ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Мышечная дистрофия Ландузи-Дежерина (МДЛД) является третьим наиболее распространенным наследуемым заболеванием после дистрофии Дюшена и миотонической дистрофии. МДЛД характеризуется слабостью и атрофией мышц лица и плечевого пояса, а впоследствии – мышц бедер и ступней ног. Многочисленными генетическими исследованиями было показано, что развитию МДЛД способствуют хромосомные перестройки, приводящие к частичной делеции повтора D4Z4 в области 4q35, вследствие чего происходит изменение экспрессии ряда генов, в том числе транскрипционного фактора DUX4. Повышенная экспрессия DUX4 сопряжена с оксидативным стрессом, а также с развитием ряда молекулярных особенностей, характерных для мышечной дистрофии Ландузи-Дежерина. Данный проект направлен на изучение вклада оксидативного стресса в патогенез МДЛД и возможности использования антиоксидантов в лечении этого заболевания. Предполагается, что основной причиной оксидативного стресса при МДЛД является дисфункция митохондрий. Для проверки этой гипотезы будут использованы селективные митохондриально-направленные антиоксиданты и разобщители окислительного фосфорилирования. Для того, чтобы определить какие гены вовлечены в развитие оксидативного стресса и сопряженных с ним нарушений миогенной дифференцировки нами будет проведено сравнение транскрипционных профилей миобластов больных МДЛД и здоровых доноров в присутствии и в отсутствие антиоксидантов. Сравнение транскрипционных профилей позволит выявить группу генов и сигнальные каскады, вовлеченные в оксидативный стресс и их роль в патогенезе МДЛД. Эти каскады и их роль в патогенезе заболевания будут детально исследованы in vitro.
По итогам выполнения проекта будут получены подробные данные о влиянии панели антиоксидантов с различным механизмом действия на дифференцировку миобластов больных МДЛД. Будут исследованы механизмы действия и сигнальные каскады, приводящие к коррекции дефектов дифференцировки. В дальнейшем предполагаются клинические испытания выбранных антиоксидантов на больных МДЛД на базе лаборатории Валерия Казакова (Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова) или Института Медицинской Генетики в Москве.
В нашей лаборатории проводится подробное исследование участия митохондрий во внутриклеточных сигнальных каскадах. Основные усилия сосредоточены на исследовании митохондриально-направленных антиоксидантов семейства SkQ. Показано, что эти соединения защищают клетки как от апоптоза, вызванного оксидативным стрессом, так и от некроза. В клетках разных типов было показано, что эти соединения заметно меняют структуру митохондриального ретикулума, делая его более интегрированным. За последние годы было установлено, что эти антиоксиданты обладают выраженным противовоспалительным и ангиопротекторным действием. В частности, они предотвращают апоптоз эндотелиальных клеток, вызванный высокими дозами ФНО. Установлено, что SkQ эффективно ускоряет заживление кожных ран у старых мышей и мышей линии db/db с диабетом 2ого типа. Этот эффект отчасти связан с подавлением избыточного воспаления и ускорением завершения воспалительной фазы заживления ран. Показано, что SkQ подавляет экспрессию молекул адгезии в аортах старых мышей и в активированных ФНО эндотелиальных, действие SkQ1 было направлено на подавление активации NF-kB. На эндотелиальных клетках было показано, что низкие концентрации разобщителей окислительного фосфорилирования также подавляют стимулированную ФНО экспрессию молекул адгезии за счет ингибирования NFkB. На ряду с противовоспалительным действием, была обнаружена способность митохондриально-направленных антиоксидантов вызывать дифференцировку подкожных человеческих фибробластов в миофибробласты, что также способствовало заживлению ран.
