![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Планируемая НИОКР является продолжением исследований, проводимых на кафедре молекулярной биологии и посвящена изучению молекулярной организации и процесса формирования клеточной поверхности эукариот. Целью работы является всестороннее изучение и расшифровка фундаментальных принципов формирования и функционирования клеточной поверхности организмов различной систематической принадлежности в норме и при стрессе, а также исследование роли белков клеточной поверхности при контакте клеток патогена и хозяина.
The cell surface participates in the whole complex of interactions of the cell with the surrounding environment. The remodeling of the molecular ensemble of the cell surface accompanies growth, cell division, stress response, aging and apoptosis, what determines the great importance of this compartment in the process of implementation and transfer of the genetic information. The cell surface is the contact area for the cells, pro- and eukaryotic pathogens among them, with the cells of the higher eukaryotes, including humans at occurrence and development of the diseases. The above said determines the relevance of the investigation. The aim of this work is the comprehensive study of the molecular organization and decoding of the fundamental principles of the cell surface formation and functioning in the organisms with different systematic affiliation in normal conditions and under stress, along with the investigation of the role of the cell surface proteins in the contact of the pathogen and the host. Data of high priority about conformation, ways and mode of integration, as well as post-translational modifications and mechanisms of interactions of proteins, functionally important for the investigated processes will be obtained in this work. The acquired results are fundamentally important for the development of the new technological approaches to the control of invasive diseases.
В процессе выполнения проекта с помощью протеомного анализа, методов генетической инженерии, микроскопии и молекулярного моделирования будут получены данные, позволяющие охарактеризовать структуру и механизм фукционирования клеточной поверхности дрожжей как триединого компартмента, сформированного цитоплазматической мембраной, периплазматическим пространством и клеточной стенкой, через которую осуществляется транспортный поток секретируемых во внешнюю среду соединений. Будут получены результаты протеомного анализа, характеризующие набор белков, входящих в данный компартмент, и изменения, происходящие в нём в результате делеций и мутаций белков, участвующих как в ремоделировании клеточной поверхности, например, глюканозилтрансгликозилаз, так и в регуляции этих ферментов. Полученные результаты позволят вплотную подойти к расшифровке механизмов внутриклеточной сигнализации в норме, при клеточных патологиях и стрессе. Будут получены данные о влиянии компонентов клеточной поверхности и секретома представителей патогенных для человека низших эукариот (грибы, паразитические черви рода Trichinella и некоторые другие возбудители заболеваний человека и млекопитающих животных) на изменения в протеоме экспериментальных животных и культур клеток человека, а также на изменения в структуре и амилоидизацию модельных белков (в первую очередь инсулина коммерческого производства).
На предыдущих этапах исследования нами была выдвинута гипотеза о ключевой роли белков, обладающих амилоидными свойствами как для формирования молекулярного ансамбля поверхности клеток микроорганизмов, так и в развитии заболеваний высших эукариот, включая человека, происходящих при контакте их клеток с амилоидными белками и содержащими эти белки компонентами клеточной поверхности дрожжей. Предложено основанное на данном механизме прогностическое описание путей и способов снижения рисков подобных заболеваний. Были начаты исследования роли липид-белковых взаимодействий как основного фактора, влияющего на формирование молекулярного ансамбля клеточной поверхности организмов различной систематической принадлежности в норме и патологии. Сказанное позволяет спланировать масштабные исследования по заявленной теме «Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности», выполнение которых приведет к получению приоритетных результатов, важных для раскрытия фундаментальных основ молекулярной организации клеточной поверхности, в том числе дрожжей, а также значимости контактов клеток патогенных и непатогенных эукариот, в том числе обусловленных соединениями, входящими в состав их секретомов, с клетками млекопитающих, включая человека. В аспекте современной медицины полученные результаты перспективны и важны для выработки стратегии противостояния развитию патологий, вызванных подобными контактами, что будет являться одним из направлений планируемых исследований.
