ИСТИНА

Целью нашего общего исследования является анализ структуры и свойств различных белков, а также исследование механизмов регуляции их активности. Объектами исследования сотрудников кафедры биохимии являются различные ферменты, белки и белковые комплексы. Поэтому работы будут проводиться по четырем различным направлениям. Первое направление касается проблем биоэнергетики. Цель данной части проекта – получение экспериментальных данных для формулирования гипотез о молекулярных механизмах функционирования и регулирования двух «главных» ферментов, обеспечивающих снабжение клеток энергией: Fo∙F1-ATPазы/синтетазы и NADH:убихинон-оксидоредуктазы (дыхательный комплекс I). Второе направление направлено на исследование транспортных АТРаз. Целью исследования в этом направлении является изучение взаимодействия кардиотонических стероидов (КТС) различной структуры на активность и конформацию Na,K-АТРазы для выявления способа передачи сигнала от Na,K-АТРазы за счет изменения градиента ионов Na и К или (альтернативно) за счет активации сигнальных каскадов, индуцированных изменением конформации фермента при связывании КТС. Целью третьего направления запланированных исследовании является изучение структуры и свойств нескольких белков человека, функционирование которых тем или иным образом связано с различными заболеваниями человека. Объектами исследования будут малые белки теплового шока, а также различные маркерные белки, используемые для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний (такие как компоненты тропонина, белки, связывающие инсулин-подобный фактор роста, натрий уретический пептид, С-реактивный белок и другие). В ходе исследования будет изучена структура данных белков, их посттрансляционные модификации, а также проведен анализ взаимодействия этих белков с антителами и белками-партнерами. Четвертое направление касается исследования фитохромной системы — основного фоторецепторного и фоторегуляторного механизм растений. В ходе исследования преследуются две цели. Первая цель состоит в исследовании пост-трансляционных модификаций фитохрома А (phyA), предположительно фосфорилированного phyA′ и дефосфорилированного phyA″. Вторая цель состоит в исследовании биосинтеза хлорофилла и формировании реакционных центров в зависимости от внешних условий.

The main goal of this project is analysis of the structure and properties of different proteins and investigation of mechanisms of regulation of their activity. Different enzymes, protein and protein complexes are analyzed by members of department of biochemistry and therefore four different lines of investigations are planned. The first direction deals with important problems of bioenergetics. The objectives of this part of project are as follows: 1. Determination of the parameters for so-called A/D transition of complex I, the phenomenon originally described in the applicant’s laboratory and further studied in several leading foreign laboratories. 2. Determination of reversible oxidoreduction steps coupled with proton translocation across coupling mitochondrial and bacterial (P. denitrificans) membranes. 3. Experimental verification of the hypothesis on the presence of two independent isoforms of Fo∙F1 H+-ATPases catalyzing either hydrolysis or synthesis of ATP. 4. Determination of the stoichiometric coefficients in ATP hydrolyzed (synthesized): proton translocated in P. denitrificans membranes. The second direction deals with transport ATPases. This part of investigation is designed with the aim to find special structural features of cardiotonic steroids (CTS) that are essential to induce conformational changes of Na,K-ATPase and by this way to induce signal cascades that are able to affect cell survival and death, cell proliferation, cell adhesion. This study can provide new ideas for synthesis of CTS with special pharmacological properties, which can be used for treatment of different human diseases. The third line of investigation deals with analysis of the structure and properties of several proteins related to different human diseases. In the course of this part of project project we plan to analyze small heat shock proteins as well as different protein markers used for diagnostic different cardio-vascular diseases such as troponin, insulin-like growth factor binding proteins (IGBP), natriuretic peptides, C-reactive protein etc. The main goal of this part of the project is detailed investigation of the structure of these proteins, their posttranslational modifications and analysis of interaction of these proteins with antibodies and protein-partners. Finely, the fourth line of investigation is devoted to investigation of the main plant photoreceptor, phytochrom. The following problems will be analyzed in the course of this project. 1. Elucidation of structural differences between two native populations of the main plant photoreceptor — phytochrome A (phyA) and mechanism of its post-translational modification and differentiation. 2. Investigation of the functional specificity of two phyA types in the process of photomorphogenesis and photoregulation. 3. Analysis of regulation of Pchl biogenesis and formation of the photosynthetic apparatus by phytochrome A which proceeds in cooperation with the hormone jasmonic acid.