CNRS UMR8126, Institute Gustave Roussy | Соисполнитель |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 13 октября 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Изучение роли оксидативного стресса в нарушении дифференцировки миобластов больных мышечной дистрофией Ландузи-Дежерина |
Результаты этапа: Были начаты исследования роли активных форм кислорода (АФК) в патогенезе мышечной дистрофии Ландузи-Дежерина (МДЛД). Проверялась гипотеза о том, что повышенный окислительный стресс может приводить к нарушениям дифференцировки миобластов и, таким образом, быть причиной развития мышечной дистрофии. Использовалась in vitro модель дифференцировки первичных миобластов [1]. Было показано, что миобласты, выделенные из мышц больных МДЛД генерируют повышенное количество АФК. Снижение уровня АФК под действием антиоксидантов N-ацетилцистеина (NAC) и темпола приводило к заметному увеличению диаметра и восстановлению нормальной морфологии миотрубочек дифференцировавшихся из миобластов пациентов с МДЛЛ (результаты вошли в публикацию [2]). Таким образом, было показано, что чрезмерная генерация АФК миобластами больных МДЛД приводит к нарушению их дифференцировки. Развитие МДЛД связано с хромосомными перестройками, приводящими к частичной делеции повторов D4Z4 в области 4q35, вследствие чего происходит изменение экспрессии ряда генов, в том числе возрастает экспрессия DUX4. Ранее было показано, что повышенная экспрессия DUX4 сопряжена с окислительным стрессом в мышцах больных МДЛД, однако, прямых измерений уровня АФК в миобластах с оверэкспрессией DUX4 не проводилось. Мы показали, что в миобластах повышение экспрессии DUX4 приводит к росту уровня АФК и повреждений ДНК. Восстановление нормального уровня АФК под действием антиоксидантов N-ацетилцистеина (NAC) и темпола приводило к снижению повреждений ДНК (результаты вошли в публикацию [2]). В соответствии с заявленными планами, мы приступили к исследованию роли АФК, генерируемых митохондриями (мито-АФК) в нарушении слияния миобластов. Была проведена первая серия экспериментов на первичных миобластах скелетных мышц здоровых доноров. Уровень мито-АФК понижали, используя митохондриально-направленный антиоксидант SkQ1 (конъюгат антиоксиданта, пластохинона, и проникающего катиона трифенилфосфония) (результаты вошли в публикацию [3]). Были получены предварительные данные, указывающие на то, что митохондриальные АФК немного подавляют слияние миобластов скелетных мышц здоровых людей. Мы планируем продолжить эти исследования в моделях МДЛЛ, где генерация АФК повышена. | ||
2 | 31 декабря 2016 г.-31 декабря 2017 г. | Изучение роли оксидативного стресса в нарушении дифференцировки миобластов больных мышечной дистрофией Ландузи-Дежерина |
Результаты этапа: Были продолжены исследования роли активных форм кислорода (АФК) в патогенезе мышечной дистрофии Ландузи-Дежерина (МДЛД). Эта наиболее распространенная медленно развивающаяся, но чрезвычайно тяжелая наследственная миопатия возникает в результате утраты репрессии транскрипционного фактора DUX4. Заболевание сопровождается повышенной генерацией активных форм кислорода (АФК) в мышцах и как показали пилотные клинические испытания, антиоксидантная терапия эффективна при данном заболевании (Passerieux et al., 2015). На предыдущем этапе проекта мы показали, что классический антиоксидант Tempol в значительной мере корректирует дефекты дифференцировки миобластов, выделенных из биопсий больных МДЛД (Dmitriev et al., 2016). Сейчас мы сосредоточили наши усилия на работе на линии иммортализованных миобластов человека МВ135 с индуцибельной экспрессией DUX4 (линия МВ135-DUX4) (Jagannathan et al., 2016). Мы проанализировали эту модель и показали, что, индукция оверэкспрессии DUX4 приводит к заметной гибели миобластов, заметному окислительному стрессу и нарушению миогенеза, который в очень незначительной мере восстанавливается классическими антиоксидантами Tempol и Trolox, но не митохондриально-направленным SkQ1. В то же время оказалось, что в клетках линии МВ135-DUX4 экспрессия рекомбинантного DUX4 в отсутствие индуктора (доксициклина) заблокирована не полностью. Этот вывод следовал из повышения экспрессии транскрипционной мишени DUX4, hZSCAN4 в клетках МВ135-DUX4 в 50 раз по сравнению с МВ135. Важно отметить, что белок DUX4 не детектировался в лизатах клеток МВ135-DUX4, как и в лизатах миобластов пациентов с МДЛД. Именно такая крайне низкая, часто не детектируемая экспрессия DUX4 наблюдается в миобластах у пациентов с МДЛД (Bosnakovski et al., 2017; Tsumagari et al., 2011). Неполное ингибирование экспрессии DUX4 в клетках МВ135-DUX4 вело к небольшому, но значимому повышению генерации АФК и типичному для МДЛД нарушению миогенеза. Таким образом, клетки линии МВ135-DUX4 без дополнительной индукции экспрессии DUX4 оказались хорошей in vitro моделью МДЛД и дальнейшую работу мы планируем проводить на ней. Антиоксиданты и классические (Tempol и Trolox) и митохондриально-направленный SkQ1 (10-(6'-пластохиноил) децилтрфенилфосфоний) снижали уровень АФК в клетках МВ135-DUX4, а также в значительной мере восстанавливали миогенез. В качестве контроля антиоксидантного действия SkQ1 мы использовали его фрагмент, лишенный