Образование и трансформация природных геомолекул планетарного значения: грибная лакказа как биокатализатор гумификации от древних почв до современной биосферыНИР

Formation and transformation of natural geomolecules of planetary scale: fungal laccase as humification biocatalyst from modern soils to the ancient biosphere

Источник финансирования НИР

грант РНФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 июня 2020 г.-31 декабря 2020 г. Изучение лакказ бактерий и лишайников, изучение трансформации ГК аскомицетами, роли лакказ грибов в стабилизации ароматического углерода на минеральных компонентах почв.
Результаты этапа: Работы по проекту в 2020 году включали: изучение условий продукции лакказы ацидобактериями; клонирование генов трехдоменных лакказ ацидобактерий и стрептомицетов с целью получения рекомбинантного фермента; изучение активности лакказы в талломах лишайников порядка Lecanorales и получение препаратов лакказы; изучение роли лакказы в трансформации ГК почвенными аскомицетами; изучение влияния лакказы на трансформацию фенольных соединений и азотистых веществ и их связывание с минеральным сорбентом. В результате выполнения работ по проекту получены данные об индукторах лакказы у ацидобактерий; клоны трехдоменных лакказ ацидобактерий и бактерий рода Streptomyces; препараты лакказы лишайников порядка Lecanorales; данные о трансформации гуминовых кислот микромицетами в присутствии и отсутствии лакказы; установлены особенности трансформации фенольных соединений лакказой в присутствии аминокислот в гомогенных и гетерогенных системах. Ацидобактерии распространены в кислых почвах и сфагновых болотах – местообитаниях, богатых низкомолекулярными фенолами. Условия продукции лакказ ацидобактериями неизвестны. В процессе культивирования ацидобактерий Acidisarcina polymorpha и Granulicella pectinivorans на агаризованных средах, установлены вещества, индуцирующие лакказу. В качестве индукторов лакказы использовали галловую, ванилиновую, феруловую, сиреневую, кофейную кислоты и гуминовую кислоту. Ацидобактерия A. polymorpha выросла на плотной среде с добавлением каждой из фенольных кислот, очень слабый рост наблюдался на среде с гуминовой кислотой. A. polymorpha окисляла галловую и кофейную кислоты в ходе роста. Установлено, что сиреневая и галловая кислоты являются наиболее активными индукторами лакказы у этой бактерии. Ацидобактерия G. pectinivorans также выросла на плотной среде с добавлением фенольных кислот, лучшими индукторами были галловая и кофейная кислоты. Таким образом, в результате выполненных работ установлена возможность продукции лакказы ацидобактериями на твердых средах в присутствие фенольных кислот. Проведена работа по клонированию генов трехдоменных лакказ ацидобактерий A. polymorpha и G. pectinivorans и бактерии Streptomyces californicus. На основании последовательностей генов, кодирующих белки из семейства медьсодержащих оксидаз, разработаны праймеры для ПЦР-амплификации идентифицированных генов. Выделена геномная ДНК. Проведена ПЦР-амплификация пятнадцати генов медьсодержащих оксидаз с разработанными праймерами. Получены 15 продуктов ПЦР-амплификации соответствующей величины, из которых секвенированием подтверждено соответствие девяти генам медьсодержащих оксидаз из A. polymorpha, трём генам из G. pectinivorans и трём генам из S. californicus. Полученные гены медьсодержащих оксидаз клонированы в экспрессионных векторах. Проведена серия полимеразных цепных реакций с разработанными праймерами. ПЦР продукты лигированы в экспрессионные векторы pQE-30 (Qiagen, США), pET22b(+) (Novagen, США), pRSFDuet-1 (Novagen, США) и pET19mod. Вектор pQE-30 с генами-вставками трансформирован в компетентные клетки Escherichia coli M15 p(Rep4). Векторы pET22b(+), pET19mod и pRSFDuet-1 с генами-вставками трансформированы в RuCl2-компетентные клетки Escherichia coli DH5α. Осуществлена идентификация трансформантов на наличие гена-вставки при помощи ПЦР-амплификации. Последовательности клонированных генов медьсодержащих оксидаз подтверждены секвенированием. Из 15 целевых генов в векторы клонированы 11 генов. Проведены измерение активности лакказ и очистка лакказ лишайников порядка Lecanorales. Эти организмы доминируют в напочвенном покрове в тундрах и сосняках-беломошниках. Насколько нам известно, очистка лакказ леканоровых лишайников и исследование их свойств ранее не проводились. В Ленинградской области собраны талломы лишайников Cladonia rangiferina, C. arbuscula, C. stellaris, Cetraria islandica, проведено измерение активности лакказы. Наибольшая активность обнаружена в талломах C. rangiferina и C. arbuscula. С помощью электрофореза в неденатурирующих условиях установлено, что в экстрактах изученных лишайников лакказа представлена высокомолекулярной формой. Отработана оригинальная схема очистки лакказы из таллома. С помощью ионообменной хроматографии с последующей гель-фильтрацией получен