ИСТИНА

Целью данного исследования является разработка нового мультитаргетного препарата для терапии глаукомы, способного эффективно снижать внутриглазное давление (ВГД). Глаукома – это широкий круг глазных заболеваний, характеризующихся нейропатией зрительного нерва, приводящей к слепоте. Современное развитие медицины существенно увеличило продолжительность жизни, позволяя людям доживать до того возраста, когда начинают активно проявляться возрастные изменения, в том числе и заболевания глаз. Так, в ходе естественного старения организма уже после 40 лет возрастает риск ухудшения зрения, связанный с развитием глаукомы. По прогнозам, к 2020 г эта болезнь затронет более 76 млн человек во всем мире (Yih-Chung Tham et.all //Global Prevalence of Glaucoma and Projections of Glaucoma Burden through 2040// Ophthalmology, V. 121, №11, P. 2081–2090, 2014 http://dx.doi.org/10.1016/j.ophtha.2014.05.013). К причинам возникновения глаукомы помимо воспалительных процессов относят заболевания нервной системы, гипертонию, сахарный диабет и пр. Хотя этиология глаукомы может сильно различаться (Alqawlaq, S., Experimental Eye Research, 2019, V.183, P. 88-97 https://doi.org/10.1016/j.exer.2018.11.005), при развитии этого заболевания всегда происходит общая характерная дегенерация ганглиозных клеток сетчатки (RGCs) и их аксонов, сопровождающаяся деградацией зрительного нерва. Несмотря на то, что глаукома в основе своей заболевание нейродегенеративное, на сегодняшний день терапия глаукомы заключается в первую очередь в снижении ВГД препаратами, улучшающими отток водянистой влаги из глаза, снижающими ее продукцию или обладающими комбинированным действием. При этом пациенты с диагностированной глаукомой вынуждены применять препараты постоянно, круглосуточно поддерживая внутриглазное давление на безопасном уровне. Для достижения максимального эффекта приходится применять смеси препаратов различного действия, периодически меняя лекарственные средства во избежание развития привыкания и снижения их эффективности. Поэтому поиск новых соединений, сочетающих способность снижать внутриглазное давление с нейропротекторной активностью, является актуальной задачей. Известно, что гормон мелатонин и его аналоги являются молекулами, обладающими необходимыми свойствами. Несмотря на выраженный нейропротекторный эффект, основное действие мелатонина в организме связано с регуляцией циркадных циклов, например, циклов сна-бодрствования. Поэтому мелатонин в настоящее время используется в качестве снотворного препарата, а более широкому внедрению мелатонина в медицинскую практику препятствует его быстрый метаболизм в организме, особенно в светлое время суток, а также неселективность его действия. В то же время было показано, что мелатониновые рецепторы локализованы в отделах глаза и играют существенную роль в регуляции его нормальной функции, что позволяет рассматривать их как эффективные мишени для комплексной терапии глазных болезней. При этом снотворный эффект мелатонина связан преимущественно с активацией MT1,2 рецепторов, в то время как активация МТ3 рецептора, представляющего собой фермент хинонредуктазу 2, не приводит к сонливости и в то же время позволяет эффективно снижать внутриглазное давление, как было продемонстрировано на примере МСА-NAT. Поэтому поиск новых эффективных аналогов мелатонина и изучение возможности их применения для лечения заболеваний глаза является важной и актуальной задачей. Задачей данного проекта является дизайн и синтез новых мультитаргетных препаратов двойного действия, сочетающих свойства лигандов мелатониновых рецепторов с аффинностью к другим мишеням, отвечающим за снижение внутриглазного давления. Данный эффект может быть достигнут как за счет ковалентного связывания через линкер подходящей длины лигандов мелатониновых рецепторов с известными эффективными соединениями, снижающими ВГД, так и за счет дизайна новой молекулы на основе лиганда мелатонинового рецептора, обладающей аффинностью сразу к нескольким целевым белковым мишеням.

