Структура и свойства белковНИР

Protein structure and properties

Источник финансирования НИР

госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию)

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Структура и свойства белков
Результаты этапа: Исследован механизм действия 6-кетохолестанола (КХ), соединения способного «обращать» увеличение протонной проводимости митохондриальной мембраны. Показано, что КХ специфически ингибирует NADH-оксидазную и NADH:убихинон-оксидоредуктазную активности, катализируемые комплексом I дыхательной цепи субмитохондриальных частиц сердца быка (СМЧ). Проведено детальное исследование взаимодействия Fo•F1 АТРазы/синтетазы Paracoccus denitrificans с вентурицидином, специфическим ингибитором комплекса. Вентурицидин тормозит окислительное фосфорилирование как прочносвязанный ингибитор: остаточная активность линейно падает при повышении концентрации ингибитора. Получены новые экспериментальные данные подтверждают модель функционирования двух независимых форм Fo•F1 в энергосопрягающих мембранах. На моделях первичной культуры кардиомиоцитов крысы и кардиомиоцитов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, впервые установлено, что протеолиз IGFBP-4 под действием PAPP-A протекает в сердечной ткани. Показано усиление протеолиза IGFBP-4 под действием PAPP-A при гипертрофии сердечной ткани. Также впервые установлен факт протекания PAPP-A-зависимого протеолиза IGFBP-4 в нейронах и астроцитах. Продемонстрировано, что в астроцитах протеолиз IGFBP-4 протекает значительно интенсивнее, чем в нейронах Повышение внутриклеточной концентрации Na+на 30% (а не изменение объема клетки) увеличивает экспрессию генов раннего ответа FOS, JUN, EGR1, ATF3 и ZFP36. Кратковременное повышение внутриклеточного Na+ на 10% снижает экспрессию генов интерлейкина 6 (IL6), циклооксигеназы 2 (COX2), рецептора, подобного рецептору интерлейкина 1 (IL1RL1). Экспрессия гена раннего ответа сFos, гена эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS), а также транскрипционного фактора NFAT5 при этом не изменяется. Разработан метод получения рекомбинантного малого белка теплового шока человека HspB7. Установлено, что HspB7 способен образовывать гетероолигомерные комплексы с двумя другими малыми белками теплового шока HspB6 и HspB8. Установлено, что точечная мутация с заменой эндогенного корнсервативного остатка аргинина на аланин оказывает существенное влияние на олигомерное состояние малого белка теплового шока HspB8. Установлено, что HspB8 дикого типа в основном представлен в виде мономеров, в то время как его точечный мутант с заменой аргинина на аланин преимущественно образует димеры, триммеры или тетрамеры. Отработаны методы количественной оценки степени дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (МСК) путём измерения активности щелочной фосфатазы и минерализации. На основе поли-3-оксибутирата (ПОБ) были получены его композиты с магнитными наполнителями: FeSO4 с добавлением и без восстановленного оксида графена. Показано, что плёнки, полученные из данных композитных материалов, не проявляют цитотоксичность при культивировании на них МСК. Установлено, что за 48 ч инкубации на поверхности композитных плёнок ПОБ и FeSO4 связывается в три раза меньше бактерий, чем на поверхности плёнок из ПОБ без добавок. Исследованы (1) состояния фитохрома А (phyA) и его пулов в зависимости от влияния факторов, изменяющих клеточный метаболизм (добавление АТФ, атмосфера N2, ингибиторы дыхания и др.) в трансгенных клетках E. coli, экспрессирующих phyA; (2) внутриклеточного АТФ в корешках кукурузы параллельно с определением пулов phyA; (3) действия неспецифического ингибитора фосфатаз NaF на phyA в корнях кукурузы. Установлено следующее: (1) участие клеточного дыхания (энергетического метаболизма) в образовании пула phyA’, (2) связь баланса нативных пулов phyA’/phyA” с фосфатазно-киназным равновесием в клетке и (3) органно/тканевая специфика такой связи. С использованием арабидопсис дикого типа и фитохромных мутантов обнаружено участие phyA в регуляции синтеза протохлорофиллида (Пхд): phyA’ его ингибирует, тогда как phyA’’ стимулирует. phyB также стимулирует накопление Пхд.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Структура и свойства белков
