Амёбоидные протисты в парках крупных городов: морфологическое и генетическое разнообразиеНИР

Amoeboid protists in urban parks: morphological and genetic diversity

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 7 февраля 2020 г.-14 марта 2021 г. Этап 1
Результаты этапа: В соответствии с поставленными задачами работы по проекту в 2020 году были сосредоточены в следующих направлениях: 1) отбор проб по единой схеме в парках Москвы и Сямыня; 2) описание разнообразия раковинных и голых амеб в отдельных парках с использованием микроскопического и молекулярного подходов; 3) первичное описание видового разнообразия и структуры сообщества раковинных и голых амеб в парках Москвы; 4) подготовка материала для проведения метагеномного анализа в парках Москвы и Сямыня. В связи с особенностями эпидемиологического режима 2020 года и до сих пор закрытыми границами между Россией и Китаем первоначально поставленные задачи не были выполнены в полном объеме, однако даже в существующих условиях план полевых работ был выполнен полностью и пробы из Китая были переправлены в Россию для проведения микроскопического анализа раковинных амеб. 1. ПОЛЕВЫЕ РАБОТЫ В отчетном году были отобраны образцы для ризоподного анализа в парках Москвы (Россия) и Сямыня (КНР). В Москве образцы были отобраны в июне 2020 г в шести парках: Ботанический сад Московского университета «Аптекарский огород» (55.77886 °N, 37.63612 °E), Природно-исторический парк «Измайлово» (55.77973 °N, 37.76927 °E), Природно-исторический парк «Сокольники» (55.80235 °N, 37.69090 °E), Природный историко-архитектурный и рекреационный комплекс «Усадьба Воронцово» (55.66510 °N, 37.53094 °E, «Воронцовский парк»), Солдатёнковский парк (55.73627 °N, 37.44644 °E, парк Фили) и Природно-исторический парк «Битцевский лес» (55.601°N, 37.554°E). Во всех парках для исследования отбирали основные биотопы обитания раковинных амеб: донные отложения водоемов, подстилка и почвы, мхи и дупла деревьев. В каждом типе биотопа образцы отбирали в трех повторностях. Всего было отобрано 63 образца. Образцы поверхностных (2 – 3 см глубиной) донных отложений водоемов отбирали в прибрежной зоне на глубине 20-30 см (в пластиковые контейнеры объемом 50 мл и фиксировали спиртом). Образцы подстилки и почвы собирали у комля различных видов древесных растений, формирующих древесный ярус (береза, дуб, липа, клен и пр.). Образцы мха отбирали со стволов различных видов деревьев на высоте 30–50 см от почвы. Дупла для отбора образцов выбирали в различных видах деревьев (яблоня, дуб, каштан и др.) на высоте 100- 140 см от почвы. Образцы почвы, мха и содержания дупел упаковывали в пластиковые герметично закрывающиеся пакеты (объем образца 40-50 мл) и хранили в холодильнике при температуре +5 °С до приготовления для микроскопирования в лаборатории. Карта расположения исследованных парков на территории г. Москвы представлена на слайдах 2, 3 Приложения. Для изучения видового состава голых амеб, метагеномных исследований протистов, а также химического анализа воды и донных осадков образцы отбирали в трех водоемах: Собачий пруд (55.779747 N, 37.769426 E, Измайловский парк), Большой Олений пруд (55.802315 N, 37.690782 E, парк Сокольники) и водоем в Аптекарском огороде (55.778879 N, 37.636152 E, МГУ имени М.