ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
|
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Целью данного проекта является изучение роли TASK-1 каналов в регуляции тонуса резистивных артерий разных органов в нормальных физиологических условиях, а также при моделировании сдвигов кислотно-щелочного равновесия.
The project aims to study a completely new fundamental problem - the role of recently described in the vascular bed twopore potassium channels in resistant arteries of rats under normal physiological conditions, as well as in conditions of acidbase balance disturbance. The key role of a number of potassium channel families in the regulation of vascular tone is beyond doubt. It has been proven that channels such as BKCa, Kv, Kir and KATP have an anticontractile influence in arterial smooth muscle; consequently, they counteract the development of contraction. Moreover, they are subject of regulatory influences from the endothelium and various vasoactive substances (Jackson, 2017; Tykocki et al., 2017). The recently described two-pore K2P potassium channels in these respects have not been studied.
В ТЕЧЕНИЕ ПЕРВОГО ГОДА РАБОТЫ (2020-2021 гг.) планируется провести исследования в рамках задач 1, 2 и 3, а именно: (1) сравнить вклад TASK-1 каналов в регуляцию сократительных реакций артерий разных органов крыс с использованием AVE1231; (2) оценить влияние эндотелия на функционирование TASK-1 каналов в артериях разных органов; (3) сопоставить экспрессию мРНК и белка порообразующей субъединицы TASK-1 канала в артериях разных органов; В результате проведенных исследований: (1) будут получены данные об антиконстрикторной роли TASK-1 каналов в артериях разных органов у крыс. Способность TASK-1 каналов проводить выходящий калиевый ток утечки позволяет предположить антиконстрикторную роль этих каналов в гладкой мышце артерий. Мы ожидаем увидеть не одинаковую степень выраженности антиконстрикторной роли TASK-1 каналов в артериях разных органов ввиду регионарной специфичности регуляции кровообращения. (2) будет охарактеризовано влияние эндотелия на функционирование TASK-1 каналов в гладкой мышце артерий разных органов. Другие семейства калиевых каналов подвержены регуляторным влияниям со стороны эндотелия, поэтому мы ожидаем обнаружить модулирующее влияние эндотелия и на TASK-1 каналы. (3) данные функциональных экспериментов будут дополнены молекулярно-биологическими исследованиями, посвященными оценке экспрессии TASK-1 канала в артериях разных органов. Мы ожидаем обнаружить положительные корреляции в степени выраженности антиконстрикторного влияния TASK-1 каналов с уровнем экспрессии его порообразующей субъединицы.
TASK-1 каналы – представители семейства двупоровых калиевых каналов (каналов утечки), обнаруженных в кровеносном русле относительно недавно. Роль TASK-1 каналов в гладкой мышце сосудов, их регуляция под действием различных вазоактивных веществ и эндотелия, а также особенности функционирования в различных регионах сосудистого русла изучены крайне мало. Дело в том, что ранее изучение TASK-1 каналов представлялось проблематичным ввиду отсутствия селективных блокаторов. Однако недавно такое вещество было обнаружено – AVE1231. TASK-1 каналы вызывают особый интерес в связи с присущей им чувствительностью к pH: снижение pH оказывает негативное влияние на TASK-1-опосредуемый ток, а повышение pH, наоборот, активирует TASK-1 каналы. Изменение рН крови может происходить как при нормальных физиологических условиях (рабочая гиперемия, высокая локальная активность мозга) , так и при патологиях (ишемия органов, расстройства метаболизма). Однако сосуды разных органов неодинаково чувствительны к сдвигам рН. Механизм рабочей гиперемии (увеличение кровотока в органе, сопровождающее усиление его функционирования) сильно выражен в артериях скелетных мышц и сердца, но не в коже и почках. Сосуды головного мозга крайне чувствительны к метаболическим факторам (в том числе закислению), содержание которых в ткани увеличивается при высокой активности нейронов, что вызывает расслабление артерий для локального увеличения кровотока в данной области. Реакции артерий разных органов на недостаток кислорода тоже не одинаковы: легочные артерии сокращаются в ответ на гипоксию, тогда как большинство сосудов большого круга кровообращения – расслабляются. Вполне вероятно, что неодинаковая чувствительность артерий разных органов к изменениям pH связана с регионарной специфичностью в роли TASK-1 каналов, однако этот вопрос пока не изучен.