Результаты этапа: Исследования в области биоэнергетики: Установили ингибирующее действие 6-кетохолестанола на реакции переноса электронов, катализируемые дыхательным комплексом I, и заключили, что взаимодействие КХ с комплексом I может быть частью механизма «ресопряжения» энергопреобразующих мембран. Это основанное на наших данных заключение мы рассматриваем в качестве гипотезы, доказательство которой требует дальнейших исследований. Понимание механизма работы разобщителей и «ресопрягателей» дает новые знания о свойствах энергопреобразующих мембран. Исследования в области биохимии мышц и регуляции сократительной активности: Проведен подробный анализ взаимодействия малых белков теплового шока с актиновым цитоскелетом. Высказано предположение о том, что описанное в литературе влияние малых белков теплового шока на ремоделирование актиновых филаментов обусловлено не прямым взаимодействием этих белков с актином, а взаимодействием малых белков теплового шока с минорными актин-связывающими белками. Проведено экспериментальное исследование взаимодействия одного из малых белков теплового шока, HspB7, с мономерным и полимерным актином. Установлено, что HspB7не является истинным актин-связывающим белком и не способен влиять на процесс полимеризации актина Проведенные исследование впервые детально описывают взаимодействия гепарина с компонентами тропонинового комплекса сердца человека. Полученные данные могут более детально понять механизмы взаимодействия гепарина с тропонинами и оказать значительное влияние на создание новых диагностических систем, используемых для детекции сердечных тропонинов. В ходе исследования были разработаны методы, которые с высокой чувствительностью и специфичностью способны детектировать скелетные изоформы ТнИ, что может позволить использовать скелетные изоформы ТнИ для дифференциальной диагностики повреждения скелетной мускулатуры в качестве более специфичной альтернативы классическим маркерам мышечного повреждения. Разработанные прототипы тест-систем способны с высокой чувствительностью измерять эндогенные скелетные изоформы ТнИ в крови больных с повреждением скелетной мускулатуры и в дальнейшем они могут использоваться для оценки степени повреждений и мониторинга состояния скелетной мускулатуры. Исследования клинических образцов крови больных, перенесших хирургическое вмешательство, показало, что через 20-30 ч после проведения оперативного вмешательства быстрый скелетный ТнИ и медленный скелетный ТнИ представлены в форме комплекса с ТнС, что согласуется с данными, полученными для сердечного ТнИ. Исследования в области транспортных АТРаз: Кардиотонические стероиды (КТС) являются специфическими ингибиторами Na,K-АТФазы. Они вызывают различные физиологические эффекты и были исследованы в качестве потенциальных лекарств при сердечных заболеваниях, гипертонии, нейровоспалении, противовирусной и противораковой терапии. Были получены данные по ингибированию и связыванию КТС, таких как уабаин, дигоксин и маринобуфагенин, с Na,K-АТФазы из почек свиньи и крысы, содержащей чувствительную к КТС (α1S) и резистентную (α1R) α1-субъединицу. Маринобуфагенин, в отличие от уабаина и дигоксина, взаимодействовал с α1S- Na,K-АТФазы обратимо, а его константа связывания снижалась за счет уменьшения углубления в сайте связывания КТС и меньшего числа контактов между сайтом и ингибитором. Гиперосмотическая стимуляция клеток эндотелия часто приводит к его дисфункции, сопровождающейся в том числе возникновением провоспалительного ответа. Механизмы этого явления до конца не ясны. Исследованы эффекты кратковременного повышения осмолярности внеклеточной среды на количество мРНК некоторых генов, важных для функционирования эндотелия пупочной вены человека. Гиперосмотическая стимуляция клеток с помощью NaCl, но не маннитола приводила к накоплению ионов Na+ внутри клеток, а также сопровождалась уменьшением их эквивалентной константы упругости. Количество мРНК IL1 снижалось при увеличении осмолярности внеклеточной среды, а количество мРНК ATF3, PAR2 и PTGS2 увеличивалось только в ответ на повышение концентрации NaCl. Увеличение внеклеточной концентрации Na+ в физиологическом диапазоне является независимым фактором, который влияет на внутриклеточное соотношение Na+i/K+i и регулирует экспрессию некоторых генов (в частности, ATF3, PAR2, PTGS2) в клетках эндотелия. Исследования в области энзимологии: На основе комбинаторных синтетических пептидных библиотек разработан масс-спектрометрический метод для деорфанизации и определения специфичности нового класса пролин-пролиновых эндопротеиназ. Показана применимость метода на ранее описанных протеазах PPEP-1 и PPEP-2, выявлены ранее неописанные последовательности пептидов, являющиеся потенциальными субстратами данных протеаз. Деорфанизована новая протеиназа класса PPEP – PPEP-3 из Geobacillus thermodenitrificans и методом комбинаторных синтетических пептидных библиотек определена ее субстратная специфичность. Показано, что субстратная специфичность уникальна для каждой из протеиназ. Методом FRET-Quench подтверждена активность, субстратная специфичность для каждой из протеиназы, а также проведены кинетические исследования ращепления оптимальных субстратов. На основе полученных данных подготовлена к печати публикация «In-depth specificity profiling of Pro-Pro endopeptidases (PPEPs) using combinatorial synthetic peptide libraries».