В. Ломоносова). Донные отложения в Собачьем и Большом Оленьем прудах представлены песком, покрытым небольшим слоем наилка. В пруду Аптекарского огорода донные отложения илистые с регулярными включениями камней (размером до 2 см). Образцы донных отложений для определения видового состава голых амеб отобраны из поверхностных донных отложений (1 см) и представляли собой наилок с подстилающим верхним горизонтом песка или другого субстрата. Образцы отбирали в прибрежной зоне на глубине 20-30 см. Объем образца ~200 мл, помещали в бутылку объемом 750 мл для создания аэробных условий при транспортировке. Всего отобрано 9 образцов. Для определения характеристик среды отбирали образцы на общий химический анализ воды (4 л), углерод, растворенный кислород, хлорофилл а и аммоний. Также отбирали образцы донных поверхностных донных отложений (наилок с подстилающим субстратом до глубины 1-2 см) на общий химический анализ объемом 2 л. Все образцы за исключением образцов на хлорофилл а переданы в лабораторию Роса в день отбора. С помощью портативного прибора измеряли температуру и окислительно-восстановительный потенциал воды в прибрежной зоне. Аналогичная схема отбора образцов была применена еще одном парке Москвы - природно-историческом парке «Битцевский лес». Для каждого видов древесных растений (липа – Tilia cordata, береза – Betula pubescens, клен – Acer platanoides, дуб – Quercus robur, ель – Picea abies), участвующих в формировании древесного яруса парка, были отобраны по одному почвенному образцу в подкроновом пространстве, одному образцу эпифитных мхов со стволов живых деревьев и валежин, а также одному образцу содержания дупел. Помимо этого, были отобраны по пять образцов из мезо-эвтрофных местообитаний (заболоченные участки низин и водоемов) и донных отложений водоемов. Отдельно были отобраны образцы почв на территории усадьбы “Ясенево”. Итого 45 образцов. В окрестностях города Сямыня образцы были отобраны для анализа регионального видового разнообразия субтропических сообществ раковинных амеб в разнотипных биотопах (КНР). Регион исследования характеризуются ярко-выраженным субтропическим, муссонным климатом со средней годовой температурой 21°C и средним годовым уровнем осадков 1100 мм. Дожди преимущественно выпадают в период с мая по август. Образцы отбирали в шести парковых зонах (Dapingshan Park, Shuanglongtan Park, Dalunshan Park, Xiangshan Park, Huli Park и Shangli Park), расположенных в различных районах города. В каждом парке были отобраны следующие типы биотопов: пелагиаль и донные отложения водоемов, почвы, мхи и дупла деревьев. Способ отбора образцов был аналогичен таковому в московских парках. В каждом типе биотопа отбирали по три повторности. Всего было отобрано 90 образов. Карта расположения исследованных парков на территории г. Сямыня представлена на слайдах 4, 5 Приложения. 2. РАЗНООБРАЗИЕ И ОПИСАНИЕ НОВЫХ ТАКСОНОВ РАКОВИННЫХ АМЕБ В ОТДЕЛЬНЫХ ПАРКАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ПОДХОДА Исследования разнообразия раковинных амеб в парках позволило описать новые таксоны. Так, был описан новый вид Frenopyxis stierlitzi из дупел деревьев в городских парках Москвы (Битцевский парк) и Потсдама (Германия). Вид принадлежит к новому роду семейства Centropyxidae и отличается уникальным признаком: внутренняя толстая органическая губа, окружающая устье, продолжается в уздечку, которая соединяет край устья с внутренней стороной стенки раковины и расширяется в месте соединения с краем устья. Более подробная информация содержится в опубликованной статье Bobrov A., Mazei Yu. Frenopyxis stierlitzi gen.nov. sp.nov – new testate amoeba (Amoebozoa: Arcellinida) from the urban parks with notes on the systematics of the family Centropyxidae Jung, 1942 // Zootaxa. 2020. Vol. 4885 № 3. P. 384–394. (doi: 10.11646/zootaxa.4885.3.4), а изображения нового таксона показаны на слайде 6 Приложения. Кроме того, из дупла липы в Битцевском парке города Москвы был описан новый вид раковинной амебы Meisterfeldia bitsevi. Для нового вида характерна удлиненно-яйцевидная двусторонне-симметричная раковина, не сжатая с боков. Раковинка состоит из органического материала без минеральных частиц. На вентральной стороне расположено почти круглое субтерминальное отверстие. В опубликованной статье разработан также определитель видов рода Meisterfeldia: Bobrov A., Mazei Yu. Meisterfeldia bitsevi – new testate amoebae of the family Cryptodifflugiidae Jung, 1942 (Amoebozoa: Arcellinida) from the tree hollow in the urban park (Moscow, Russia) with a key to species of the genus Meisterfeldia // Zootaxa. 