ИСТИНА

Представляемый проект посвящён комплексному исследованию состава, структуры и значения микобиоты морского бентоса и оценке влияния нефтяного загрязнения на сообщества донных мицелиальных и дрожжевых грибов и грибоподобных страминопил в морях Российской Арктики. Акватории морей Северного Ледовитого океана, несмотря на огромное значение для природы и экономики России и мира в целом, пока остаются относительно слабоизученными по многим аспектам. В частности, сведения о составе и структуре такого важного для большинства исследованных экосистем эукариотного сапротрофного компонента – микобиоты в широком смысле, включающей грибы и грибоподобные организмы, для арктических морей фрагментарны и зачастую уже устарели. В настоящее время экосистемы Арктики испытывают постоянно возрастающую нагрузку со стороны человека, одним из важнейших факторов которой является нефтяное загрязнение. Именно сапротрофный блок, включая его грибной компонент, представляет собой главный механизм устойчивости экосистемы к поллютантам. В ходе реализации проекта, для выявления значения исследуемых организмов, впервые будет дана максимально полная, комплексная характеристика разнообразия грибов и грибоподобных страминопил морей Российской Арктики. Будут исследованы изменения в структуре микобиоты при нефтяном загрязнении. Для многих районов такие сведения даже об отдельных группах исследуемых организмов будут получены впервые. С помощью широкого спектра методов, включающих культуральные, прямые микроскопические и молекулярные (в том числе метагеномный анализ) впервые будет проведено комплексное исследование микобиоты ненарушенных и загрязнённых экотопов. Это даст как наиболее полное представление о сообществах грибов и грибоподобных, так и возможность сравнения результатов, получаемых при использовании различных методических подходов. Будет исследована способность выделенных культур к развитию и сохранению в экстремальных арктических условиях: особенности прорастания и сохранения жизнеспособности спор и роста колоний. Испытания будут проведены в модельных условиях лабораторных культур и специально разработанных экспериментальных установок в природе. Будет проведена оценка роста выделенных культур на углеводородах нефти с целью поиска штаммов с высоким биоремедиационным потенциалом. Изменения, происходящие в структуре микобиоты при нефтяном загрязнении будут оценены в серии экспериментов в условиях морского аквариума по оригинальной методике.

This project is devoted to a comprehensive study of the diversity, structure and significance of the marine benthic mycobiota and assessment of the effect of oil pollution on the communities of bottom mycelial fungi, yeasts and fungi-like straminopiles in the Russian Arctic seas. The Arctic Ocean, despite the great importance for the nature and economy of Russia and the world as whole, still remain relatively poorly studied in many aspects. Particularly, information on the composition and structure of an eukaryotic saprotrophic component, which is important for the majority studied ecosystems – mycobiota in wide extend, including fungi and fungi-like organisms – are fragmented and often already outdate for the Arctic seas. Currently, the arctic ecosystems era experienced an ever-increasing pressure from man, one of the most important factors of which is oil pollution. It is the saprotrophic block, including its fungal components, that represents the main mechanism of ecosystem resistance to pollutants. During the implementation of the project, in order to identify the significance of the studied organisma, for the first time, the fullest, most comprehensive description of the diversity of fungi and fungi-like straminopiles of the Russian Arctic seas will be given. Changes in the structure of mycobiota during oil pollution will be investigated. For many regions, such information, even about individual groups of the studied organisms, will be obtained for the first time. Using a wide range of methods, including cultural, microscopic and molecular, a comprehensive study of the mycobiota of the natural and polluted ecotopes will be carried out for the first time. This will give both the most complete information of thr communities of fungi and fungi-like organisms, as well as the possibility of comparing the results obtained using various methodological approaches. The ability of the isolated cultures to develop and preserve in extreme arctic conditions will be investigated (the characteristics of germination and preservation of viability of spores and colony growth). Tests will be carried out in model conditions of laboratory cultures and specially designed experimental facilities in natural ecotopes. The growth of isolated cultures on hydrocarbons will be assessed to search for strains with high bioremediation potential. Changes in teh mycobiota structure during oil pollution will be evaluated in experiment in marine aquarium using the original method.

