ИСТИНА

Такие социально-значимые психические заболевания, как шизофрения, болезнь Альцгеймера и аутизм, характеризуются значительным ухудшением когнитивных функций. Кроме того, старение также сопровождается потерей памяти, недостаточностью внимания, трудностями в адаптации и пониженной познавательной способностью. Последние исследования показали, что потенциальными мишенями для лекарств, улучшающих когнитивные функции мозга, являются никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChR), особенно альфа7 типа, и GABAA-рецепторы, локализованные в гиппокампе и префронтальной коре. Создание модуляторов, избирательно действующих на отдельные подтипы этих рецепторов, является одним из перспективных подходов для разработки новых селективных лекарственных средств, нацеленных на улучшение когнитивных процессов. В качестве прообразов для подобных препаратов могут выступать природные аллостерические нейромодуляторы рецепторов ЦНС человека, например, белки семейства Lynx (Lynx-1 и Lypd-6). Однако, для рационального дизайна новых лекарственных препаратов на основе белков Lynx необходимы дополнительные фундаментальные знания, а именно: описание влияния нейромодуляторов на различные когнитивные процессы, данные о биохимических эффектах нейромодуляторов в мозге, а также детальное понимание механизмов взаимодействия лиганд-рецептор на молекулярном уровне. В ходе выполнения проекта планируется впервые охарактеризовать модулирующее действие рекомбинантных препаратов белков человека Lynx-1 и Lypd-6 и их мутантных вариантов на GABAА-рецепторы. Будут определены подтипы этого рецептора, являющиеся мишенями исследуемых нейромодуляторов. Следует особо отметить, что GABAA-рецепторы являются новой, ранее не изученной мишенью белков семейства Lynx. Кроме того, впервые будет изучено влияние Lypd-6 и его мутантных вариантов на работу различных подтипов nAChR. В работе будут использованы как методы электрофизиологии на срезах мозга крысы, культурах первичных нейронов крысы и ооцитах Xenopus laevis, так и методы экстракции отдельных субъединиц nAChR и GABAА-рецепторов из препаратов коры мозга человека с помощью магнитных частиц с иммобилизованными на их поверхности молекулами нейромодуляторов. В результате выполнения проекта будет описан механизм регуляции работы nAChR и GABAА-рецепторов нейромодуляторами Lynx-1 и Lypd-6 и предложены мутантные варианты Lynx-1 и Lypd-6, обладающие направленной специфичностью и модулирующей активностью. Влияние нейромодуляторов Lynx-1 и Lypd-6 и их мутантных вариантов на различные когнитивные процессы впервые будет исследовано в поведенческих тестах с лабораторными животными (крысами), что позволит установить взаимосвязь между изменениями в работе нейрорецепторов и когнитивными функциями мозга. Кроме того, планируется исследовать влияние Lynx-1 на нейротоксическое действие бета-амилоидного пептида (1-42) на культуре первичных нейронов и провести сравнение влияния Lynx-1 на когнитивные функции здоровых и трансгенных мышей, моделирующих болезнь Альцгеймера. Это позволит оценить принципиальную возможность применения препаратов на основе Lynx-1 для купирования нейротоксического эффекта бета-амилоидного пептида, наблюдаемого при болезни Альцгеймера. Таким образом, в процессе выполнения проекта будет получен ряд уникальных результатов, не имеющих мировых аналогов. Результаты исследования будут интересны не только с фундаментальной точки зрения, но, в перспективе, могут быть полезны при создании новых биомедицинских препаратов направленного действия, способных значительно улучшить качество жизни людей, страдающих когнитивными дисфункциями при старении и ряде нейродегенеративных и психоневрологических заболеваний.