2021. Vol 4908. № 4. P. 595-600. (doi: 10.11646/zootaxa.4908.4.11). Изображения нового таксона показаны на слайде 7 Приложения. Два новых вида (Bullinularia maxima и Bullinularia macroporum) были описаны в результате таксономической ревизии рода Bullinularia, на основе материала, отобранного в парке Тропический рай бухты Ялонг, Хайнань, Китай в почве между надземными корнями Ficus sp. Разнообразие раковинных амеб было самым высоким во взвешенной почве воздушных корней (36 таксонов) по сравнению с другими биотопами из этого же парка: почвы (25) и дупле дерева (11). Разработаны определитель видов и краткое переописание рода Bullinularia. Результаты опубликованы в статье: Bobrov A.A., Mazei N.G., Mazei Yu.A. The description of two new species of testate amoebae from suspended soil of the aerial roots at the tropical urban park in Hainan (China) and the review of the genus Bullinularia Deflandre, 1953 (Amoebozoa: Arcellinida) // Protistology. 2020. Vol. 14. №3. P. 112–129. (doi: 10.21685/1680-0826-2020-14-3-2). Изображения обнаруженных таксонов и исследованные биотопы показаны на слайде 8 Приложения. Было проведено детальное переописание малоизученного вида раковинных амеб Difflugia australis Playfair (1918) из субтропических водоемов на юго-востоке Китая. Difflugia australis, впервые описанная Playfair (1918), имеет уникальный морфотип. Однако отсутствие детальных морфологических и морфометрических данных не позволяло надежно дифференцировать его от других близких видов. Основываясь на биометрических данных, мы переописали этот малоизвестный вида Difflugia australis отличается от других близких видов (D. bacillariarum Perty, 1849 и D. elegans Penard, 1890), главным образом, сочетанием следующих особенностей: раковина широко-яйцевидная, с округлым фундусом и выпуклыми сторонами, сходящимися вниз, переходя в воротничок. Обычно раковинка более или менее асимметрична, одна сторона расширена больше, чем другая. Поверхность раковины состоит из плоских кремнистых пластин неправильной формы и размера, смешанных с мелкими песчинками; на аборальном конце раковинки располагаются один или два шиповидных отростка; воротничок образован небольшими пластинками одинакового размера. Частотное распределение как общей длины, так и ширины раковинки указывает на то, что это мономорфный вид с низкой изменчивостью. Статья с результатами опубликована: Ndayishimiye J.C., Nyirabuhoro P., Wang W., Mazei Yu., Yang J. Morphology of testate amoeba Difflugia australis (Playfair, 1918) Gautier-Lièvre et Thomas, 1958 from a subtropical reservoir (southeast China) // Zootaxa. 2020. Vol. 4890 № 1. P. 97–108. (doi: 10.11646/zootaxa.4890.1.5). Изображения переописанного таксона показаны на слайде 8 Приложения. 3. СТРУКТУРА СООБЩЕСТВА РАКОВИННЫХ АМЕБ В ПАРКАХ МОСКВЫ В пробах, отобранных в летний сезон 2020 года в парках Москвы, было насчитано 7886 раковинок, относящихся к 90 видам раковинных амеб из 26 родам. Самыми многочисленными таксонами (с относительной численностью к общему количеству более 5%) были Trinema lineare (19,2%), Plagiopyxis declivis (8,4%), Euglypha rotunda (7,3%), Centropyxis aerophila (6,4%), Cryptodifflugia oviformis ( 5,8%), Phryganella acropodia (5,2%) и Centropyxis aerophila sphagnicola (5,1%). Наиболее распространенными таксонами (наблюдаемыми в 70% проб) были Centropyxis aerophila (81%), Trinema lineare (77,8%), Euglypha rotunda (76,2%) и Centropyxis aerophila sphagnicola (73%). 