госбюджет, раздел 0110 (для тем по госзаданию) |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности. |
Результаты этапа: Отчетный период являлся этапом, направленным на получение данных, имеющих принципиально важное значение для дальнейшего планирования и выполнения работ по теме НИР. Работу проводили в двух направлениях. Первое было сосредоточено на изучении клеточной поверхности (КП) дрожжей, с целью выявления взаимосвязи на уровне количественных и качественных оценок содержания в клеточных стенках (КС) белков плазматической мембраны (ПМ) и возможности формирования белками КС микрокомпартментов . Долгое время КС и ПМ рассматривали как отдельные, независимые компартменты, однако, постепенно накапливаются данные о координации их функций в таких процессах как питание, рецепция, размножение, транспорт ионов, образование пор в ответ на воздействие электрического поля (Strike et al, 2019). Всё это подводит к мысли, что клеточную поверхность дрожжей необходимо исследовать как единый комплекс, однако пока наши знания в этом вопросе весьма неполны. Актуальность таких исследований определяется большой ролью, которую клеточная поверхность дрожжей играет при взаимодействии их клеток с клетками млекопитающих, включая человека, при развитии таких заболеваний как микозы и, как следует из высказываемой нами гипотезы, при индукции амилоидозов, включая нейродегенеративные болезни. Другим направлением исследований явился скрининг секреторно-экскреторных белков трихинелл, возбудителей заболеваний человека и животных. Работу выполняли в рамках исследований, проводимых совместно с И.М.Одоевской (сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени И.К.Скрябина). Объектом изучения на данном этапе работы являлась Trichinella nativa, широко распространённая среди диких животных Голарктической области земного шара и характеризующаяся тяжелыми клиническими проявлениями вызываемого ею трихинеллеза и высокой устойчивостью к длительному замораживанию и повсеместно распространенным бескапсульным видом Trichinella pseudospiralis. Одним из основных и приоритетных результатов, полученных нами при выполнении плана работ отчетного периода, явились данные о белковом составе КС дрожжей S. cerevisiae, полученных путём LC-MS/MS анализа, позволяющие подтвердить высказанную ранее гипотезу о путях регуляции, сборки и функционирования клеточной поверхности дрожжей с участием микрокомпартмента, состоящего из глюканозилтрансгликозилазы Bgl2 и кислой фосфатазы Pho3, функционирующих как метаболон. Данные молекулярного моделирования, а также результаты сравнительного анализа белкового состава КС штаммов дикого типа и делетанта по гену BGL2, полученные с помощью LC-MS/MS анализа подготовлены для публикации в высокорейтинговом журнале. Получены новые результаты, позволяющие продолжить исследование роли посттрансляционных модификаций белков КС дрожжей в процессах, идущих с участием КП в целом и КС, в частности. Нами разрабатывается метод, позволяющий выделять дуплексы, в состав которых входят как ПМ, так и КС. В отсутствие Bgl2p в составе дуплексов клеточной стенки и плазматической мембраны другие глюканозилтрансгликозилазы клеточной поверхности приобретают большое количество и разнообразие посттрансляционных модификаций по сравнению с препаратами клеточной поверхности дикого типа. Проведен сравнительный анализ значений радиусов гирации и RMSD (англ. Root Mean Square Deviation), а также RMSF (англ. Root Mean Square Fluctuation), были выявлены отличия в стабильности Bgl2р различной степени фосфорилирования. Указанные различия позволяют рассматривать фосфорилирование (степень фосфорилирования) как фактор способствующий регуляции перехода мономерной формы данного белка в фибриллярную. На данном этапе мы, также, продолжили отрабатывать методический подход, позволяющий фиксировать расположенные рядом белки КС дрожжей и выявлять микрокомпартменты, для чего были использованы следующие сшивающие агенты: DSS (disuccinimidyl suberate), образующий ковалентные связи между первичными аминами и EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), образующий связи между карбоксильными группами и первичными аминами боковых групп аминокислотных остатков белков. При изучении экскреторно-секреторных белков T. nativa было показано, что белки, достоверно определяемые по 4 или более уникальным пептидами и присутствующие на всех трех днях культивирования составили группу из 86 белков как с известными, так и с не идентифицированными ранее функциями. Данная группа, по-видимому, отражает основную часть спектра белков, участвующих во взаимодействиях паразит-хозяин. Актуальность наших исследований определяется необходимостью разработки мер в целях противодействия таким заболеваниям как микозы, амилоидозы и трихинеллезы. | ||
2 | 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. | Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности. |