The socially significant mental illnesses such as schizophrenia, Alzheimer's disease (AD) and autism are characterized by a significant impairment of cognitive functions. The aging is also accompanied by loss of memory and attention, difficulty in adaptation and reduced cognitive ability. Recent studies revealed nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), especially of alpha7 subtype, as the potential targets for the drugs that improve the cognitive functions of the brain. The other potential target for treatment of cognitive disorders is the GABAA-receptors located in hippocampus and prefrontal cortex. One of the most promising approaches for the development of new drugs aimed at improving cognitive processes is the creation of modulators, selectively acting on the individual subtypes of these receptors. As a prototype for such drugs could be used natural allosteric modulators of the CNS receptors, e.g. human proteins Lynx-1 and Lypd-6 belonging to Lynx family. The rational design of new biomedical compounds based on Lynx proteins require additional knowledge, namely the description of the influence of neuromodulators on different cognitive processes, data about biochemical effects of neuromodulators in the brain, as well as a detailed understanding of the mechanisms of ligand-receptor interactions at the molecular level. Within the frame of the proposed project we plan, for the first time, to characterize the modulating effect of recombinant analogues of human Lynx-1 and Lypd-6 and their mutant variants on the GABAA-receptors. We plan to determine target specificity of these neuromodulators and describe their effects on different subtypes of GABAA-receptors. It should be emphasized that GABAA-receptors represent new, recently proposed and previously uncharacterized target of proteins from Lynx family. In addition, for the first time, the interaction of recombinant Lypd-6 and its mutant variants with the various subtypes of nAChR will be studied. The electrophysiology study will be conducted using slices of rat brain, rat primary neuronal cultures, and Xenopus laevis oocytes. The extraction of individual nAChR and GABAA subunits from the human cortex preparations using magnetic particles with immobilized neuromodulators will be used to additionally assay Lynx-1 and Lypd-6 specificity. One of the main result of the project will be advanced knowledge of the mechanisms of allosteric modulation of nAChR and GABAA-receptors by Lynx-1 and Lypd-6 proteins. The new mutant variants of Lynx-1 and Lypd-6 having specific modulatory activity on the different subtypes of the receptors will be proposed. Within the frame of the proposed project we plan, for the first time, to characterize the influence of Lynx-1 and Lypd-6 and their mutants on cognitive processes using different behavioral tests on laboratory animals (rats). These experiments will permit to delineate the relationship between the changes (modulation) of the receptors function and cognitive functions of the brain. In addition, we plan to investigate the effects of Lynx-1 on the neurotoxic activity of beta-amyloid peptide (1-42) on the culture of primary neurons. The influence of the Lynx-1 on cognitive functions of healthy animals and in the mouse model of AD will be investigated. This study will assess the possibility to use preparations based on Lynx-1 protein for reduction of neurotoxic effects of beta-amyloid in AD. Thus, during implementation of the project we plan to obtain a number of unique results, not having analogues in the world. The results will be interesting not only for the basic studies in the field of neuroscience, but in the long term, can be useful for creation of new selective biomedical compounds (drugs), which could significantly improve the quality of life for people suffering from cognitive dysfunctions connected with aging or with the neurodegenerative and neuropsychiatric diseases.

Заявленный в проекте план работы на год 1) Методами электрофизиологии охарактеризовать модулирующее действие Lynx-1 на тонические токи, опосредованные GABAА-рецепторами, содержащими δ и α5 субъединицы; 2) Методами электрофизиологии на срезах мозга крысы охарактеризовать модулирующее действие Lypd-6 и Lypd-6b на nAChR; 3) Методами компьютерного моделирования построить модель комплекса Lypd-6b/nAChR. 4) Исследовать влияние Lypd-6 на различные когнитивные процессы в поведенческих тестах, методами электрофизиологии на срезах мозга животных, а также путем анализа генной экспрессии маркерных белков на лабораторных животных (мышах); 5) Исследовать влияние Lynx-1 на когнитивные функции трансгенных животных, моделирующих болезнь Альцгеймера (в поведенческих тестах, методами электрофизиологии на срезах мозга животных, а также путем анализа генной экспрессии маркерных белков), и сравнить полученные данные с данными, полученными для здоровых мышей; 6) Обобщить полученные результаты и предложить варианты нейромодуляторов, обладающие избирательной модулирующей активностью по отношению к отдельным подтипам nAChR и GABAА-рецепторов, которые в перспективе могли бы послужить прообразами для создания лекарственных средств, улучшающих когнитивные функции.