22 таксона были редкими и были обнаружены только в одной пробе. Количество таксонов на пробу варьировало от 2 до 30 со средним значением 13,8 ± 5,2 (стандартное отклонение; n = 63). Кривая общего накопления видов (см. слайд 10 Приложения) выходит на плато, что свидетельствует о том, что изученная выборка позволила обнаружить почти все виды в районе исследования. Оценки общего видового богатства раковинных амеб в парках на исследуемой территории, сделанные разными методами, варьируются от 99 до 123 таксонов. Общее количество таксонов в каждом парке различалось и было максимальным в Солдатенковском парке (58) и Аптекарском саду (57) (см. слайд 10 Приложения). Эти парки либо достаточно большие, со значительной долей относительно нетронутых участков (Солдатенковский парк), либо характеризуются большим разнообразием растений, поддерживаемым деятельностью человека (Аптекарский сад) в течение длительного времени. Минимальное общее количество таксонов определено в парках Воронцовский (44) и Сокольники (46), вероятно, потому, что эти парки интенсивно эксплуатируются и расположены в густонаселенных жилых районах. Общее количество таксонов также различается среди разных исследованных биотопов (см. слайд 10 Приложения), будучи максимальным в донных отложениях пруда (60 таксонов) и снижается в ряду от мхов к дуплам деревьев и почвам. В целом, такого результата можно было ожидать, т.к. степень увлажнения является одним из важнейших факторов, определяющих распространение первичноводных простейших. Несколько неожиданным оказался результат, что видовое богатство в почвах характеризовалось меньшим видовым богатством по сравнению с дуплами деревьев. Это, вероятно, может указывать на то, что почвенные биотопы более чувствительны к негативным последствиям урбанизации. Результаты анализа главных компонент показывают, что первые две оси объясняют 22% общей изменчивости видового состава сообществ раковинных амеб (см. слайд 11 Приложения). Первая главная компонента в основном связана с различиями в видовом составе корненожек из донных отложений прудов (справа) и из мхов (слева), тогда как сообщества из почв и дупел находились посередине и не отличались друг от друга. Сообщества раковинных амеб в донных отложениях прудов характеризовались присутствием таксонов из родов Arcella, Centropyxis и Difflugia (см. слайд 11 Приложения). Моховые сообщества характеризовались присутствием небольших по размеру ксерофильных таксонов Euglypha spp., Trinema companatum, Assulina muscorum, Corythion dubium, Trinemal penardi, Valkanovia deliculata и др. В почвенных и древесных сообществах преобладали Trinema lineare, Cryptodifflugia spp. и Trinema enchelys. Пробы, отобранные по аналогичной схеме в парках Сямыня, переданы (несмотря на сложности, связанные с эпидемиологической обстановкой) для проведения микроскопического анализа в Россию. Результаты работы будут представлены в итоговом отчете. 4. РАЗНООБРАЗИЕ СООБЩЕСТВА ГОЛЫХ АМЕБ, МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ ГОЛОЙ АМЕБЫ PARADERMAOEBA VALAAMO В 2020 году изучали видовое разнообразие и провели первые оценки численности голых амеб в пробах верхнего слоя донного грунта, отобранных из водоемов трех парков в черте г. Москва – Измайловский парк (Собачий пруд), парк Сокольники (Верхний Олений пруд), Аптекарский сад (Аптекарский пруд). Для количественного и качественного учета голых амеб пробы были высеяны для формирования MPN-серий по методикам, описанным Garstecki and Arndt (2000) и Smirnov (2002). Количественный учет амеб провели в сериях по 50 чашек Петри (60 мм чашки, жидкая среда 0.025 WG на основе PJ как оптимальная для подобных высевов; Smirnov 2003), по две повторности на пробу, с использованием аппроксимации, основанной на распределении Пуассона. Пробы просматривали с использованием инвертированного микроскопа Nikon TS100 и Leica DMI300, оснащенного фазово-контрастной оптикой. В ходе работы проводили первичное фото-документирование разнообразия, измерение клеток амеб, документировали строение и размеры ядра клетки, наличие