ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Целью настоящего проекта является поиск и изучение новых механизмов автотрофной фиксации СО2 у термофильных прокариот, выявление модификаций уже известных путей автотрофной ассимиляции СО2 (в том числе новых), и исследование эволюции процессов первичной продукции органического вещества, играющих важнейшую роль в развитии и существовании жизни на нашей планете. В основные задачи проекта входит: (1) скрининг имеющейся коллекции термофильных прокариот на наличие в ней микроорганизмов, использующих модифицированные или неизвестные ранее пути автотрофной ассимиляции неорганического углерода; (2) выделение автотрофных термофильных прокариот из образцов природных термальных местообитаний в условиях, благоприятствующих развитию микроорганизмов с новыми путями ассимиляции СО2; (3) анализ полных геномов новых автотрофных изолятов с целью определения возможных путей ассимиляции ими неорганического углерода; 4) биохимическое подтверждение функционирования новых путей ассимиляции СО2 в выявленных микроорганизмах с предположительно новыми типами автотрофного метаболизма; (5) выявление генетических детерминант новых процессов, способных служить их маркерами и анализ баз данных для получения представления о распространенности новых механизмов; (6) радиоизотопный, метагеномный и при необходимости метатранскриптомный/метапротеомный анализ микробных сообществ термальных источников Камчатки, Курил и/или Байкальской рифтовой зоны с целью определения вклада новых механизмов ассимиляции СО2 в продукцию органического вещества.
Autotrophic CO2 fixation is one of the most important biosynthetic processes in nature. To date, six autotrophic CO2 fixation mechanisms are known, which reflects the diversity of the physicochemical parameters of the habitats and of the autotrophic organisms living in them. In this project, special attention is paid to thermophilic microorganisms that develop at high temperatures in natural thermal habitats and are represented by various (including the most ancient) phylogenetic groups in the Archaea and Bacteria domains. Thermophilic microorganisms are characterized by an extraordinary variety of biochemical processes, both of catabolic reactions, allowing the use of an unusually wide range of electron donors and acceptors, and of pathways of inorganic carbon assimilation into organic matter. For example, two of six mentioned above CO2 fixation pathways are known exclusively among thermphiles. The applicants team has at its disposal a large collection of phylogenetically and metabolically diverse autotrophic thermophilic prokaryotes, isolated from terrestrial and marine thermal habitats(collection of the Department of Biology of Extremophilic Microorganisms, FRC Biotechnology, RAS). Preliminary studies, including the analysis of the complete genomes, have revealed the presence of some genes, encoding proteins of various autotrophic CO2 fixation pathways in the collection strains, including both long known and recently discovered pathway variants. At the same time, the genomes of some of the autotrophic isolates lacked key genes of the known pathways of CO2 assimilation or harbored key genes of several pathways. The main goal of the project is the search for and study of new (alternative) pathways for autotrophic CO2 fixation and of possible variants of the already known pathways in thermophilic bacteria (and archaea). To achieve this goal it is supposed to perform: (1) screening of the available collection of thermophilic prokaryotes for the presence in it of microorganisms carrying out new modifications or new pathways of autotrophic assimilation of inorganic carbon; (2) isolation of thermophilic autotrophic prokaryotes from samples of natural thermal habitats under conditions favorable for microorganisms possessing new variations of the pathways of CO2 assimilation; (3) analysis of complete genomes of new autotrophic isolates in order to determine the pathways used by them to assimilate inorganic carbon; (4) biochemical confirmation of the functioning of new CO2 assimilation pathways in microorganisms with supposedly new types of autotrophic metabolism; (5) identification of genomic determinants of the new pathways that can serve as their markers and analysis of databases to get an idea of the occurrence and distribution of the new mechanisms; (6) radioisotopic, metagenomic and, if needed, metatranscriptomic/metaprotomic analyses of the microbial communities of hot springs of Kamchatka, Kuriles and/or the Baikal rift zone in order to determine the contribution of new CO2 assimilation mechanisms to organic matter production in these ecosystems. As a result of the project, knowledge about the mechanisms of autotrophic CO2 assimilation and about their ecological roles and evolutionary histories will be expanded.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 20 января 2020 г.-1 февраля 2021 г. | Изучение разнообразия путей автотрофной ассимиляции углерода у термофильных прокариот |