грант РНФ |
# | Сроки | Название |
1 | 23 июля 2020 г.-30 июня 2021 г. | TASK-1 каналы: роль в регуляции тонуса артерий разных органов в норме и при нарушении кислотно- щелочного баланса |
Результаты этапа: В соответствии с планом, заявленным на 2020-2021 гг., мы оценили антиконстрикторный вклад TASK-1 каналов в различных артериях большого круга кровообращения как в присутствии интактного эндотелия, так и в условиях фармакологической блокады эндотелиальных сосудорасширительных путей. Мы изучили, какой из путей релаксирующего влияния эндотелия оказывает наиболее существенное влияние на функционирование TASK-1 каналов. В дополнение к функциональным экспериментам на изолированных артериях, мы провели блок молекулярно-биологических исследований, в рамках которых сравнили экспрессию мРНК и белка TASK-1 канала в артериях разных органов. Кроме того, мы провели сравнительный анализ экспрессии мРНК белков-регуляторов локализации TASK-1 канала в клетке в артериях разных органов. Изменение сформулированного в заявке плана состоит в том, что задача по сравнению экспрессии TASK-1 каналов в артериях с интактным и удаленным эндотелием частично перенесена на следующий год. В связи с небольшим количеством материала (малый размер и тонкая стенка артерий сердца) на данный момент мы находимся в процессе набора образцов. Обработка и анализ данных образцов запланированы на следующий год проекта. Взамен этой задачи задача по сравнению экспрессии мРНК белков-регуляторов локализации TASK-1 канала в клетке была перенесена со второго года проекта на первый и полностью выполнена. Таким образом, общий объем исследований не уменьшился и мы считаем, что все запланированные на 2020-2021гг. задачи проекта выполнены. В УСЛОВИЯХ НАЛИЧИЯ ИНТАКТНОГО ЭНДОТЕЛИЯ TASK-1 КАНАЛЫ НЕ ИГРАЮТ СУЩЕСТВЕННОЙ АНТИКОНСТРИКТОРНОЙ РОЛИ В АРТЕРИЯХ БОЛЬШОГО КРУГА КРОВООБРАЩЕНИЯ Антиконстрикторный вклад TASK-1 каналов в регуляцию тонуса сосудов малого круга кровообращения не вызывает сомнений. Роль TASK-1 каналов в сосудах большого круга кровообращения, играющих ключевую роль в регуляции системного артериального давления, изучена в значительно меньшей степени по сравнению легочными сосудами. Функциональная активность TASK-1 каналов была показана только для некоторых областей системного сосудистого русла. В аорте и подкожной артерии взрослых крыс был продемонстрирован вклад TASK-1 каналов в поддержании мембранного потенциала гладкой мышцы. Участие TASK-1 каналов в рН-индуцированном изменении мембранного потенциала было показано на изолированных гладкомышечных клетках артерий брыжейки крыс. В рамках настоящего проекта впервые проведен обширный сравнительный анализ антиконстрикторной роли TASK-1 каналов в артериях разных органов: мозга, брыжейки, почки, скелетной мышцы и сердца. Важно отметить, что выбранные артерии имеют внутренний диаметр порядка 300 - 400 мкм и принимают участие в регуляции общего периферического сопротивления. Мы продемонстрировали, что в условиях интактного эндотелия TASK-1 каналы не проявляют выраженной антиконстрикторной роли. В дистальных сегментах артерии межжелудочковой перегородки мы наблюдали лишь тенденцию к усилению сократительных ответов. Совокупность наших наблюдений и данных литературы, демонстрирующих отсутствие эффекта AVE1231 на системное артериальное давление взрослой крысы, а также неизмененное давление в сонной артерии у крысы с мутацией, подавляющей активность TASK-1 канала, свидетельствует о том, что на системном уровне в нормальных условиях антиконстрикторный вклад TASK-1 каналов не проявляется. TASK-1 КАНАЛЫ ВНОСЯТ СУЩЕСТВЕННЫЙ АНТИКОНСТРИКТОРНЫЙ ВКЛАД В РЕГУЛЯЦИЮ ТОНУСА ДИСТАЛЬНОЙ ЧАСТИ АРТЕРИИ МЕЖЖЕЛУДОЧКОВОЙ ПЕРЕГОРОДКИ СЕРДЦА В УСЛОВИЯХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ БЛОКАДЫ ЭНДОТЕЛИЯ Мы предположили, что в условиях нормально функционирующего эндотелия антиконстрикторный вклад TASK-1 канала может не проявляться. Иными словами, релаксирующих эндотелиальных факторов оказывается