В ходе выполнения проекта мы планируем получить следующие результаты. По первому (биоэнергетическому) направлению планируется 1. Выяснить параметры и участников так называемой А/Д трансформации комплекса I дыхательной цепи. 2. Установить этапы обратимых редокс реакций, сопряженных с векторным переносом протонов через сопрягающую мембрану митохондрий и прокариот (Paracoccus denitrificans). 3. Получить результаты, позволяющие сформулировать количественную модель, согласно которой сопрягающие мембраны содержат, по крайней мере, две неравновесные формы Fo∙F1. По второму (транспортные АТРазы) направлению мы планируем выяснить, какие особенности структуры КТС обеспечивают изменение конформации фермента и, соответственно, способны инициировать сигнальные каскады, приводящие к смерти или выживанию клеток. Предполагается установить, каковы различия в индукции сигнальных каскадов в разных типах тканей и с чем это связано. Кроме того, планируется выяснить, какие структурные особенности молекул КТС важны для обеспечения ингибирования фермента и подавления функций, связанных с влиянием на процессы, обусловленные наличием градиентов Na и К. По третьему направлению (маркерные белки и белки теплового шока) мы планируем расширить широкий круг анализируемых малых белков теплового шока и дополнить его специфическим для сердца и сосудов белком HspB7(cvHsp), экспрессия которого коррелирует с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями. Планируется исследовать белок-белковые взаимодействия между различными малыми белками теплового шока и между этими белкам и адаптерным белком Bag3 и различными белками, участвующими в процессах апоптоза. Будут прождолжены исследования компонентов тропонина сердца и скелетных мышц как важных маркеров сердечно-сосудистых заболеваний. Планируется расширить и продолжить ранее начатые исследования таких белков-маркеров как натрий-уретические пептиды, натрий-уретические пептиды и неприлизин, фермент, участвующий в превращении натрийуретических пептидов и других физиологически важных пептидов в крови человека, а также приступить к исследованию сывороточного амилоида (SAA). По четвертому направлению (фотосинтез и фитохром) будут проведены эксперименты по возможному превращению пула phyA″, в состоянии которого фитохром А экспрессируется в гетерологичных системах пул phyA′ при его ауто- или трансфосфорилировании in vitro. Будет проведено изучение полученных ранее в лаборатории проф. J.-I. Kim (Chonnam University, Korea) точечных мутантов Arabidopsis с заменами высоко консервативных аминокислотных остатков в центральном сегменте молекулы, ведущими к снижению киназной и общей регуляторной активности phyA.

По первой (биоэнергетической) тематике. Установлено, что элементарные стадии катализа распада и синтеза ATP, происходящие в ходе функционирования Fo∙F1 H+-АТРазы не совпадают, и существует специальный механизм, переключающий работу Fo∙F1 комплекса с «гидролазного» на «синтетазное» направление. Предложена новая модель, согласно которой сопрягающая мембрана содержит две независимо оперирующие изоформы фермента – синтетазу и гидролазу. NADH:убихинон-редуктаза (комплекс I) митохондрий – наиболее сложный и наименее изученный компонент дыхательной цепи. Установлено, что комплекс I всегда представлен смесью неактивной (Д) и активной (A) форм, и переход из первой во вторую (так называемый А/Д-переход) требует затравочного каталитического цикла. По второй тематике (транспортные АТРазы). Установлено, что есть существенные различия в действии кардинелидов и буфадиенолидов на смерть клеток эндотелия и эпителия и предотвращение апоптоза в гладкомышечных клетках сосудов крыс. Показано, что эти классы кардиостероидов по-разному влияют на конформацию фермента. Эти данные позволяют выделить структурные особенности КТС, влияющие на изменение конформации фермента и на инициацию сигнальных каскадов. По третьей (белки-маркеры и белки теплового шока) тематике. Исследованы структура и свойства нескольких малых белков теплового шока человека и точечных мутантов этих белков, экспрессия которых коррелирует с врожденными заболеваниями человека. Получены панели моноклональных антител на несколько белков-маркеров сердечно-сосудистых заболеваний человека, применимых для ранней диагностики указанных заболеваний. По четвертой (фотосинтез и фитохром) тематике. Обнаружена флуоресценция фитохрома in vivo, развит высокочувствительный, информативный флуоресцентный метод его изучения. Открыты два типа ключевого фитохрома А (phyA′ и phyA″), различающиеся по структуре N-конца молекулы Предложена оригинальная энергетическая схема фотореакции фитохромов, общепринятая в настоящее время.