Учитывая специфику микологических исследований, длительность многих процедур, и, зачастую, непредсказуемость по времени и результату, а также начало многих работ только в летнем полевом сезоне 2020 года, научные результаты за этот год будут носить в основном предварительный характер. Будет составлена коллекция культур неясного таксономического положения, выделенных из различных районов Северного Ледовитого океана, по которой уже точно можно будет судить о численности и обилии данных культур в различных образцах. Будет начата обработка посева из Баренцева моря, выделены культуры, проведена первичная морфолого-культуральная идентификация, что даст предварительные сведения о разнообразии грибов и грибоподобных в ненарушенных и антропогенно-загрязнённых локациях побережья Северного Ледовитого океана. Кроме того, можно будет судить об общей численности и соотношении грибов и грибоподобных в посевах. В то же время мы планируем полностью закончить работы по исследованию структуры грибной биомассы в этих же грунтах, включая обсчёт данных. Таким образом, к концу года мы будем иметь окончательные данные о содержании биомассы в этих грунтах. Осенью 2020 года будет закончена первая серия эксперимента по выживаемости спор грибов при замораживании. Результаты по этому этапу также будут готовы к концу года: мы будем знать процент спор, выживающих и способных прорасти после заморозки в течение полугода. В 2020 году мы планируем подготовить и сдать в печать рукопись по материалам с литорали Новой Земли. Материалы для метагеномного анализа будут подготовлены к осени 2020 года и сданы на анализ.

Участники коллектива в течение нескольких последних лет проводят работы по исследованию микобиоты арктических и субарктических морей. Авторами получены данные о видовом составе грибов в донных грунтах Белого, Баренцева, Карского и Чукотского морей; о разнообразии грибов, ассоциированных с бурыми водорослями-макрофитами субарктического Белого моря. С частью образцов, по которым мы планируем проводить исследования в рамках проекта, в настоящее время уже начаты работы. Проведены работы по исследованию микобиоты ненарушенных верховых болот северной подзоны тайги и переходных водоёмов побережья Белого моря. Все эти работы основывались на использовании культуральных методов, в которых авторы являются квалифицированными специалистами. Авторы проекта имеют опыт в микроскопических исследованиях биомассы грибов в морских грунтах, умеют выделять из грибов ДНК, готовить материал для секвенирования и анализировать полученные результаты. В ходе предыдущих работ с арктическими морскими грунтами были подобраны оптимальные условия культивирования таких образцов. Работы с грибоподобными организмами начаты участниками летом 2019 года, но уже определены методические особенности в таких работах. Работы с дрожжевыми грибами проводятся в сотрудничестве с коллегами – специалистами по данной группе. Авторами были разработаны и уже использовались схемы тестирования культур, в частности – тесты на прорастание спор, а также экспериментальная установка и схема опытов по прорастанию спор в условиях природного экотопа. Участники коллектива владеют техникой подводных погружений, необходимой для отбора проб и проведения экспериментов в природной среде. Члены коллектива публикуют свои работы в профильных российских и иностранных журналах; участвуют с устными и стендовыми докладами в российских и международных конференциях. За время работы членами коллектива успешно реализованы проекты РФФИ, в том числе в качестве руководителей, а также РНФ.

Важнейшие результаты, в соответствии с поставленными задачами: 1) Определить видовой состав и таксономическую структуру комплексов грибов и грибоподобных организмов в ненарушенных и загрязнённых нефтью локациях отдельных морей Российской Арктики По данной задаче первым значимым, на наш взгляд, результатом, является то, что грибы, способные к разложению углеводородов, были обнаружены в грунтах, в разной степени, загрязнённых углеводородами, в том числе, и относительно чистых. При этом, сообщества углеводородокисляющих грибов во всех случаях малочисленнее и менее разнообразны, чем сообщества сахароразрушающих (ниже численность, меньше число видов, ниже индексы разнообразия). Среди углеводородокисляющих грибов грунтов литорали Белого и Баренцева морей наиболее обильными были Penicillium chrysogenum и P. brevicompactum, среди сахароразрушающих – Pseudogymnoascus pannorum, Acremonium fuci и P. chrysogenum. Сообщество углеводородокисляющих грибов в исследованных условиях можно рассматривать как обеднённое и немного перестроенное сообщество сахароразрушающих. Вместе с тем, присутствие в относительно чистых грунтах грибов, способных к утилизации углеводородов, свидетельствует о высоком адаптационном потенциале микобиоты литорали (учитывая, кстати, неспецифичность ферментов, участвующих в разложении различных