электрофоретически гомогенный ферментный препарат. После очистки лакказы с помощью ионообменной хроматографии установлена трансформация высокомолекулярной формы в три низкомолекулярные формы с массой 80, 70 и 50 кДа. Исследование очищенных препаратов лакказы с помощью SDS-ПААГ электрофореза показало наличие четырёх полос (включая высокомолекулярную), которые, вероятно, соответствуют разным формам фермента. Таким образом, установлено, что в ходе очистки лакказы с помощью ионообменной хроматографии происходит отделение от лакказы компонента, который делает её высокомолекулярной. Этот процесс происходит ступенчато. Лакказа лишайников порядка Lecanorales отличается Проект № 17-14-01207/2020 Страница 12 из 24 низкой термостабильностью, как в высокомолекурном, так и в низкомолекулярном состоянии. Фермент катализирует окисление фенольных субстратов 2,6-диметоксифенола, гваякола, пиррогалола, катехола. Проведена работа по трансформации гуминовой кислоты (ГК) культурами грибов Acremonium murorum, Botritis cinerea, Isaria fumosorosea, Mycelia sterilia на средах, содержащей глюкозу или микрокристаллическую целлюлозу в качестве основного источника углерода. В среду вносили ГК дерново-подзолистой почвы. В культурах A. murorum и B. cinerea установлена небольшая активность лакказы в течение 3-7 суток роста. Активности пероксидазы в культуральной жидкости не обнаружено ни у одного гриба. Активность пероксидазы и лакказы на поверхности мицелия не обнаружена. За три недели культивирования установлено примерно равное (до 30%) обесцвечивание ГК в культуре гриба, продуцирующего лакказу (B. cinerea) и гриба, лакказу не продуцирующего (I.fumosorosea). Таким образом, грибы трансформировали ГК в ходе роста. На среде с глюкозой происходило уменьшение низкомолекулярной фракции и незначительное уменьшение высокомолекулярной фракции ГК. На среде с целлюлозой происходило снижение как низкомолекулярной, так и высокомолекулярной фракции. Механизм деструкции ГК Isaria fumosorosea непонятен, так как ни в культуральной жидкости, ни на поверхности мицелия не наблюдалось наличия окислительных ферментов. Возможно, трансформация обусловлена действием активных форм кислорода, что будет проверено в ходе дальнейшего изучения культур грибов. Изучено влияние лакказы на связывание фенольных кислот модифицированным каолинитом в присутствие аминокислот. По скорости окисления лакказой гидроксизамещенные кислоты располагались в ряд кофейная>галловая>протокатеховая, метоксизамещенные кислоты - в ряд феруловая > сиреневая > ванилиновая. Установлено, что в многокомпонентных эквимолярных смесях фенольных кислот (галловая, протокатеховая, сиреневая, ванилиновая, феруловая, 2 мМ каждой) в первую очередь лакказой окисляется галловая кислота. Метоксизамещенные кислоты и протокатеховая кислота не вступают в реакцию, пока галловая кислота не израсходована на 80-90%. В смесях метоксизамещенных кислот с кофейной кислотой установлена та же закономерность. Тенденция сохраняется в гетерогенных системах, если сорбцией исходных веществ на минерале можно пренебречь. При низких концентрациях кислот (0.01 мМ, динамические условия) в присутствие лакказы значительно увеличивается связывание минералом сиреневой и феруловой кислот - на порядок по сравнению с минералом без лакказы. Это объясняется сорбцией галловой кислоты минералом, удалением ее из реакционной смеси, окислением метоксизамещенных кислот и сорбцией их олигомерных продуктов. Проведены реакции фенольных кислот с лакказой в присутствии аминокислот различной структуры (тирозина, L-ДОФА, триптофана, глицина, аргинина, лизина). Все изученные аминокислоты, кроме лизина, практически не оказывали влияния на трансформацию фенольных кислот лакказой. В смесях с лизином количество прореагировавших с лакказой кислот заметно увеличивалось. Проведено сравнение эффективности связывания фенольных и аминокислот минералом в присутствие и отсутствие лакказы в экспериментах по десорбции кислот. Установлено значительное (примерно в 2 раза) увеличение количества связанных с минералом кислот в присутствии лакказы. Таким образом, в многокомпонентных смесях гидрокси- и метоксизамещенных кислот в реакции с лакказой в первую очередь вступают орто-гидроксизамещенные кислоты (галловая, кофейная). Эффективное окисление метоксизамещенных кислот (сиреневой, феруловой) происходит в отсутствие орто-гидроксизамещенных кислот. В присутствии некоторых аминокислот (лизина) эффективность трансформации фенольных кислот лакказой увеличивается. Лакказа способствует секвестрации фенольных кислот на минеральных фазах. Установленные закономерности окисления смесей фенольных субстратов лакказами имеют важное значение для понимания процессов, ведущих к формированию состава органического вещества почв и его органо-минеральных соединений. Результаты работы опубликованы в высокорейтинговом журнале (Plos One, Q1 SJR) и доложены на всероссийской конференции.
