени мы показали, что в клеточной линии АКЛ нокаутной по BNIP3 происходит подавление экспрессии C/EBPb по сравнению с клетками дикого типа (Рисунок 11). Можно предположить, что дисфункция митохондрий, вызванная подавлением митофагии при нокауте BNIP3 приводит к подавлению активации каскада PI3K/Akt/mTOR и его мишени FOXO3, что в свою очередь снижает экспрессию C/EBPb и вызывает активацию программы ЭМП а также усиление миграционных свойств в клетках АКЛ.