Метод может быть использован как в биологических, так и в фарм исследованиях. Обнаружен новый представитель класса пролин-пролиновых эндопротеиназ PPEP-3 и установлена его субстратная специфичность. Исследования в области биотехнологии: На первом этапе путём контролируемого биосинтеза были получены три образца материалов на основе поли-3-гидроксибутирата (ПОБ), различающиеся своими физико-химическими свойствами, в количествах, достаточных для проведения запланированных на 2022 год экспериментов. Из материалов, синтезированных на первом этапе работы, были изготовлены полимерные конструкции с различной топографией поверхности: гладкие и шероховатые плёнки, пористые микрочастицы и волокнистые скаффолды. Кроме того, была отработана методика получения среды культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК), обогащённой продуктами деградации ПОБ. На втором этапе проведена оптимизация методики выделения МСК крысы из костной и жировой ткани. Показано, что культура МСК, выделенная из костной ткани, способна дифференциироваться в остеогенном направлении в среде, содержащей эмбриональную бычью сыворотку HyClone (Cytiva), а культура МСК из жировой ткани – нет. Отработаны методы количественной оценки степени дифференцировки МСК путём измерения активности щелочной фосфатазы и минерализации. Начато исследование эффектов, оказываемых топографией и продуктами деградации материалов на основе ПОБ, различающихся своими физико-химическими свойствами, на ход процесса спонтанной остеогенной дифференцировки МСК по изменению активность щелочной фосфатазы. Рекомбинантные белки произведенные в E.coli широко используются во всех отраслях промышленной биотехнологии, а также являются одной из наиболее используемых моделей для изучения белков в науке. При этом одной из основных проблем как для производства, так и отдельного взятого исследователя является повышение уровня выхода белка. Больший выход белков желателен в целях уменьшения времени, затрачиваемого на получения достаточных количеств для анализа или дальнейшего использования, а также для снижения стоимости массового производства. Наиболее часто используемые методы повышения экспрессии такие как: подбор экспрессионного штамма, вектора или условий экспрессии не всегда работают, и достаточно часто маленький уровень экспрессии является следствием нуклеотидного состава гена и регулирующих его участков. В связи с этим разработка методов повышения уровня экспрессии путём синонимичных мутаций кодирующей последовательности гена является актуально задачей для многих отраслей как академической науки Исследования в области фотобиологии: Показана возможность изменения общей концентрации и пропорции пулов гетерологичного phyА в клетках E. coli. Установлена корреляция между относительным содержанием предположительно фосфорилированного пула phyA’ и уровнем внутриклеточного АТФ. Обнаружена функциональная активность растительного фитохрома А, экспрессированного в прокариотических клетках, которая проявляется в регуляции развития стрессового ответа в бактериальной культуре E. coli под действием красного / дальнего красного света.
3 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. Структура и свойства белков
Результаты этапа: Исследования в области биоэнергетики: Гидролиз АТР Fo∙F1-АТРазами из различных источников регулируется с помощью ряда белков-ингибиторов и в результате, так называемого, ADP(Mg2+)-торможения. На основании полученных данных мы заключили, что для понимания однонаправленного катализа Fo∙F1 возможно требуются более сложные схемы, включающие участие нескольких регуляторных механизмов и взаимодействие между механизмами регуляции с помощью белков-ингибиторов и ADP(Mg2+)- торможением. Можно заключить, что энергизация мембраны, но не восстановление редокс-компонентов фермента, меняет параметры связывания комплекса I с ингибиторами убихинон-связывающего центра фермента (ротенона и дигидрокапсаицина). Энергизация мембраны приводит к конформационным изменениям в структуре комплекса I, а также влияет на скорость перехода между активной и деактивированной формами фермента таким образом, что стабилизирует комплекс I в активном состоянии. Na, K-ATPаза и механизмы ее регуляции: Обобщая полученные результаты, можно заключить, что спектр действия кардиотонических стероидов на различные типы клеток достаточно обширен и зависит от способа действия на Na,K-АТPазу. Эти эффекты могут влиять как на ионный гомеостаз (не только увеличивая соотношение [Na+]i/[K+]i, но и уменьшая его), так и на внутриклеточную передачу сигналов путем изменения конформации фермента. Таким образом, при исследовании эффектов кардиотонических стероидов следует по возможности оценивать их влияние на транспортную функцию