The modern development of medicine has significantly increased life expectancy, allowing people to live to the age when age-related changes begin to actively manifest, including eye diseases. So, in the course of natural aging of the body, after 40 years, the risk of visual impairment associated with the development of glaucoma increases. By 2020, the disease is projected to affect over 76 million people worldwide. Despite the fact that glaucoma is basically a neurodegenerative disease, today glaucoma therapy consists primarily in lowering IOP with drugs that improve the outflow of aqueous humor from the eye, reduce its production, or have a combined effect. At the same time, patients with diagnosed glaucoma are forced to use drugs constantly, maintaining intraocular pressure at a safe level. To achieve the maximum effect, it is necessary to use mixtures of drugs of various actions, periodically changing the drugs in order to avoid the development of addiction and reduce their effectiveness. Therefore, the search for new compounds that combine the ability to reduce intraocular pressure with neuroprotective activity is an urgent task. It can be assumed that the development of new multitarget drugs with affinity for several key molecular targets should become a logical step in the search for a solution to the problem of low efficacy of glaucoma monotherapy. The aim of this project is an interdisciplinary study, including molecular design in silico, synthesis and study of biological activity in vitro and in vivo of new multitarget drugs for drug therapy of glaucoma based on melatonin analogs containing a 2-oxindole fragment. Comprehensive studies of this kind have not been carried out in the world until now. It is expected that due to the activation of melatonin receptors, these compounds will not only effectively reduce intraocular pressure, but also have a neuroprotective effect, which is important in the treatment of this disease. During the implementation of this project, the synthesis and study of the biological activity of new derivatives of 2-oxindole containing groups necessary for improved binding to melatonin receptors and structural fragments of carbonic anhydrase inhibitors and β-blockers will be carried out. It is assumed that these multitarget compounds will combine a hypotensive effect with pronounced antioxidant and neuroprotective properties characteristic of ligands of melatonin receptors. Thus, as a result of the project, an approach will be implemented to create an innovative complex action drug for the treatment of glaucoma.

Будет проведено молекулярное моделирование сайта связывания хинонредуктазы 2 c оксиндолами, содержащими в разных положениях фармакофорные группы, обеспечивающие аффинность к карбоангидразе (например, NH2SO2-Aryl-) и бета-адренорецепторам (например, tBuNHCH-CH(OH)-CH2-O-). и осуществлен выбор дальнейших оптимальных модификаций. Будет варьироваться вид, положение фармакофорных групп и линкер, связывающий их с 2-оксиндолом. Также для хиральных 2-оксиндолов будет осуществлен выбор оптимального для связывания с рецептором энантиомера. Для всех выбранных соединений будет также проведено компьютерное моделирование связывания с карбоангидразой и бета-адренорецептором с целью выбора оптимальных структур для дальнейшего синтеза. 2. Будет разработана основная синтетическая стратегия для целевых модификаций и синтезировано несколько соединений, предположительно обладающих свойствами лигандов хинонредуктазы 2 (мелатонинового рецептора МТ3 подтипа) и бета-адреноблокатора или ингибитора карбоангидразы. 3. Будет изучена антиоксидантная активность полученных соединений in vitro. Предполагается, что антиоксидантные свойства связаны с нейропротекторной активностью мелатонина и его аналогов. 4. Для полученных новых гибридных структур будет изучена их способность снижать внутриглазное давление на кроликах 5.Будет проведен QSAR анализ полученных данных для планирования дальнейших работ и подготовлены материалы для публикации результатов

Данная работа является продолжением исследования, начатого в 2011 г под руководством академика РАН Зефирова Н.С. и посвященного синтезу и изучению биологической активности новых лигандов мелатониновых рецепторов. За время работы по данной тематике коллективом были определены основные структурные модификации, обеспечивающие аффинность к разным подтипам мелатониновых рецепторов. Заключен договор о сотрудничестве МГУ с НИИ Глазных Болезней им. Гельмгольца и в течение 6 лет ведется совместная работа по изучению возможности использования полученных соединений для лечения разных глазных болезней, в том числе глаукомы, увеита и ретинопатии недоношенных. В ходе работы для оценки перспективности той или иной модификации соединений и разработки стратегии их синтеза коллектив проводит молекулярное моделирование связывания потенциальных лигандов с активным сайтом ферментов с использованием программного обеспечения AutoDock v. 4.2.5.1 и AutoDock Vina v. 1.1.2. Для осуществления синтетической части проекта в распоряжении коллектива имеется химическая лаборатория (2 полностью оборудованных помещения кафедры медицинской химии и тонкого органического синтеза химического факультета МГУ, содержащих в общей сложности 5 вытяжных шкафов, 4 роторных испарителя и другое необходимое оборудование), доступ к научным реферативным базам данных (Reaxys, Scifinder) и доступ к методам, необходимым для идентификации и контроля чистоты полученных соединений, таким как ЯМР, UV, ИК и MS спектроскопия, масс-спектрометрия высокого разрешения, рентгеноструктурный анализ. Также в распоряжении коллектива имеются биохимическая лаборатория и виварий на базе НИИ Глазных Болезней им. Гельмгольца, оборудованный для проведения экспериментов in vivo.