Результаты этапа: В первый год выполнения проекта был проведён скрининг коллекции термофильных прокариот Отдела биологии экстремофильных микроорганизмов ФИЦ Биотехнологии РАН, в результате которого, был создан список термофильных микроорганизмов, для которых ранее была показана способность расти автотрофно, но не раскрыты параметры этого процесса, такие как скорость роста, скорость и пути ассимиляции углекислоты и др. Наибольший интерес представляли 4 микроорганизма (каждый из которых был ранее описан коллективом исполнителей проекта как представители новых таксонов): • Desulfothermobacter acidiphilus штамм 3408-1 • Thermus sp. штамм PS18 • Tepidiforma bonchosmolovskayae штамм 3753O • Deferribacter autotrophicus штамм SL50 В ходе работы над проектом у трех из них способность расти автотрофно была детально исследована как на уровне фенотипов, так и на уровне генотипов. Были проведены эксперименты по культивированию в автотрофных условиях и определению скоростей роста, а также потребления субстрата. Для Thermus sp. штамма PS18 автотрофный рост также был подтвержден радиоизотопным методом по включению 14C-меченой углекислоты в органическое вещество клетки. В ходе работ по культивированию были улучшены протоколы приготовления сред и параметры культивирования, позволившие увеличить скорости автотрофного роста Геномы исследуемых микроорганизмов (кроме T. bonchosmolovskayae штамма 3753O, геном которого был секвенирован и собран в кольцевую хромосому ранее) были либо секвенированы либо досеквенированы с применением технологий Illumina и Oxford Nanopore, собраны до 1 хромосомы (за исключением Thermus sp. штамм PS18, который был собран до 3 скаффолдов), и аннотированы. Полученные геномные последовательности использовали для in silico реконструкции путей автотрофной фиксации CO2 у этих микроорганизмов. У всех них были обнаружены либо недавно описанные новые модификации обратимого ЦТК (roTCA) или цикла Кальвина, а у T. bonchosmolovskayae штамма 3753O предполагается абсолютно новый путь ассимиляции СО2. | ||
2 | 1 июня 2021 г.-10 февраля 2022 г. | Изучение разнообразия путей автотрофной ассимиляции углерода у термофильных прокариот |
Результаты этапа: На второй год проекта была проведена экспедиция на полуостров Камчатка, в кальдеру вулкана Узон, в ходе которой были отобраны пробы воды и осадков гидротерм для выделения чистых культур автотрофных микроорганизмов, поставлены in situ накопительные культуры, а также зафиксирована ДНК для молекулярно-экологических исследований. Помимо этого, в воде трех модельных гидротерм (с температурами 56-75С) была определена скорость темновой автотрофной ассимиляции углекислоты. Было показано, что микробные сообщества воды гидротерм кальдеры вулкана Узон активно фиксируют углекислоту, что было показано впервые т.к. раньше подобные исследования проводились на осадках горячих источников, которые хуже отображают именно автотрофную компоненту сообщества поскольку в них доминируют гетеротрофы. В ходе молекулярно-экологических исследований было установлено, что за ассимиляцию углекислоты в воде кислых горячих источников ответственны аэробные хемолитоавтотрофные бактерии рода Hydrogenobaculum, аэробные серные бактерии рода Acidithiobacillus и анаэробные серо- и сульфатредуцирующие бактерии родов Desulfurella и Thermodesulfobium, в то время как в нейтральных источниках за автотрофную фиксацию СО2 отвечали факультативные анаэробные хемолитоавтотрофные бактерии рода Sulfurihydrogenibium, а также, возможно, представители нового филума ‘Ca. Acetothermia’ Помимо источников Камчатки были проанализированы профили микробных сообществ из ранее отобранных образцов горячих источников Северной Осетии. Среди доминирующих автотрофов в данных источниках можно отметить представителей родов Dissulfurispira, Annwoodia, Thiofaba, Thermodesulfitimonas, Sulfurospirillum, Dissulfurirhabdus, Carboxydocella и Thiobacter, что разительно отличается от результатов полученных нами на Камчатке. Из проб, отобранных в ходе экспедиции 2021 г., а также проб, отобранных ранее в гидротермах Северной Осетии, о. Кунашир и Сахалин, было выделено 12 чистых культур термофильных автотрофных прокариот. Наибольший интерес представляют штаммы 4228-t и SLA38, вероятно являющиеся представителями новых видов в родах Thermus и Moorella соответственно, а также штамм 3907-1Е, являющийся представителем нового рода в филуме Aquificae. Помимо этого, в отчётный период была продолжена работа с автотрофными термофильными прокариотами с предположительно новыми или модифицированными путями автотронфной ассимиляции углерода: Tepidiforma bonchosmolovskayae 3753O, Desulfothermobacter acidiphilus 3408-1, Deferribacter autotrophicus SL50 и Thermus sp. PS18. Для T. bonchosmolovskayae 3753O были улучшены протоколы приготовления сред и параметры культивирования, позволившие определить интенсивность ассимиляции углекислоты. Для D. acidiphilus 3408-1 было показано одновременное функционирование сразу двух путей фиксации СО2, обнаруженного ранее нами трансальдолазного варианта цикла Кальвина и пути Вуда-Льюнгдаля. Энзиматические эксперименты с ключевыми ферментами цикла Кальвина выявили высокую активность последних. При этом, с помощью протеомики, было выявлено, что температура не оказывает значительного влияния на вклад того или иного автотрофного пути в общую ассимиляцию углекислоты. Для D. autotrophicus SL50 по данным протеомного анализа была показана высокая экспрессия генов обратимого ЦТК в автотрофных условиях. Для Thermus sp. PS18 с помощью протеомного анализа были получены доказательства работы классического варианта цикла Кальвина и выявлена слабая экспрессия генов обратимого ЦТК, который также может вносить небольшой вклад в автотрофную фиксацию СО2. Таким образом, все задачи, поставленные на 2021 г. были выполнены, несмотря на то, что сотрудничество с немецким партнёром, по объективным причинам, ограничилось планированием тех или иных экспериментов и обсуждением результатов. | ||