кристаллов и иных цитоплазматических включений. При возможности изучали и документировали флотирующие формы амеб. Первичное определение амеб с точностью до родов и, где возможно, видов проводили, используя определители Page (1988; 1991), последние доступные сводки и атласы видов (Rogerson and Patterson 2000; Smirnov and Brown 2004). Для более детального исследования клетки амеб переносили на предметные стекла и фото-/видео-документировали с использованием микроскопа Leica DM2500, оснащенного фазовым контрастом и контрастом Номарского. Параллельно с этими работами устанавливали клональные культуры обнаруженных организмов на жидких и агаризованных средах. Для молекулярных исследований изолировали одиночные клетки амеб, которые отмывали в нескольких сменах стерильной среды PJ после фильтрации (Millipore 0.2 мкм). ДНК из клеток выделяли, используя Arcturus PicoPure DNA isolation kit (Thermo Scientific). Выделенную ДНК использовали как матрицу для ПЦР или для полногеномной амплификации. Последнюю выполняли с Repli-G single cell DNA amplification kit (Qiagen). Полученные продукты использовали как матрицу для ПЦР интересующих нас генов или (в случае если обычная ПЦР результатов не давала) как материал для полногеномного секвенирования, выполняемого с использованием NGS (секвенатор Illumina 2500). Полученные сиквенсы обрезали и редактировали при необходимости. Далее их проверяли и первично отбраковывали контаминанты, используя поиск в Генбанке (BLASTn). Сиквенсы, показавшие аффилиацию c Amoebozoa или, по крайней мере, не показавшие существенного сходства с известными организмами из других групп, выравнивали, используя eukaryote-wide выравнивание, содержащее около 300 сиквенсов гена рРНК представителей всех крупных групп эукариот. Далее по этому выравниванию строили ML дерево (RaxML) и отбраковывали сиквенсы, которые были аффилированы с аутгруппой или иными кладами, нежели Amoebozoa. После этого оставшиеся сиквенсы для каждого вида собирали в контиги, используя программное обеспечение CodonCode, проверяли на отсутствие признаков генетических химер, встраивали в выравнивание гена рРНК Amoebozoa, проводили филогенетический анализ и оценку степени сходства сиквенсов с ближайшими выявленными соседями. Сводные результаты количественного и качественного учета амеб в пробах из трех исследованных прудов представлены в Таблице 1 (см слайд 12 Приложения). Наиболее бедным по фаунистическому составу оказался Аптекарский пруд, примерно одинаково богатыми видами – Собачий и Олений пруды. Общая численность амеб в 1 мл донного грунта изменялась почти в два раза между пробами из одного и того же пруда, что может говорить о достаточно высоком уровне гетерогенности условий в этих местообитаниях. Максимальное количество видов, выделенных из одного местообитания – Оленьего пруда – 16. Среди обнаруженных видов большинство представляют собой новые для науки виды и должны быть систематически описаны. Некоторая часть выявленного разнообразия проиллюстрирована на слайде 13 Приложения. Уверенно идентифицировать удалось лишь пять видов, что еще раз говорит об очень низком уровне изученности голых амеб в природных местообитаниях, в особенности на территории РФ. Для девяти видов были получены полные или частичные сиквенсы генов 18S рРНК. Эти данные подтвердили результаты, полученные на морфологическом уровне. Полученные сиквенсы в большинстве группируются с уже известными родами амеб, однако в их пределах достоверно представляют собой рРНК новых для науки видов. В рамках работы по описанию подобных видов подготовлено описание нового вида рода Leptomyxa. Выделенные из исследованных проб культуры уже известных видов позволили также уточнить уже имеющиеся и получить новые данные. Проведено первое современное светомикроскопическое исследование и опубликованы новые данные по виду Paradermamoeba valamo (см слайд 14 Приложения). В частности, показано, что трихоцисто-подобные тела по всей видимости специфичны для этого рода амеб и имеются у всех изолятов. Показана хорошая корреляция светомикроскопических и ультраструктурных данных по этому виду амеб. По этим данным опубликована статья Smirnov A.V., Kulishkin N.S., Surkova A.A., Mesentsev Y.S., Bondarenko N.V., Nassonova E.S., Mazei Yu.A. Molecular phylogeny of Paradermamoeba valamo (Amoebozoa, Discosea, Dermamoebida) // Protistology. 