Исследован механизм действия 6-кетохолестанола (КХ), соединения способного «обращать» увеличение протонной проводимости митохондриальной мембраны. Показано, что КХ специфически ингибирует NADH-оксидазную и NADH:убихинон-оксидоредуктазную активности, катализируемые комплексом I дыхательной цепи субмитохондриальных частиц сердца быка (СМЧ). Проведено детальное исследование взаимодействия Fo•F1 АТРазы/синтетазы Paracoccus denitrificans с вентурицидином, специфическим ингибитором комплекса. Вентурицидин тормозит окислительное фосфорилирование как прочносвязанный ингибитор: остаточная активность линейно падает при повышении концентрации ингибитора. Получены новые экспериментальные данные подтверждают модель функционирования двух независимых форм Fo•F1 в энергосопрягающих мембранах. На моделях первичной культуры кардиомиоцитов крысы и кардиомиоцитов, дифференцированных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, впервые установлено, что протеолиз IGFBP-4 под действием PAPP-A протекает в сердечной ткани. Показано усиление протеолиза IGFBP-4 под действием PAPP-A при гипертрофии сердечной ткани. Также впервые установлен факт протекания PAPP-A-зависимого протеолиза IGFBP-4 в нейронах и астроцитах. Продемонстрировано, что в астроцитах протеолиз IGFBP-4 протекает значительно интенсивнее, чем в нейронах Повышение внутриклеточной концентрации Na+на 30% (а не изменение объема клетки) увеличивает экспрессию генов раннего ответа FOS, JUN, EGR1, ATF3 и ZFP36. Кратковременное повышение внутриклеточного Na+ на 10% снижает экспрессию генов интерлейкина 6 (IL6), циклооксигеназы 2 (COX2), рецептора, подобного рецептору интерлейкина 1 (IL1RL1). Экспрессия гена раннего ответа сFos, гена эндотелиальной NO-синтетазы (eNOS), а также транскрипционного фактора NFAT5 при этом не изменяется. Разработан метод получения рекомбинантного малого белка теплового шока человека HspB7. Установлено, что HspB7 способен образовывать гетероолигомерные комплексы с двумя другими малыми белками теплового шока HspB6 и HspB8. Установлено, что точечная мутация с заменой эндогенного корнсервативного остатка аргинина на аланин оказывает существенное влияние на олигомерное состояние малого белка теплового шока HspB8. Установлено, что HspB8 дикого типа в основном представлен в виде мономеров, в то время как его точечный мутант с заменой аргинина на аланин преимущественно образует димеры, триммеры или тетрамеры. Отработаны методы количественной оценки степени дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (МСК) путём измерения активности щелочной фосфатазы и минерализации. На основе поли-3-оксибутирата (ПОБ) были получены его композиты с магнитными наполнителями: FeSO4 с добавлением и без восстановленного оксида графена. Показано, что плёнки, полученные из данных композитных материалов, не проявляют цитотоксичность при культивировании на них МСК. Установлено, что за 48 ч инкубации на поверхности композитных плёнок ПОБ и FeSO4 связывается в три раза меньше бактерий, чем на поверхности плёнок из ПОБ без добавок. Исследованы (1) состояния фитохрома А (phyA) и его пулов в зависимости от влияния факторов, изменяющих клеточный метаболизм (добавление АТФ, атмосфера N2, ингибиторы дыхания и др.) в трансгенных клетках E. coli, экспрессирующих phyA; (2) внутриклеточного АТФ в корешках кукурузы параллельно с определением пулов phyA; (3) действия неспецифического ингибитора фосфатаз NaF на phyA в корнях кукурузы. Установлено следующее: (1) участие клеточного дыхания (энергетического метаболизма) в образовании пула phyA’, (2) связь баланса нативных пулов phyA’/phyA” с фосфатазно-киназным равновесием в клетке и (3) органно/тканевая специфика такой связи. С использованием арабидопсис дикого типа и фитохромных мутантов обнаружено участие phyA в регуляции синтеза протохлорофиллида (Пхд): phyA’ его ингибирует, тогда как phyA’’ стимулирует. phyB также стимулирует накопление Пхд.