антиоксидантной части (додецилтрифенилфосфоний, C12TPP). К нашему удивлению оказалось, что С12ТРР в значительной мере восстанавливает миогенез в культуре МВ135-DUX4. С12ТРР, как и SkQ1 способен вызывать частичное («мягкое») разобщение окислительного фосфорилирования (Romaschenko et al., 2015; Severin et al., 2010). Известно множество примеров терапевтического действия «мягкого» разобщения (Brand, 2000; Brennan et al., 2006; Caldeira Da Silva et al., 2008; M. Cunha et al., 2011; Plotnikov et al., 2012; Sullivan et al., 2004; Zakharova et al., 2017), но его механизм до конца не понятен. Как правило действие малых доз разобщителей в разных моделях объясняется их способностью снижать уровень митохондриальных АФК (Brand, 2000; M. Cunha et al., 2011). В то же время нельзя исключать и других возможных механизмов действия С12ТРР, таких как улучшение «контроля качества» митохондрий за счет активации митофагии, а также активация энергетических сенсоров (таких как AMPK), регулирующих целый ряд клеточных ответов. Действие SkQ1 и С12ТРР подтверждает важную роль митохондрий в регуляции миогенеза, а также указывает на их участие в нарушении миогенной дифференцировки при МДЛД. Bosnakovski, D., Chan, S.S.K.K., Recht, O.O., Hartweck, L.M., Gustafson, C.J., Athman, L.L., Lowe, D.A., and Kyba, M. (2017). Muscle pathology from stochastic low level DUX4 expression in an FSHD mouse model. Nat. Commun. 8, 550. Brand, M.. D. (2000). Uncoupling to survive? The role of mitochondrial inefficiency in ageing. Exp. Gerontol. 35, 811–820. Brennan, J.P., Berry, R.G., Baghai, M., Duchen, M.R., and Shattock, M.J. (2006). FCCP is cardioprotective at concentrations that cause mitochondrial oxidation without detectable depolarisation. Cardiovasc. Res. 72, 322–330. Caldeira Da Silva, C.C., Cerqueira, F.M., Barbosa, L.F., Medeiros, M.H.G., and Kowaltowski, A.J. (2008). Mild mitochondrial uncoupling in mice affects energy metabolism, redox balance and longevity. Aging Cell 7, 552–560. Dmitriev, P., Bou Saada, Y., Dib, C., Ansseau, E., Barat, A., Hamade, A., Dessen, P., Robert, T., Lazar, V., Louzada, R.A.N., et al. (2016). DUX4-induced constitutive DNA damage and oxidative stress contribute to aberrant differentiation of myoblasts from FSHD patients. Free Radic. Biol. Med. 99, 244–258. Jagannathan, S., Shadle, S.C., Resnick, R., Snider, L., Tawil, R.N., van der Maarel, S.M., Bradley, R.K., and Tapscott, S.J. (2016). Model systems of DUX4 expression recapitulate the transcriptional profile of FSHD cells. Hum. Mol. Genet. ddw271. M. Cunha, F., C. Caldeira da Silva, C., M. Cerqueira, F., and J. Kowaltowski, A. (2011). Mild Mitochondrial Uncoupling as a Therapeutic Strategy. Curr. Drug Targets 12, 783–789. Passerieux, E., Hayot, M., Jaussent, A., Carnac, G., Gouzi, F., Pillard, F., Picot, M.C., Böcker, K., Hugon, G., Pincemail, J., et al. (2015). Effects of vitamin C, vitamin E, zinc gluconate, and selenomethionine supplementation on muscle function and oxidative stress biomarkers in patients with facioscapulohumeral dystrophy: A double-blind randomized controlled clinical trial. Free Radic. Biol. Med. 81, 158–169. Plotnikov, E.Y., Silachev, D.N., Jankauskas, S.S., Rokitskaya, T.I., Chupyrkina, A.A., Pevzner, I.B., Zorova, L.D., Isaev, N.K., Antonenko, Y.N., Skulachev, V.P., et al. (2012). Mild uncoupling of respiration and phosphorylation as a mechanism providing nephro- and neuroprotective effects of penetrating cations of the SkQ family. Biochem. Biokhimii︠a︡ 77, 1029–1037. Romaschenko, V.P., Zinovkin, R.A., Galkin, I.I., Zakharova, V. V, Panteleeva, A.A., Tokarchuk, A. V, Lyamzaev, K.G., Pletjushkina, O.Y., Chernyak, B. V, and Popova, E.N. (2015). Low Concentrations of Uncouplers of Oxidative Phosphorylation Prevent Inflammatory Activation of Endothelial Cells by Tumor Necrosis Factor. Biochem. 80, 610–619. Severin, F.F., Severina, I.I., Antonenko, Y.N., Rokitskaya, T.I., Cherepanov, D.A., Mokhova, E.N., Vyssokikh, M.Y., Pustovidko, A. V., Markova, O. V., Yaguzhinsky, L.S., et al. (2010). Penetrating cation/fatty acid anion pair as a mitochondria-targeted protonophore. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 663–668. Sullivan, P.G., Springer, J.E., Hall, E.D., and Scheff, S.W. (2004). Mitochondrial uncoupling as a therapeutic target following neuronal injury. J. Bioenerg. Biomembr. 36, 353–356. Tsumagari, K., Chang, S.-C., Lacey, M., Baribault, C., Chittur, S. V, Sowden, J., Tawil, R., Crawford, G.E., and Ehrlich, M. (2011). Gene expression during normal and FSHD myogenesis. BMC Med. Genomics 4, 67. Zakharova, V. V., Pletjushkina, O.Y., Galkin, I.I., Zinovkin, R.A., Chernyak, B. V., Krysko, D. V., Bachert, C., Krysko, O., Skulachev, V.P., and Popova, E.N. (2017). Low concentration of uncouplers of oxidative phosphorylation decreases the TNF-induced endothelial permeability and lethality in mice. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Basis Dis. 1863, 968–977. | ||
3 | 31 декабря 2017 г.-31 декабря 2018 г. | Изучение роли оксидативного стресса в нарушении дифференцировки миобластов больных мышечной дистрофией Ландузи-Дежерина |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".