Na,K-АТPазы и внутриклеточный ионный состав. Белки теплового шока: Установлено, что, несмотря на консервативную первичную структуру, кристаллиновые домены sHsp отличаются по своей способности формировать стабильные димеры. Вследствие этого HspB1, HspB5 и HspB6 представлены в виде склонных к гетероолигомеризации олигомеров, а HspB7 и HspB8 в виде мономеров. Малые белки теплового шока отличаются по своей субстратной специфичности и способности взаимодействовать с белками –мишенями и белками-партнерами. Создание новых материалов, пригодных для дифференцировки стволовых клеток: Установленная связь топографии поверхности конструкций на основе ПОБ со скоростью роста и дифференцировки МСК позволит проектировать и создавать материалы медицинского назначения с направленным действием на данный вид стволовых клеток. Инсулиноподобный фактор роста IGF-4 и механизм его функционирования: Полученные результаты расширяют понимания механизмов клеточной адаптации клеток нервной ткани при развитии таких заболеваний, как болезнь Паркинсона. Получены новые данные о влиянии гипоксии на кардиомиоциты, выделенные из неонатальных и взрослых крыс. Обнаруженная наиболее выраженная устойчивость неонатальных кардиомиоцитов к гипоксическим воздействиям, несомненно, требует дальнейшего изучения, как перспективный адаптивный клеточный механизм. Разработка тест систем для определения скелетно-мышечных компонентов тропонина: В ходе исследования были разработаны различные методы детекции скелетных изоформ тропонина И, которые с высокой чувствительностью и специфичностью способны распознавать бсТнИ и мсТнИ. Эти методы могут быть использованы как в научных исследованиях, так и в клиниИСТИНА 15 ческой практике. Активные формы кислорода, галогенов и серы: Установлено, что использование ингибиторов MPO и NADPH-оксидаз может приводить как к ингибированию производства HOCl, так и ингибированию защелачивания фагосомы. Использование ингибиторов протеинкиназы С и фосфатидилинозитол-3-киназы, повышающих продукцию пероксида водорода NADPHоксидазами, снижает гипогалогенный стресс, испытываемый бактериями в полости фагосомы. Ингибирование NO-синтаз никак не влияет на сигнал Hypocrates2. Обработка клеток донорами H2S приводит к развитию антивоспалительного фенотипа, а ингибирование синтеза H2S приводит к увеличению воспаления. Неонатальные кардиомиоциты преимущественно используют лактат и глюкозу, в то время как зрелые клетки – жирные кислоты. Клетки головного мозга, который является самым энерго- и кислород потребляющим органом, более чувствительны к гипоксии. Однако кроме нейронов в первичной культуре также присутствуют астроциты, которые, согласно нашим данным и данным литературы, являются поддерживающими клетками. Они донируют нейронам энергетические субстраты, в частности, лактат, а также, по всей видимости, являются теми клетками, которые первыми реагируют на гипоксию повышением уровнем продукции активных форм кислорода. Нейроны же начинают синтезировать пероксид водорода позже. Протеинкиназы цианобактерий: Разработан метод определения фосфорилированных мотивов, который позволит устанавливать субстратную специфичность как известных киназ, так и производить скрининговые исследования по деорфанизации белков с потенциальной киназной активностью. Обнаружен новый представитель класса серин-треониновых протеиназ SpkH и установлен мотив его фосфорилирования. Фитохром А и его свойства: Впервые установлено, что фитохром А в трансгенной культуре E. coli может быть представлен в двух его нативных формах. Это свидетельствует о том, что пост-трансляционная модификация phyA и его дифференциация на подпулы не являются специфичными только для растений. Это открывает возможности изучения молекулярной структуры пулов после их выделения в относительно простых системах экспрессии. Прослеженные различия термоустойчивости phyА арабидопсиса и сорго в культуре E. coli отражают различия в толерантности к стрессовым условиям двух этих видов растений, что открывает возможность направленного изменения молекулярной структуры фоторецептора для формирования стрессоустойчивости у с/х значимых растений. Обнаруженное присутствие в тканях сорго фитохрома А практически только в стабильной форме phyA’’ объясняет ещё одну выявленную особенность этого растения — отсутствие активной формы протохлорофилла Прото655, регуляция образования которой, по нашим данным, связана с активностью пула phyA’.
4 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. Структура и свойства белков
Результаты этапа:
5 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. Структура и свойства белков
Результаты этапа:
6 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. Структура и свойства белков
Результаты этапа:

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".