Результаты этапа: Отчетный период являлся этапом, направленным на получение данных, имеющих принципиально важное значение для дальнейшего планирования и выполнения работ по теме НИР. Работу проводили в двух направлениях. Первое было сосредоточено на изучении репертуара экскреторно-секреторных (Э-С) белков Trichinella pseudospiralis, полученных как на предыдущем этапе, так и в текущем году исследований. В экспериментах, проведенных совместно с И.М.Одоевской (зав. лабораторией иммунологии и молекулярных исследований Всероссийского научно-исследовательского института фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений имени И.К.Скрябина) и Р.Х.Зиганшиным (с.н.с. группы масс-спектрометрии Института Биоорганической химии имени М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова) были выявлены белки в среде при длительной инкубации in vitro мышечных личинок Trichinella pseudospiralis ISS7626 (домашняя свинья Sus scrofa (Камчатка)) с использованием метода LC-MS/MS анализа. В пробах выявлены белки, количество которых возрастало от 72 до 238 по мере инкубации, пропорционально снижению потенциала воспроизводства личинок, остающихся при этом инвазивными. Разнообразие идентифицированных белков возрастало по мере увеличения времени инкубации личинок на среде: 72 белка через 24 ч, 155 белков через 48 ч и 238 белков через 72 ч инкубации. Большинство выявленных белков являлось нуклеазами, протеазами или регуляторами их биогенеза, а также белками, участвующими в прикреплении клеток трихинелл. Подобные исследования ранее никем проведены не были, что не позволяло исследователям представить общую картину динамики продукции белков трихинеллами – важного параметра для понимания взаимодействия трихинелл с клетками млекопитающих. Другим направлением исследований явилось продолжение изучения белков клеточной поверхности дрожжей и последствий их возможного контакта с клетками млекопитающих, в том числе, человека. За отчётный период получены штаммы дрожжей с нарушенным метаболизмом полифосфатов. Получены препараты белков, экстрагированных из КС полученных штаммов дрожжей, выращенных в присутствии и отсутствии соединений, вызывающих стресс у дрожжей, с целью дальнейшего изучения методом LC-MS/MS анализа. По предварительным данным выявлены возможные изменения в белковом составе полученных экстрактов из разных штаммов дрожжей. Также был получен штамм дрожжей с заменой сайта фосфорилирования в белке Bgl2p. Методами молекулярного моделирования, а также физико-химическими методами охарактеризовано влияние фосфорилирования на способ закрепления и структуру белка с амилоидными свойствами Bgl2p, на способность его молекул образовывать фибриллы и взаимодействовать друг с другом в различных условиях. | ||
3 | 1 января 2023 г.-31 декабря 2023 г. | Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности. |
Результаты этапа: Наше исследование является первой попыткой оценить возможную роль клеточных стенок (КС) дрожжей в качестве индуктора формирования бета-структур в молекулах инсулина и фибриллизации этого белка и выявить потенциальную роль белков, входящих в состав КС в этих процессах. Показано, что КС дрожжей Saccharomyces cerevisiae в первую очередь, по-видимому, Bgl2p,могут служить индукторами процесса фибриллизации инсулина. В работе получены результаты, демонстрирующие, что в препарате инсулина НовоРапид может происходить индукция формирования β-структур в присутствии КС как родительского штамма дрожжей, так и штамма с делецией гена, кодирующего белок Bgl2p. По всей вероятности, увеличение доли β-структур могут индуцировать такие белки как, Gas1, Ygp1, для которых описана способность формировать структуры типа амилоидов и некоторые другие менее изученные белки. С помощью методов молекулярного моделирования была получена улучшенная модель Bgl2p с более выгодными значениями потенциальной энергии белковой глобулы по сравнению с моделью, опубликованной ранее. Методами молекулярного моделирования была продемонстрирована потенциальная возможность формирования функционального метаболона Bgl2p и Pho3, что подразумевает участие субстрата Pho3 – высокополимерных полифосфатов, в регуляции процессов формирования клеточной поверхности дрожжей и позволяет предположить участие этих молекул в процессе взаимодействия поверхности дрожжей как с поверхностью клеток высших эукариот так и в процессе формирования молекулярного ансамбля клеточной поверхности самих дрожжей. Предположение о возможной роли Bgl2p, Pho3 и высокомолекулярных полифосфатов в биогенезе КС дрожжей было высказано ранее в совместной работе с ведущим специалистом в области фосфорного обмена И.С.Кулаевым (Калебина с соавт., 2008). Результаты работы имеют важное практическое значение в области медицины. | ||
4 | 1 января 2024 г.-31 декабря 2024 г. | Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности. |
Результаты этапа: | ||
5 | 1 января 2025 г.-31 декабря 2025 г. | Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности. |
Результаты этапа: | ||
6 | 1 января 2026 г.-31 декабря 2026 г. | Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности. |
Результаты этапа: | ||
7 | 1 января 2027 г.-31 декабря 2027 г. | Молекулярные основы формирования и функционирования клеточной поверхности. |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".