достаточно, чтобы противодействовать возможным просократительным влияниям, одним из которых и является блокада TASK-1 канала. Для проверки этой гипотезы мы провели эксперименты с одновременной блокадой релаксирующих путей эндотелия и TASK-1 каналов. В большинстве исследуемых артерий одновременная блокада эндотелиальных влияний и TASK-1 каналов не привела к дополнительному росту базального тонуса и усилению сократительных ответов. Однако в дистальной части артерии межжелудочковой перегородки сердца в условиях фармакологической блокады сосудорасширительных путей эндотелия TASK-1 каналы проявляют ярко выраженную антиконстрикторную функцию. Наличие эффекта блокады TASK-1 каналов в дистальных, но не проксимальных сегментах может быть связано с гетерогенностью распределения TASK-1 каналов по ходу ветвления артерии межжелудочковой перегородки. Можно предположить, что функциональный вклад и экспрессия TASK-1 каналов выше в более мелких артериях, как это было показано для Kir каналов в артериях почки. Кроме того, в направлении от основания сердца к его верхушке артерия межжелудочковой перегородки истончается и глубже погружается в миокард. В связи с этим дистальные сегменты артерии могут подвергаться большим воздействиям со стороны метаболитов, выделяемых миокардом, в том числе влиянию рН. ПУТЬ NO ВНОСИТ НАИБОЛЬШИЙ ВКЛАД В «МАСКИРОВКУ» АНТИКОНСТРИКТОРНОГО ВЛИЯНИЯ TASK-1 КАНАЛОВ В ДИСТАЛЬНОЙ ЧАСТИ АРТЕРИИ МЕЖЖЕЛУДОЧКОВОЙ ПЕРЕГОРОДКИ СЕРДЦА Известно, что «классические» семейства (BKCa, Kv, Kir и KATP) калиевых каналов гладкомышечных клеток сосудов подвержены модулирующему влиянию со стороны эндотелия. Наиболее ярким примером такого влияния является оксид азота. Выделившийся из эндотелия оксид азота проникает в гладкомышечную клетку, где он запускает активацию растворимой гуанилатциклазы, которая синтезирует cGMP - активатор протеинкиназы G. Протеинкиназа G оказывает положительное влияние на активность BKCa, Kv, Kir и KATP каналов, что способствует расширению сосудов и увеличению кровотока. Регуляция активности TASK-1 каналов со стороны факторов, секретируемых эндотелием, практически не изучена, а немногочисленные результаты таких работ противоречивы. Так, несмотря на наличие в структуре сайтов фосфорилирования протеинкиназой G, не было продемонстрировано влияния NO на активность TASK-1 каналов в гладкомышечных клетках, изолированных из средней мозговой артерии крысы. Другая группа исследователей обнаружила, что активатор растворимой гуанилатциклазы способствует усилению TASK-1-опосредуемого тока в клеточной экспрессионной системе tsA201 (модификация эмбриональных клеток почки человека), что свидетельствует о потенциально положительном влиянии пути NO–sGC–cGMP–PKG на TASK-1 каналы. Принимая во внимание высокую экспрессию белка эндотелиальной NO-синтазы и выраженный вклад пути NO в регуляции тонуса артерий коронарного русла, мы предположили, что именно путь NO «маскирует» антиконстрикторный вклад TASK-1 каналов в дистальной части артерии межжелудочковой перегородки. Эксперименты с использованием ингибитора эндотелиальной NO-синтазы подтвердили данную гипотезу. Действительно, эффект AVE1231 на фоне фармакологической блокады эндотелия оказывается сопоставим с его эффектом на фоне одиночной блокады пути синтеза NO. Неизвестно, оказывает ли путь NO прямое влияние на активность TASK-1 канала путем его фосфорилирования протеинкиназой G или же количества NO, секретируемого эндотелием коронарных сосудов, оказывается просто достаточно, чтобы противодействовать возможным просократительным влияниям без вовлечения TASK-1 каналов. Данный вопрос выходит за рамки данного проекта и является предметом отдельных исследований. СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКА ПОРООБРАЗУЮЩЕЙ СУБЪЕДИНИЦЫ TASK-1 КАНАЛА НАИБОЛЕЕ ВЫСОКО В АРТЕРИЯХ СЕРДЦА, А мРНК – В АРТЕРИЯХ ПОЧКИ Степень проявления антиконстрикторной роли калиевых каналов как правило соотносится с количеством мРНК и белка. В связи с этим, мы сравнили экспрессию