ИСТИНА

Глобальной целью проекта является разработка неинвазивного метода исследования окислительного стресса и накопления «клеточного мусора» в клетках кожи человека с целью создания инструмента для исследования процесса старения на клеточном и молекулярном уровнях in vivo.

Aging of the skin, as well as of the whole organism, is an inevitable biological phenomenon, consisting of two processes: the age-related cessation of cellular functioning ("internal" aging) and / or disruption of functioning due to the accumulation of adverse environmental factors (so-called "external" aging) . In organs and tissues, including in the skin, the combination of these processes leads to multiple metabolic disorders, which eventually manifests itself in the occurrence of various diseases, including malignant cancerous lesions. Two key processes associated with aging are the disruption of the metabolic activity of cells and the associated accumulation of reactive oxygen species, as well as the irreversible accumulation of degradation products ("cell debris"). Due to their high social importance, studies of these processes are very intensive, including at the molecular level, but experiments are conducted mostly in vitro and / or model systems. At the same time, it is of undoubted interest to conduct research into the processes associated with aging on a human in vivo. The development of methods of non-invasive diagnostics, first of all, optical methods that make it possible to obtain information in vivo with high temporal and spatial resolution, stimulated the development of "optical biopsy", that is, the study of the morphological parameters of the tissue without standard histological procedures. Specifically, the multiphoton tomography (MPT) method, which underlies the approach to the study of aging processes in this project, allows not only to determine the structure of tissue with a resolution of 1 μm, but also to study biochemical processes by analyzing the signal from endogenous fluorophores. So, there are a number of clinical applications of the MPT for the diagnosis of skin, in particular, oncological diseases. The purpose of this project is to develop an MPT-based method for in vivo diagnosis of the processes involved in the aging process on a person. The task, which belongs to the field of biophotonics, is new and is of interest for related fields - biophysics, biochemistry of aging, fundamental medicine, etc. For this purpose the following tasks will be solved: 1. Detailed investigation of optical properties (spectral characteristics, cross section of two-photon excitation of fluorescence, lifetime of the excited state) of lipofuscin in model systems, including the influence of external factors, the density of pigment packing, etc. 2. Development and verification of the method for determining oxidative stress using MPT/ FLIM using endogenous fluorophores signals (NADH and FAD for the determination of the metabolic state and lipofuscin as cell debris) on cell cultures exposed to external influences. 3. Development and verification of the procedure for the determination of oxidative stress in epidermal cells (keratinocytes) with the help of MPT/ FLIM on ex vivo skin samples (in pig skin and biopsy specimens) and in vivo (on volunteers from different age groups). 4. Creation of a technique for isolating the fluorescence signal of fibroblasts in human skin (in the dermis) and studying their metabolic state and oxidative stress.

Основным ожидаемым результатов является разработка неинвазивного метода исследования окислительного стресса и накопления «клеточного мусора» в клетках кожи человека с целью создания инструмента для исследования процесса старения на клеточном и молекулярном уровнях in vivo. Сопутствующим результатом будет являться решение задач, указанных в п. "Цель и задачи проекта". В случае успешной реализации проекта, будет создан мощный инструмент для in vivo исследования молекулярных процессов, связанных со старением, что может найти применение в ряде областей исследования и биомедицинской диагностике.