2 10 января 2021 г.-15 декабря 2021 г. Изучение свойств лакказ бактерий, аскомицетов и лишайников, изучение роли реакций Фентона в трансформации ГК аскомицетами, изучение генов лакказ леканоровых лишайников и роли азотистых веществ в гетерогенной конденсации фенольных субстратов в динамическом режиме.
Результаты этапа: Проект посвящен установлению роли фермента лакказы в синтезе и трансформации гуминовых веществ почв. Природа, происхождение и механизмы образования этих веществ не установлены, хотя почвенный гумус и составляющие его вещества являются главным резервуаром Сорг в наземных экосистемах. Общим подходом к проблеме гумификации, реализуемом в рамках проекта, было моделирование реакций гуминовых кислот и их фенольных предшественников с лакказой. Лакказа - один из первых металло-ферментов, появившихся в истории кислородной биосферы. Фермент окисляет фенольные субстраты и ароматические амины молекулярным кислородом и способствует как реакциям полимеризации, так и деполимеризации. Лакказа продуцируется грибами, бактериями и лишайниками, что предполагает ее важную роль в секвестрации органического углерода в почвах в геологическом масштабе времени. Наименее изученными являются лакказо-подобные медьсодержащие оксидазы бактерий, лакказы аскомицетов и лишайников и их роль в трансформации фенольных субстратов в почвах. Получение рекомбинантных трехдоменных и двухдоменных лакказ стрептомицетов, трехдоменных лакказ ацидобактерий, изучение их свойств и выяснение их роли в гумификации было одной из крупных задач на этапе выполнения проекта в 2021 г. Второй крупной задачей было выяснение роли лакказ зигомицетных грибов в гумификации. Третья задача состояла в полногеномном секвенировании лишайников, аннотировании генов лакказ лишайников как предполагаемых эволюционно ранних продуцентов фермента и выяснении их положения на филогенетическом дереве. Четвертой задачей было выяснение роли реакций свободнорадикальной конденсации (вторичного синтеза) в образовании гумусовых веществ из низкомолекулярных предшественников при характерных для почв условиях. Вклад этих реакций в образование высокомолекулярных и устойчивых гуминовых веществ является одним из наиболее дискуссионных вопросов почвоведения. Впервые получена рекомбинантная лакказа ацидобактерии Acidisarcina polymorpha, выделенной из-под талломов леканоровых лишайников, т.е. местообитаний, богатых низкомолекулярными фенольными соединениями. Изучены ее свойства, установлена эффективная трансформация фенольных субстратов как in vitro, так и in vivo в результате активности, связанной с клеточной стенкой. Окисление ацидобактериями фенольных субстратов, связывание их с биомассой может служить одним из путей накопления темноокрашенного азотсодержащего материала в почвах. Впервые получена рекомбинантная двухдоменная лакказа актинобактерии со средним окислительно-восстановительным потенциалом, не характерным для двухдоменных лакказ. Показана трансформация фенольных соединений и полимеризация гуминовых кислот в присутствии этого фермента. Таким образом, установлено, что несмотря на более высокий редокс потенциал, двухдоменные лакказы бактерий не способны эффективно деполимеризовать природные фенольные субстраты подобно лакказам грибов. Двухдоменные лакказы считаются эволюционно древней формой фермента. Результаты работы показывают, что участия лакказ в реакциях деполимеризации не следует ожидать ранее появления трехдоменных лакказ грибов с высоким редокс-потенциалом. Впервые проведена иммобилизация двухдоменных лакказ стрептомицетов. Сорбентами служили модельная минеральная фаза – каолинит, модифицированный гидроксидом алюминия и гумусовый горизонт почвы. Показано, что эффективность окисления нефенольного субстрата АБТС и фенольного субстрата 2.6-диметоксифенола