углеводородов, в частности – лакказ и пероксидаз). Высокая адаптивность может быть важна на случай различных катастрофических событий, связанных с разливами большого количества нефти и нефтепродуктов. Важнейшими факторами, влияющими на структуру сообществ грибов загрязнённых и относительно чистых локаций побережья Белого и Баренцева морей, были доля углеводородов от общей массы органического углерода (доля УВ от Сорг) в случае углеводородокисляющих, и локация отбора образцов – в случае сахароразрушающих. Отметим также, что численность сообществ как углеводородокисляющих, так и сахароразрушающих грибов связана с солёностью (в обоих случаях выше при пониженной солёности) и заилением (чем сильнее заиление – тем численность грибных пропагул выше), но слабо связана с большинством параметров загрязнения, кроме доли УВ от Сорг. Мы можем констатировать, что в исследованных условиях содержание основных нефтяных фракций – алифатических (АУВ) и полициклических ароматических (ПАУ) углеводородов слабо влияют как на численность, так и на структуру сообществ грибов. Возможно, это связано с тем, что на исследованной территории относительно небольшие дозы загрязнения присутствуют как постоянный фон, слабо ингибирующие рост грибов, и не являющийся ценным пищевым ресурсом. Вторым значимым результатом является выявление культивируемого и молекулярного разнообразия лабиринтуломицетов в грунтах литорали Баренцева моря. Такие результаты были получены впервые для арктических морских экотопов. Из 25 образцов (по 5 образцов в каждой точке) были выделены 40 культур лабиринтуломицетов. Численность в целом небольшая, на порядок и меньше, чем грибов. Но, как и в случае с грибами, численность связана с заилением (чем выше заиление – тем больше культур лабиринтуломицетов выделяется) и солёностью (чем она ниже – тем выше численность). Кроме того, численность лабиринтуломицетов оказалась связана с долей Сорг (чем она выше – тем больше численность), и не связана с параметрами углеводородного загрязнения. Разнообразие культивируемых лабиринтуломицетов оказалось низким: два морфотипа были идентифицированы до уровня вида: Thraustochytrium aureum и Ulkenia visurgensis, оба – впервые в Баренцевом море, хотя известны для Белого; предполагается наличие трёх неописанных видов в роде Aurantiochytrium и 2 предполагаемых вида из неизвестного пока рода семейства Thraustochytriidae. Молекулярное разнообразие лабиритуломицетов значительно превышает разнообразие их культивируемых форм. В соответствии с последовательностями гена SSU, было выделено 25 OTUs (Операционных Таксономических Единиц), среди которых присутствовали многочисленные последовательности, соответствующие некультивируемым и неидентифицируемым представителям класса, а также последовательности, соответствующие нескольким видам траустохитрид и лабиринтулид. В частности, были обнаружены довольно многочисленные последовательности видов, выделенных нами в культуру – Ulkenia visurgensis и Thraustochytrium aureum. Ещё один результат связан с изучением влияния различных факторов среды на микобиоту грунтов сублиторали относительно незагрязнённого участка в Белом море. Оценка видового богатства с помощью кумулятивной кривой и расчёта ожидаемого полного числа видов с поправкой Chao2, показала, что видовое разнообразие выявлено примерно на 81%. Важно, что было использовано большое число образцов – 50, и даже оно не позволило выявить микобиоту полнее. Учитывая, что на структуру сообщества заметно влияет год отбора, такая картина выявления видового разнообразия вполне объяснима высокой изменчивостью состава микобиоты. Итак, ординация сообществ грибов методом nMDS с тестом ANOSIM показала высокую значимость объединения групп по признакам года отбора и типа грунта, а также года отбора и типа экотопа. Таким образом, важнейшим фактором для формирования микобиоты является тип грунта, связанный с типом берега и наличием пресного стока. Кроме того, сообщества мицелиальных грибов в исследованных донных грунтах меняются год от года. Если первичные сведения о составе микобиоты были получены стандартным методом посева, то последующий анализ и статистическая обработка крайне редко применяются в морской микологии. Кроме того, в ходе данной работы были выявлены преобладающие виды (Tolypocladium cylindrosporum, Penicillium chrysogenum, Tolypocladium inflatum, Penicillium glabrum и анаморфа Pseudogymnoascus pannorum), а также виды, новые для морей Арктики и Субарктики. Работы с образцами грунтов из различных районов Арктики – литорали Шпицбергена, Земли Франца-Иосифа, Новой Земли и острова Шокальского, а также удалённых от берега районов морей Баренцева, Восточно-Сибирского и Лаптевых, мы можем резюмировать следующим образом. Численность грибных пропагул как в грунтах литорали арктических островов, так и в донных грунтах арктических морей невелика, и составляет единицы-десятки колоние-образующих