порообразующей субъединицы TASK-1 канала в артериях разных органов и сопоставили ее с результатами функциональных экспериментов. Мы продемонстрировали, что на уровне мРНК содержание TASK-1 канала наиболее высоко в артериях легких, несколько меньше в междолевой артерии почки и значительно ниже в артерии брыжейки и сердца. Интересно, что профиль экспрессии на уровне белка отличается от такового на уровне мРНК: содержание белка TASK-1 канала крайне высоко в артериях сердца, ниже в артериях легких (практически в 50 раз), и еще ниже в артериях брыжейки и почки. Такой высокий уровень белка TASK-1 канала в артериях сердца согласуется с функциональными экспериментами о выраженной антиконстрикторной роли этих каналов в артерии межжелудочковой перегородки сердца. Интересно, что уровень мРНК TASK-1 канала в артериях сердца по сравнению с другими артериями оказывается достаточно низким. Возможно, в артериях сердца происходит негативная регуляция экспрессии преимущественно на уровне мРНК. Таким влиянием могут обладать некоторые микроРНК, например микроРНК-138, что было показано в изолированных гладкомышечных клетках легочных артерий человека. Содержание как белка, так и мРНК TASK-1 канала в легочных артериях достаточно высоко, что также согласуется с результатами наших функциональных экспериментов и данными литературы. В артериях брыжейки экспрессия как мРНК, так и белка оказалась достаточно низкой. Это соответствует результатам функциональных экспериментов, в которых нами также не было обнаружено антиконстрикторного вклада TASK-1 каналов ни в условиях интактного эндотелия, ни на фоне его фармакологической блокады. В междолевой артерии почки содержание белка TASK-1 канала оказалось сопоставимо с артерией брыжейки, а мРНК – значительно больше. Несмотря на отсутствие антиконстрикторного вклада TASK-1 каналов в междолевой артерии почки, относительно высокое содержание мРНК гена, кодирующего его порообразующую субъединицу, может служить «резервом», что ускоряет процесс синтеза белка в условиях, отличных от нормальных, например, при сдвиге кислотно-щелочного равновесия. СОДЕРЖАНИЕ мРНК БЕЛКОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ ЛОКАЛИЗАЦИЮ TASK-1 КАНАЛА В КЛЕТКЕ, ВЫШЕ В АРТЕРИЯХ БРЫЖЕЙКИ И ПОЧКИ ПО СРАВНЕНИЮ С АРТЕРИЯМИ СЕРДЦА Для большинства семейств калиевых каналов характерно наличие особых регуляторных субъединиц, оказывающих влияние на различные биофизические свойства канала. Подобных субъединиц не описано для TASK-1 каналов, однако существует ряд белков, способных регулировать положение канала в клетке. Такие белки как p11 (или S100A10), COPI и синтаксин-8, взаимодействуя с особыми участками в структуре TASK-1 канала, способствуют его эндоцитозу и удержанию в саркоплазматическом ретикулуме и аппарате Гольджи. Взаимодействие TASK-1 с белком 14-3-3, напротив, приводит к встраиванию канала в наружную мембрану клетки. Таким образом, проявление антиконстрикторной роли TASK-1 канала может определяться именно количеством канала, встроенного в плазматическую мембрану. Последнее, в свою очередь, определяется балансом влияний от перечисленных выше регуляторных белков. В рамках данного проекта мы впервые сравнили экспрессию известных на сегодняшний момент белков, регулирующих локализацию TASK-1 канала в клетке, в артериях разных органов: сердца, брыжейки и почки. Интересно, что экспрессия мРНК белков, способствующих как встраиванию канала в наружную мембрану, так и белков, опосредующих его эндоцитоз, оказалась выше в артериях брыжейки и почки, чем в артериях сердца. Возможно, TASK-1 каналы артерий брыжейки и почки в большей степени подвержены как «положительным», так и «отрицательным» регуляторным влияниям, что проявляется в условиях сдвига кислотно-щелочного равновесия. | ||
2 | 1 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. | TASK-1 каналы: роль в регуляции тонуса артерий разных органов в норме и при нарушении кислотно- щелочного баланса |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".