Участники проекта (к.ф.-м.н. Ширшин Е.А, д.ф.-м.н. Фадеев В.В., асп. Ровнягина Н.Р., асп. Якимов Б.П., н.с. Тихонова Т.Н.) представляют лабораторию лазерной биофотоники кафедры квантовой электроники физического факультета МГУ, которая специализируется на методах оптической (в том числе лазерной) диагностики биологических систем, а также лабораторию медицинской биофотоники физического факультета МГУ (к.ф.-м.н. Приезжев А.В., асп. Семенов А.Н.). За последние три года участниками групп было опубликовано более 25 статей в высокорейтинговых (Q1) журналах по тематике проекта. В 2018 году коллективом опубликовано 8 статей в журналах из Q1, в том числе, в Angewandte Chemie (IF ~ 12, предложен метод детектирования фибриллярных агрегатов аминокислот с использованием агрегационно-индуцированной собственной «синей» флуоресценции – данное исследование имеет непосредственное отношение к теме заявляемого проекта) и Nature Communnications (показана топология белкового комплекса, ответственного за процесс фотоадаптации в цианобактериях). В последнее время акцент исследований сместился на применение полученного задела в in vivo диагностике тканей (прежде всего кожи) с использованием флуоресцентной спектроскопии, в том числе, метода FLIM. Задачи, которые ставятся в данном проекте, являются продолжением начатых исследований в области многофотонной томографии кожи.

- Будет проведено подробное иссследование оптических свойств модельных образцов липофусцина: спектральных характеристик при одно- и двухфотонном возбуждении, времени жизни флуоресценции, а также, при положительном результате, разработан метод селективного возбуждения флуоресценции липофусцина за счет двухквантового поглощения. Ключевой проблемой в исследовании липофусцина является затрудненность в определении спектральных и оптических характеристик ввиду сложности их физико-химического устройства. Результаты последних исследований указывают на наличие в составе липофусцинов малональдегида (МДА) как продукта перекисного окисления липидов при оксидативном стрессе. Связывание МДА с амидными группами белковых остатков приводят к образованию сшивок, дающих синюю флуоресценцию, что напоминает спектр флуоресценции от экстрактов богатых липофусцином клеток и тканей. МДА сам может полимеризоваться, и его полимеры дают устойчивую синюю флуоресценцию. Похожий флуоресцентный сигнал наблюдали от искусственно подготовленных растворов компонентов, которые, предположительно, входят в состав липофусцина, однако устойчивую флуоресценцию, наблюдаемую в случае липофусцинов, получить не удалось. Отсутствие корреляции спектральных характеристик флуоресценции липофусцинов в клетках с измеренными характеристиками хлороформ-метанольных экстрактов липофусцинов составляет противоречие, разрешение которого до сих пор остается открытым (проблема т.н. «Метахроматичности»). Возможным объяснением является выраженная гетерогенность липофусциновых образований. При высоких концентрациях при исследовании флуоресценции липофусциновых продуктов необходимо учитывать: (1) эффект внутренней фильтрации (самопоглощение индуцируемой флуоресценции с последующим высвечиванием в длинноволновой области) (2) аппаратурных особенностей детекции (более низкая чувствительность ФЭУ к фотонам желто-красной области спектра). Эффект внутренней фильтрации связан с тем, что при высокой концентрации флуорофора спектр флуоресценции не подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бэра, в отличии от спектра поглощения. Этот процесс сопровождается сдвигом спектра флуоресценции в длинноволновую область и уменьшением квантового выхода флуоресценции. Эффект внутренней фильтрации может быть вызван: (а) ре-абсорбцией высвечиваемого излучения; (б) образованием димеров и полимеризацией; (в) образованием флуорофорных эксимеров. В гистохимических исследованиях этот интегральный эффект часто называют метахроматизмом. Он встречается не только при флуоресцентной визуализации, но и при обычном химическом окрашивании. В конкретном случае в биологическом образце метахроматизм может быть вызван более комплексными причинами, такие как: (а) агрегация молекул красителя с участием молекул воды, образующих межмолекулярные полярные связи; (б) полимеризация флуорофора; (в) возникновение определенных резонансных форм флуорофоров. Все указанные эффекты будут исследованы при проведении экспериментов с модельными липофусцин-содержащими пигментами на первом году выполнения проекта. - Будут исследованы изменения метаболического состояния (с использованием флуоресценции НАД(Ф)Н и ФАД) и окислительного стресса (с использованием сигнала от липофусцина) на модельных системах (культурах клеток) с окислительным стрессом.