единиц на грамм. В грунтах литоралей, как по численности, так и по разнообразию, преобладают мицелиальные аскомицеты, базидиомицеты (в том числе дрожжи) редки, мукоровые грибы единичны. В донных грунтах высока доля дрожжей, в части образцов они являлись преобладающей группой. Разнообразие микобиоты при этом высоко, и в большинстве случаев велика доля редких и единичных морфотипов. Во всех исследованных грунтах очень широко распространены различные трудноидентифицируемые, и в частности, стерильные, изоляты. Их доля может составлять до половины всех выросших колоний. При этом молекулярная идентификация зачастую не позволяет соотнести их последовательности ДНК (область ITS) с последовательностями известных видов. Доля таких идентификаций составляет всего около 20%, а все остальные последовательности можно отнести только к категориям более высоким – родам, порядкам, классам и даже выше. Всё это, во-первых, в очередной раз свидетельствует о недостаточности сведений в базах, и, во-вторых – о высоком потенциале арктических морей как источников неописанного пока разнообразия грибов. Вместе с тем, можно довольно чётко выделить доминирующие группы, что особенно заметно в грунтах литоралей. Наиболее обильным и разнообразным здесь является класс Leotiomycetes. Обилие обусловлено, в первую очередь, видом Pseudogymnoascus pannorum, а разнообразие – многочисленными стерильными формами. Также существенный вклад в разнообразие могут вносить представители классов Dothideomycetes и Sordariomycetes, а Eurotiomycetes в большинстве случаев заметно им уступает. Ещё один интересный момент связан с имеющимися в литературе данными о распространении идентифицированных нами с помощью молекулярных методов видов или родов. Среди идентифицированных видов есть часть довольно обычных и широко распространённых, например, из родов Alternaria и Phoma. Но есть также и те, которые раньше были известны из Антарктиды и / или высокогорных районов, считались местными эндемиками, и сейчас впервые обнаружены в арктических морях (например, Psychrophila antarctica и Mortierella antarctica). Или обнаружены не впервые (Cadophora luteo-olivacea, виды рода Thelebolus), но наши находки подтверждают возможность биполярного эндемизма для этих грибов. В целом, микобиоту грунтов литорали арктических островов можно характеризовать как малочисленную, но разнообразную, с преобладанием мицелиальных аскомицетов, с высокой долей представителей класс Leotiomycetes, из которых самым обильным, как правило, является Pseudogymnoascus pannorum. Для донных грунтов также характерна низкая численность микобиоты (в большинстве случаев – ниже, чем в грунтах литорали), но также и меньшее её разнообразие; здесь могут преобладать дрожжевые грибы, и, в отличии от литоральных грунтов, выше значение представителей класса Eurotiomycetes из мицелиальных. 2) Исследование приспособленности выделенных культур к существованию в условиях арктических морей Для реализации этой задачи, различными способами, были проверены многочисленные культуры распространённых в арктических морях видов грибов. В целом можно констатировать, что практически все изученные культуры являются психротолерантами, с узкими оптимумами солёности в пределах от 10 до 35 промилль. Тем не менее, мы можем связать большую успешность в экспериментах с большей ролью в сообществах микобиоты. В частности, уже упоминавшийся чрезвычайно обильный в грунтах литоралей арктических морей вид P. pannorum, являлся также наиболее успешным и в ростовых экспериментах, и в тесте на прорастание спор, и в экспериментах в условиях экотопа. 3) Исследование способности выделенных культур к утилизации нефтяных углеводородов Все протестированные культуры были способны разлагать углеводороды, хотя и в различной степени. Отметим, что низкую способность к этому показали изоляты облигатных морских грибов, в частности Acremonium fuci и Asteromyces cruciatus. Наиболее высокая активность была показана Penicillium chrysogenum – вида, наиболее обильного в сообществах углеводородокисляющих грибов грунтов литорали Белого и Баренцева морей. 4) Исследование влияние нефтяного загрязнения на микробные сообщества в модельных экосистемах Впервые было проведено исследование влияния углеводородного загрязнения на микобиоту грунта литорали субарктического моря в условиях модельной экосистемы. Мы выяснили, что в данных условиях изменение численности колоние-образующих единиц грибов зависит от концентрации загрязнителя: чем выше загрязнение – тем ниже численность. Причём, при низких дозах загрязнения (1% дизельного топлива) изменения численности недостоверны. Кроме того, изменения в видовом составе грибов также связаны с изменение концентрации загрязнителя: чем выше загрязнение – тем ниже разнообразие. При высоких дозах загрязнения, увеличивается доля видов рода Penicillium, в частности – P. chrysogenum, и снижается доля малочисленных видов.