Согласно данным молекулярного моделирования было установлено, что для получения структур с заданной целевой активностью могут быть использованы различные азотсодержащие гетероциклы, содержащие фармакофорный циклический амид, например, производные 2-оксиндола. Таким образом, синтетическую часть работы по проекту можно разбить на 3 ключевых блока: 1) Синтез и функционализация новых производных 3-арилиденоксиндолов. 2) Синтез и функционализация новых производных 3-циано/3-карбоксиметил-2-оксиндолов, содержащих или не содержащих гидрокси-группу в положении 3. 3) Разработка удобного подхода введения дополнительных фармакофоров в гетероциклический каркас. Введение арильной группы в положение 5 согласно данным молекулярного моделирования должно обеспечить дополнительную афинность по отношению хинонредуктазе 2 за счет новых гидрофобных взаимодействий и р-р-стекинга с арил-содержащими аминокислотами белка или кофактором FAD. Кроме того, введение дополнительного арильного цикла позволило бы расширить круг новых сульфонамидных производных оксиндола, поскольку введение сульфонамидной группы непосредственно в оксиндольный цикл сопряжено с рядом трудностей и идет с низким выходом. Поэтому нами были синтезированы новые бифенильные производные оксиндолов с целью выбора оптимального варианта для дальнейшей модификации, и было показано, что они, вопреки результатам молекулярного моделирования, не проявляют ингибирующей активности по отношению к хинонредуктазе 2 и в большинстве своем не влияют на внутриглазное давление в тестах in vivo, возможно, ввиду низкой растворимости в воде. Тем не менее, наиболее водорастворимые сульфоновое и тиазольное производные проявили гипотензивный эффект. Нами была разработана удобная методика восстановления и выделения 5-амино-2-оксиндола с препаративным выходом, что открыло путь к созданию библиотеки новых аминопроизводных 2-оксиндола как путем ацилирования свободной амино-группы,так и путем восстановительного алкилирования. Растворимость новых бензиламинных производных оказалась выше, чем у биарильных производных и они проявили выраженный гипотензивный эффект in vivo. Для синтеза биоизостеричных оксиндолам бензимидазолонов, нами была предложена стратегия, основанная на синтезе бензимидазолонов из разнообразно замещенных по одному из атомов азота нитрофенилендиаминов. Синтез исходных N-замещенных 2-амино-4-нитроанилинов был осуществлен из соответствующих N-замещенных 2,4-динитроанилинов с использованием разработанной нами методики селективного восстановления орто-нитро группы с помощью дитионита натрия. На нескольких примерах нами показано, что модификация полученных 2-амино-4-нитроанилинов с использованием трифосгена и последующего восстановления нитро-группы позволяет получать новые бензимидазолоны с хорошим выходом. Ингибирующая активность полученных оксиндолов по отношению к ферменту хинон оксидоредуктазе 2, а также противовоспалительная активность на клетках макрофагов мышей была изучена совместно с коллегами из ВолгГМУ (группа академика Спасова А.А.). Найдены соединения, обладающие выраженной антиоксидантной и противовоспалительной активностью. При этом активные соединения являются абсолютно нетоксичными по отношению к макрофагам мышей в концентрациях 100 мкМ, но подавляют синтез NO вплоть до 82%. В ходе проделанной работы было впервые показано, что 3-арилиденоксиндолы могут являться не только лигандами хинонредуктазы 2, но и лигандами киназы гликогенсинтазы 3β, проявляя связанный с этим действием гипотензивный эффект in vivo. Найденные производные 2-оксиндола снижают ВГД на 27,3% относительно исходного уровня и являются перспективными соединениями для разработки новых антиглаукомных средств. Таким образом, нами впервые было показано, что возможно создание мультитаргетных арилиденоксинолов, действующих на NQO2 и GSK3b для снижения внутриглазного давления. Также была исследована активность полученных структур по отношению к альфа-глюкозидазе – одной и ключевых мишеней при лечении сахарного диабета – и было показано, что некоторые соединения обладают двойной активностью и по отношению к этому ферменту. Таким образом, полученные соединения могут быть использованы не только в офтальмологии, но и при лечении сахарного диабета и сопутствующих ему патологий, в том числе и офтальмологических.