при иммобилизации составляет 80-150% от таковой свободных лакказ. При иммобилизации не меняется рН-оптимум, увеличивается устойчивость к высоким концентрациям азида натрия. На основе различий в устойчивости двух- и трехдоменных лакказ к азиду натрия разработан метод дифференцированного определения этих форм фермента в почвах с субстратом АБТС. Показана высокая скорость окисления субстрата в диапазоне концентраций азида натрия 0, 0.1 мМ и 0.1-50 мМ. Концентрация 0.1 мМ соответствует 100% ингибированию трехдоменных лакказ, 50 мМ – 100% ингибированию двухдоменных лакказ. Установлена относительно высокая активность двухдоменных лакках в почвах. Значимых различий в скорости окисления АБТС при 0 и 0.1 мМ азида не установлено, что предполагает либо низкую активность трехдоменных лакказ, либо их устойчивость к азиду в почвенных условиях. Это явилось неожиланным результатом, требующим дальнейших исследований. Впервые изучена лакказа зигомицетного гриба и ее роль в гумификации. Зигомицетные грибы широко распространены в почвах. В геномах этих грибов обнаружены гены, кодирующие лакказы. Однако, лакказы этих грибов не были описаны, т.к. условия их продукции плохо изучены. Обнаружено, что гриб Mortierella elasson продуцирует лакказу на среде, содержащей соевую муку. Был получен электрофоретически гомогенный препарат лакказы, проявлявший типичные для лакказ свойства. Культуральная жидкость, содержащая лакказу и, особенно, очищенный фермент деполимеризовали ГК из дерново-подзолистой почвы, компоста, торфа. Таким образом, впервые показано участие этого фермента в трансформации гуминовых веществ почв. В результате биоинформатического анализа собранных нами метагеномов пяти лишайников, в Cladonia stellaris и Cladonia arbuscula обнаружены гены лакказ. На основе иРНК лакказы, выделенной ранее из биомассы Peltigera polydactylon обнаружен гомологичный ей ген в метагеноме Peltigera canina. Построено филогенетическое дерево лакказ. Показано, что лакказы представляют собой очень гетерогенную группу ферментов, не имеющую очевидного общего предка и объединенную только проявляемой каталитической активностью и наличием консервативных медь-связывающих доменов. Гены лакказ лишайников нельзя выделить как особенно древние или высоко консервативные. Они не выделяются в отдельный кластер и имеют довольно низкую гомологию. Например, не обнаружено лакказоподобных генов у лишайника Solorina crocea, обладающего высокой и подтвержденной лакказной активностью. Это позволяет предполагать у этого лишайника отдельный специфичный лакказный ген. В рамках гипотезы авторов о гетерофазном биокатализе как механизме образования и стабилизации гумусовых веществ, изучена роль лакказы в образовании высокомолекулярных фракций гумуса при низких концентрациях предшественников (0.01 мМ) и проточных условиях. Установлено, что синтеза полимерных соединений из мономерных предшественников в условиях, моделирующих почвенные, не происходит. Однако, показана эффективная трансформация галловой, феруловой и сиреневой кислот лакказой, и связывание продуктов с минералом. Таким образом, свободнорадикальные реакции играют важную роль в формировании состава жидкой фазы и органо-минеральных адсорбционных комплексов даже при крайне низких концентрациях субстрата. Реакционная способность субстратов определяется их редокс-потенциалом. В результате работы показан высокий потенциал лакказ бактерий и зигомицетных грибов к участию в процессах гумусообразования. Установлено филогенетическое положение лакказ лишайников. Выявлена роль свободнорадикальных реакций в трансформации ароматических субстратов при близких к почвенным условиях. По результатам работы подготовлено 5 статей, в том числе статья в Q1 и обзор.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".