2020. Vol. 14. №4. P. 219–226. (doi: 10.21685/1680-0826-2020-14-4-1). Всего в 2020 году получены светомикроскопические данные (включая необходимую морфометрию) со всех выделенных штаммов и подготовлен рабочий атлас видов амеб изучаемых местообитания, для ультраструктурного исследования подготовлены заливки 5 видов амеб. Молекулярные данные получены для 9 изолятов, все они оказались новыми для науки видами. Общее разнообразие и численность амеб, полученные в результате работ в 2020 году, в целом конгруэнтны с немногочисленными имеющимися данными о разнообразии и обилии голых амеб в природных местообитаниях (cм. Smirnov 2001; 2002). Существенная разница в количестве амеб, измеренном на 1 мл осевшего грунта, скорее всего, должна быть объяснена гетерогенным распределением амеб в микромасштабе. Аналогичная гетерогенность в распределении амебоидных протистов была выявлена в донных грунтах солоноватоводных местообитаний (Smirnov 2002). 4. ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ МЕТАГЕНОМНОГО АНАЛИЗА Для оценки разнообразия амеб методом анализа проб тотальной ДНК из всех полученных проб грунта из прудов парков Москвы немедленно после прибытия проб в лабораторию выделили пробы тотальной ДНК, используя Power Soil DNA Isolation Kit. Полученные образцы показали неожиданно низкие концентрации ДНК (0,2-14 ng/mkl). Этого количества ДНК в большинстве случаев недостаточно для приготовления репрезентативной библиотеки для NGS секвенирования. Мы получили шесть образцов ДНК, из них в двух концентрация ДНК была ниже 0.2 ng/мл. Эти образцы в дальнейшей работе не использовали. Мы провели амплификацию фрагментов гена рРНК из оставшихся четырех образцов и анализ разнообразия ампликонов путем молекулярного клонирования из двух образцов - Олений №1 и Собачий №1 (по 288 клонов (3х96), из них 262 и 243, соответственно, были успешно секвенированы). Среди полученных сиквенсов мы не выявили генов Amoebozoa. Были выявлены гены грибов (доминирующая группа) и гены зеленых растений, небольшая часть полученных сиквенсов представляла Cerсozoa и неидентифицированные последовательности. NGS-секвенирование подобных образцов с малым количеством ДНК возможно только при использовании китов типа NEBNext для малых количеств ДНК и одиночных клеток, включающих стадию амплификации тотальной ДНК, что для изучения разнообразия особого смысла не имеет. Основываясь на полученном результате, в 2021 году для выделения тотальной ДНК будет использован DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit (Quiagen), который на основании нашего недавнего опыта дает больший выход ДНК из почвенных проб, а выделение ДНК будет произведено из серии из 10 субпроб из каждой отобранной пробы. Впоследствии все препараты ДНК из одной пробы будут объединены, и результирующая ДНК сконцентрирована, используя вакуумный испаритель. Эта процедура должна в итоге дать на выходе препарат ДНК адекватной концентрации, пригодный для полноценного анализа методами NGS. Аналогичные пробы для проведения метагеномного анализа были обработаны из прудов города Сямыня и в настоящее время обрабатываются коллегами из Китая. Результаты метагеномного анализа московских и сямыньских образцов будут представлены в итоговом отчете по проекту.
2 15 марта 2021 г.-14 марта 2022 г. Этап 2
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".