Проект посвящен исследованию роли нейропептидов Lynx1 и Lypd6 в функционировании мозга в норме и патологии. Для достижения целей проекта были получены десятки миллиграмм водорастворимых вариантов Lynx1 (ws-Lynx1), Lypd6а (rLypd6a) и Lypd6b (rLypd6b). Для изучения роли Lynx1 в когнитивных процессах, мы исследовали его функцию ex vivo и in vivo. Инкубация интактных срезов коры с водорастворимым вариантом Lynx1 (ws-Lynx1) ex vivo приводила к увеличению амплитуды ацетилхолин-индуцированного тока на α7-nAChR рецепторах. Для исследования in vivo было опробовано 2 подхода для введения водорастворимого варианта Lynx1 (ws-Lynx1) в мозг: интраназально и внутрижелудочково через предварительно вживленные канюли (был использован флуоресцентно-меченый вариант ws-Lynx1). Оба способа введения показали примерно одинаковую эффективность проникновения Lynx1 через гематоэнцефалический барьер со специфическим накоплением в коре, гиппокампе и мозжечке. Таким образом, интраназальное введение было выбрано для дальнейшего исследования как неинвазивный способ доставки ws-Lynx1 в мозг животных. Для серии поведенческих тестов на мышах («приподнятый крестообразный лабиринт», «ротарод», «открытое поле», а также тест на обонятельную память) было использовано 4 группы мышей (12-13 мышей в каждой группе), которым в течение 2х недель вводили физ-раствор (vehicle), ws-Lynx1, MLA и MLA+ ws-Lynx1. MLA, вводимый внутрибрюшинно, использовали как специфический ингибитор α7-nAChR, моделирующий ухудшение когнитивной функции. В тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» была выявлена анксиолитическая активность ws-Lynx1. Под действием MLA наблюдалось значительное ухудшение моторной памяти, а совместный прием MLA и Lynx1 значительно компенсировал это ухудшение и приводил к показателям, аналогичным для мышей, получавших физ-раствор или ws-Lynx1. Нарушение обонятельной памяти у людей с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера (БА) и другие, приводит к потере их способности различать запахи. Также как и в случае моторной памяти, наблюдалось ухудшение обонятельной памяти под действием MLA, и совместное применение MLA и ws-Lynx1 восстанавливало обонятельную память до контрольного уровня. Прием ws-Lynx1 приводил к увеличению в срезах гиппокампа длительной потенциации (LTP), лежащей в основе механизмов синаптической пластичности. Напротив, введение MLA значительно ингибировало LTP. Совместное введение MLA и ws-Lynx1 восстанавливало LTP до контрольного уровня. Коэффициент парной фасилитации (PPF), параметр, характеризующий вероятность высвобождения нейротрансмиттера, был значительно увеличен у мышей, получавших ws-Lynx1, по сравнению с животными, получавшими физ-раствор, что указывает на активацию пресинаптических α7-nAChR рецепторов под действием ws-Lynx1. На срезах интактных мышей, инкубированных в среде с добавлением ws-Lynx1, также наблюдалось увеличение LTP и коэффициента парной фасилитации. Таким образом, впервые показано, что ws-Lynx1 модулирует синаптическую пластичность, активируя пресинаптические α7-nAChR, что в итоге приводит к активации постсинаптических глутаматных рецепторов. Мы предположили, что ws-Lynx1 может иметь «терапевтический» эффект и компенсировать угнетение когнитивной функции при БА. В качестве модели БА использовались восьмимесячные мыши 2xTg-AD, ко-экспрессирующие белок-предшественник химерного мыши/человека (Mo/HuAPP695swe) и мутантный человеческий пресенилин 1 (PS1-dE9). Три группы по 8-13 животных в каждой группе: трансгенные мыши (2xTg-AD), принимающие 