3 | 14 мая 2022 г.-17 января 2023 г. | Изучение разнообразия путей автотрофной ассимиляции углерода у термофильных прокариот |
Результаты этапа: Ранее, в 2021 году в период с 13 по 22 июля была проведена экспедиция на полуостров Камчатка, в ходе которой из наземных горячих источников Кальдеры Узон было отобрано 35 проб. Для отобранных проб было выполнено таксономическое профилирование микробных сообществ с помощью высокопроизводительного секвенирования (NGS) ампликонов участка V4 гена 16S рРНК (250 нт). Был показан и проанализирован состав сообществ кислых горячих источников с температурами выше и ниже 50°С, а также источников с рН выше 5,0. Микроорганизмы с автотрофным типом метаболизма доминировали в большинстве исследованных источниках. В рамках данной работы мы показали, что фототрофные прокариоты в гидротермальных системах Камчатки обитают только в теплых источниках с температурами ниже 50°С. В горячих источниках с температурами выше 50°С сообщество полностью состоит из хемотрофов. В большинстве исследованных в рамках данного проекта горячих источников на Камчатке (независимо от рН и температуры), как и в работах других авторов, было обнаружено большое количество некультивируемых архей. Помимо горячих источников Камчатки, пробы из которых были отобраны в ходе второго этапа по данному проекту, были проанализированы профили микробных сообществ из ранее отобранных образцов воды, фильтрованной воды, осадков и микробных матов горячих источников Северной Осетии. Были исследованы пробы из двух глубоких подземных термальных водоносных горизонтов (Бирагзанг и Урсдон) и одного наземного гидротермального поля с температурой воды в диапазоне 43-55°C. В общей сложности были обнаружены представители 50 филумов прокариот, причем бактерии полностью преобладали над археями. Ранее в горячих источниках кальдеры Узон с целью определения интенсивности автотрофной фиксации СО2 термофильными прокариотами были поставлены in situ эксперименты с радиоактивно меченным 14С-бикарбонатом. На заключительном этапе проекта нами были получены результаты с применением метода SIP (stable isotope probing), основанного на включении стабильного изотопа 13С-углерода в биомассу клеток (включая ДНК) автотрофных микроорганизмов в ходе роста на 13С-карбонате. ДНК СО2-ассимилирующих микроорганизмов становится обогащенной 13С, что позволяет отделить ее путем ультрацентрифугирования и сравнение профилей микробных сообществ после секвенирования такой тяжелой и необогатившейся 13С ДНК позволяет выявить микроорганизмов, осуществляющих автотрофную ассимиляцию СО2. Такой эксперимент был проведен на образцах воды горячего источника у ручья Изумрудный (проба 4229; рисунок 3). В последний год реализации проекта нами был получен метагеном пробы 4217, отобранной из кислого источника с многочисленными сине-зелёными обрастаниями по краям и расположенными под ними чёрными осадками. Согласно таксономическому профилированию по фрагменту гена 16S рРНК сообщество источника 4217 было представлено в основном эукариотами, при этом доля прокариот была незначительной. За время проведения проекта в чистые культуры было выделено 11 штаммов термофильных автотрофных бактерий и 1 штамм термофильной автотрофной археи из горячих источников Камчатки и других регионов России. Из пробы воды и осадка из Дагинского термального источника (проба А03, 33оС, рН 6,0-6,5), расположенного на северо-восточном побережье Сахалина, была получена чистая культура новой автотрофной термофильной бактерии Moorella sulfitireducens SLA38T и проведена ее полная фенотипическая и генотипическая характеристика. На заключительном этапе реализации проекта было продолжено in silico и in vitro исследование путей автотрофной ассимиляции углекислоты у четырех наиболее интересных чистых культур термофильных микроорганизмов из коллекции термофильных прокариот Отдела биологии экстремофильных микроорганизмов ФИЦ Биотехнологии РАН. Для Desulfothermobacter acidiphilus штамм 3408-1 было выполнено исследование влияния окислительно-восстановительного потенциала среды и содержания водорода в газовой фазе на выбор между путём Вуда-Льюнгдаля и трансальдолазным вариантом цикла Кальвина. Для Thermus sp. PS18 с помощью метода Nanopora была проведена окончательная сборка генома и получена кольцевая хромосома. Для Tepidiforma bonchosmolovskayae 3753O были измерены интенсивности ассимиляции H14СO3¯в динамике роста штамма 3753О в автотрофных и гетеротрофных условиях. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".
№ | Имя | Описание | Имя файла | Размер | Добавлен |
---|---|---|---|---|---|
1. | тезисы конференции | PERVYiJ_AVTOTROFNYiJ_PREDSTAVITEL_RODA_THERMODESULFOVIBRIO_… | 32,5 КБ | 14 августа 2022 [IKublanov] | |
2. | Culture-Independent Survey of Thermophilic Microbial Communities of the North Caucasus | 2021-Osetia-hot-springs--Toshchakov.pdf | 2,4 МБ | 4 июля 2022 [IKublanov] |