3 недели интраназально физ-раствор или ws-Lynx1 и нетрансгенные однопометники (Tg-), принимающие физ-раствор, были подвергнуты батарее поведенческих тестов. Для мышей 2xTg-AD наблюдался повышенный уровень тревожности и уменьшение исследовательской активности в тестах «крестообразный приподнятый лабиринт» и «открытое поле». Прием ws-Lynx1 возвращал исследовательскую активность и тревогу, вызванную новой обстановкой, до уровня, наблюдаемого для мышей Tg-. Ухудшение обонятельной памяти, наблюдаемое у мышей 2xTg-AD, также компенсировалось приемом ws-Lynx1. Исследование рабочей памяти мышей с использованием автоматической системы PhenoMaster, показало, что прием препарата ws-Lynx1 восстанавливает способность 2xTg-AD животных к обучению. Для мышей 2xTg-AD наблюдалось значительное снижение LTP в срезах гиппокампа, которое восстанавливалось до контрольного уровня при приеме ws-Lynx1. Уровень синаптофизина (пресинаптического везикулярного белка) у 2xTg-AD животных был понижен на ~ 30-40% как в области гиппокампа, так и в коре. Прием ws-Lynx1 значительно уменьшал потерю синаптофизина в CA3 области мышей 2xTg-AD. При этом изменения числа амилоидных бляшек в коре и гиппокампе при терапии ws-Lynx1 не наблюдалось. Методами ПЦР в реальном времени показано увеличение экспрессии генов α7-nAChR и эндогенного Lynx1 в коре мышей 2xTg-AD, получавших ws-Lynx1, по сравнению с 2xTg-AD животными, получавшими физ-раствор. Кроме того, в коре 2xTg-AD мышей наблюдалось увеличение экспрессии пептида-предщественника бета амилоида, которое значительно снижалось при приеме ws-Lynx1. Показано, что β-амилоидный пептид Aβ1-42 снижает уровень мРНК Lynx1 в первичной культуре нейронов коры головного мозга крысы, и это снижение связано с активацией N-концевой киназы c-Jun (JNK). Cнижение уровня экспрессии Lynx1, равно как и нарушение долговременной потенциации, лежащей в основе механизмов синаптической пластичности, вызванные Aβ1-42, можно предотвратить, используя ws-Lynx1. Астроциты принимают важное участие в патогенезе БА. В ходе выполнения проекта впервые показано, что глиальные клетки экспрессируют Lynx1, и ws-Lynx1, взаимодействуя с α7-nAChR, снижает пролиферацию клеток астроцитомы U251 MG и глиобластомы A172 до 60% от контроля после 72-часовой инкубации. Впервые показано, что Lynx1 контролирует не только рост астроцитарных клеток, но и уменьшает секрецию воспалительного цитокина TNF-α. Мы изучили влияние хронического приема ws-Lynx1 на экспрессию и количество астроцитов в гиппокампе 2xTg-AD мышей. Методами конфокальной микроскопии обнаружено увеличение окрашивания астроцитов в гиппокампе 2xTg-AD мышей, принимавших ws-Lynx1, на астроцитарный маркер GFAP. В 2xTg-AD мышах наблюдалось увеличение числа астроцитов, которое компенсировалось приемом ws-Lynx1. Снижение числа астроцитов при одновременном увеличении интенсивности их окрашивания на GFAP свидетельствуют об увеличении объема астроцитов и, возможно, увеличении числа отростков. В рамках выполнения проекта впервые получен рекомбинантный вариант нейропептида Lypd6b, имеющего высокую степень гомологии с Lypd6 (он же Lypd6а). Методами ЯМР-спектроскопии впервые определена пространственная структура нейромодулятора Lypd6b, что позволило провести моделирование взаимодействие rLypd6b с внеклеточным доменом α7-nAChR и предсказать сайт связывания с рецептором. Методами электрофизиологии на ооцитах X. laevis и на срезах гиппокампа показано ингибирующее действие Lypd6а на α7-nAChRs Эффект ингибирования полностью обратим и наблюдается только в присутствии ацетилхолина. rLypd6b также ингибирует α7-nAChR, однако в 2 раза менее эффективно. Изучено влияние точечных мутаций rLypd6а с заменами в I, II и III петлях (E14А, D21A, E27A, E38A, E54A, D65A, R87A) на его ингибирующую активность, однако выявить остатки, важные для активности не удалось. Инкубация срезов гиппокампа мыши с Lypd6а значительно подавляла LTP в течение всего времени записи после HFS. Подобный эффект наблюдался при инкубации срезов с 10 нМ α-Bgtx, указывая на α7-nAChR как на возможную мишень. Эффекты Lypd a и Lypd b in vivo исследовали в батарее поведенческих тестов. Для этого мышам вживляли канюли, соединенные с осмотическими помпами, осуществлявшими непрерывную внутрижелудочковую инфузию Lypd a (n=12), Lypd b (n=11) или растворителя (20% ДМСО на фосфатно-солевом растворе). В тестах «открытое поле», «крестообразный приподнятый лабиринт», «светло-темная камера» и гипофагии была выявлена слабо выраженная анксиогенная активность пептидов. Обнаружено негативное влияние обоих пептидов на обонятельную память и распознавание новых объектов. В тесте на моторное обучение наблюдали выраженное угнетение обучения у мышей, получавших Lypd b, в отсутствие влияния Lypd a. Слабое снижение LTP у мышей, получавших rLypd6a и одновременно увеличение LTP у мышей, получавших rLypd6b, наблюдалось в течение всей записи после HFS. Методами ПЦР в реальном времени показано, что введение мышам Lypd6а приводит к увеличению экспрессии гена α7-nAChR. Введение мышам пептида Lypd6b вызывает увеличение транскрипции генов Lynx1, α7-nAChR и гена рецептора Wnt LRP6. Кроме того, введение мышам Lypd6b приводит к падению экспрессии генов эндогенных Lypd6a и Lypd6b. В рамках выполнения проекта впервые методами аффинной экстракции из гомогената коры головного мозга крысы показано взаимодействие Lynx1 с альфа5 и гамма1 субъединицами GABAA-рецепторов. Методами конфокальной микроскопии на культуре нейронов коры головного мозга крысы показана солокализация Lynx1 с α5 субъединицей GABAА-рецепторов. На ооцитах, экспрессирующих α5β3γ2-GABAА-рецепторы, методами patch-clamp впервые показано, что Lynx1 снижает амплитуду ГАМК-индуцированного тока. Кроме того, ws-Lynx1 снижает величину тонического тока ~ на 20 % в интернейронах CA1 str. radiatum гиппокампа, которые могут содержать внесинаптические рецепторы с субъединицами α5, γ2, δ. Полученные результаты указывают на ws-Lynx1 как на препарат, потенциально способный улучшать когнитивные процессы при нейродегенеративных заболеваниях. В качестве варианта нейромодулятора, способствующего улучшению когнитивных процессов может быть предложен пептид, содержащий фрагмент центральной петли Lynx1. Методами твердофазного химического синтеза синтезирован такой вариант и получены две его формы: замкнутая с помощью введенных дополнительных остатков цистеина на N- C-концы пептида, и не замкнутая. Получены предварительные данные о стимулирующем влиянии пептидов на LTP на срезах гиппокампа мышей. Таким образом, в ходе выполнения проведено обширное исследование функции нейромодуляторов Lynx1 и Lypd6, в том числе множество незапланированных экспериментов. Получен ряд уникальных результатов, позволяющих по-новому взглянуть на функцию эндогенных трехпетельных нейропептидов в мозге. Анализ полученных данных позволяет предположить, что нейромодуляторы Lynx1 и Lypd6, совместно экспрессирующие с α7-nAChR на мембранах нейронов, представляют собой положительные и отрицательные модуляторы, необходимые для тонкой настройки холинергической сигнализации.