![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Целью данного исследовательского проекта является создание подходов снижения уровня Mcl-1L в опухолевых клетках за счет переключения сплайсинга и усиления его деградации. Особое внимание будет уделено изучению механизмов, опосредующих процесс уменьшения количества Mcl-1L при комбинаторном воздействии ограничения питательных веществ и ДНК-повреждающих химиотерапевтических агентов. Следующей целью настоящего проекта является изучение ускорения деградации Mcl-1L с помощью in vitro модели ограничения питательных веществ (ОПВ). Ранее нашей исследовательской группой было показано, что ОПВ приводит к снижению уровня Mcl-1L в опухолевых клетках за счет снижения уровня мРНК Mcl-1L. И такое падение приводит к увеличению чувствительности опухолевых клеток к ДНК-повреждающим химиотерапевтическим препаратам. Однако, остается невыясненным вопрос о вкладе аутофагии в данный процесс и ее влиянии на уровень Mcl-1L.
Nowadays, one of the most important goals for medicine is effective anticancer therapy. In Russia cancer incidence per 100 thousand people has increased up to 20,4% during the last 10 years. In 2016 cancer mortality in Russia was 295 729 patients. Cancer is the second leading cause of death in Russia and the World. Moreover, in Moscow cancer mortality is comparable with cardiovascular mortality. A tumor is an abnormal mass of tissue resulted from several physiological alterations, including an accumulation of genetic mutations and uncontrolled cell division. Due to multiple genetic mutations tumor cells gain a number of features including sustainability to programmed cell death (PCD). Apoptosis is one of the best known PCD modes. This process is controlled by a number of genes and proteins among those Bcl-2 protein family plays a key role. Bcl-2 family includes anti- and proapoptotic proteins. Cancer cell resistance to apoptosis is associated with overexpression of the antiapoptotic members of Bcl-2 family proteins, in particular, Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1. Subsequently, these proteins represent perspective targets for anticancer therapy. We aim to investigate mechanisms of Mcl-1 targeting via its downregulation to promote tumor cell death. Caloric restriction will be used for enhancement of Mcl-1 degradation. We will study a role of autophagy in Mcl-1 degradation and tumor cell death induced by combination of caloric restriction and treatment with DNA-damaging agents. In addition, we will be focused on the attempt to switch the alternative splicing of antiapoptotic Mcl-1L mRNA to the proapoptotic Mcl-1S isoforms in response to different stress stimuli. In this way we will clarify the mechanism of promotion of cancer cell death by means of Mcl-1 degradation in order to improve anticancer therapy.
Подходы к снижению уровня антиапоптотического белка Mcl-1L и механизм переключения сплайсинга изоформ являются актуальной, но малоизученной задачей молекулярной медицины и онкобиологии. В ходе работы планируется изучить возможность переключения альтернативного сплайсинга анти- и проапоптотической изоформ Mcl-1 в контексте чувствительности опухолевых клеток к индукции ПКГ. Ответ на вопрос, происходит ли такое переключение и как его регулировать, будет способствовать развитию новых подходов к увеличению чувствительности раковых клеток к ДНК-повреждающим препаратам. Более того, изучение механизма такого переключения даст ключ к пониманию, какие белки регулируют этот процесс, и каким образом возможно таргетировано влиять на их активность и переключение сплайсинга между Mcl-1L и Mcl-1S. Помимо этого, анализ образцов нормальных и опухолевых тканей пациентов с карциномой яичника даст новую информацию о значимости соотношения анти- и проапоптотической изоформ Mcl-1 для тяжести течения заболевания. С учетом того, что специфический ингибитор Mcl-1L уже проходит клинические испытания, исследование значимости Mcl-1L в отдельных типах опухолей вызывает повышенный интерес. Изучение процесса деградации Mcl-1L под воздействием сочетания депривации сыворотки, что имитирует ограничение питательных веществ, и ДНК-повреждающих химиотерапевтических препаратов внесет существенный вклад в понимании роли аутофагии в борьбе с опухолевыми заболеваниями. На сегодня роль аутофагии в проблеме канцерогенеза и противоопухолевой терапии неясна, и также неясно, стоит ли стимулировать данный процесс в ходе лечения таких болезней. Таким образом, предлагаемое исследование даст ключ к пониманию подходов снижения уровня антиапоптотического белка Mcl-1L для увеличения чувствительности опухолевых клеток к терапевтическим воздействиям.
Члены научного коллектива обладают большим опытом работы в области исследования различных типов клеточной гибели, включая апоптоз. В частности, подобный опыт включает оценку клеточной гибели с помощью различных современных биохимических подходов, таких как анализ белков-маркеров апоптоза и аутофагии методом Вестерн-блота, измерение субстратной активности каспаз и определение величины апоптотической популяции клеток методом проточной цитофлуориметрии. Для реализации проекта члены научного коллектива имеют доступ к приборам, необходимым для реализации различных аналитических задач: проточному цитофлуориметру, детектирующему амплификатору для выполнения ПЦР в реальном времени, конфокальному микроскопу, оборудованию для выполнения Вестерн-блот анализа и др. В лаборатории, обеспечивающей работу членов научного коллектива, имеется богатая коллекция опухолевых клеточных линий. Также для анализа получен ряд клинических образцов нормальных и опухолевых тканей, полученных от пациентов с карциномой яичника. Руководитель проекта имеет опыт непосредственно в области изучения белка Mcl-1. В частности, имеются данные о зависимости выживаемости различных опухолевых клеточных линий от данного белка, а также реактивы, необходимые для анализа уровня Mcl-1 (антитела для иммуноцитохимии и метода Вестерн-блот анализа, малые интерферирующие РНК для подавления синтеза Mcl-1, а также конструкции для оверэкспрессии данного белка)
В рамках проекта была создана экспериментальная модель селективной детекции мРНК Mcl-1L и Mcl-1S методом ПЦР в реальном времени, а также различения белковых форм Mcl-1S и фрагментов деградации Mcl-1 при анализе методом Вестерн-блота. С помощью указанных моделей было показано, что низкие концентрации ДНК-повреждающих препаратов цисплатина, доксорубицина и этопозида не вели к накоплению белка Mcl-1S. Низкие концентрации монастрола, индуцирующего обратимый арест клеточного цикла, вели лишь к незначительному увеличению уровня Mcl-1S, однако вызывали выраженное накопление соответствующей мРНК. Была выявлена аккумуляция Mcl-1S в предмитотической и митотической стадиях клеточного цикла нормальных и опухолевых клеток и обнаружена транслокация Mcl-1S в ядро. Mcl-1S оказывал влияние на клеточный цикл, ускоряя продвижение клеток через S-фазу. Снижение уровня Mcl-1L также вело к ускорению прохождения через S-фазу. Эти данные позволяют предположить, что действие Mcl-1S в контексте влияния на клеточный цикл опосредуется через ингибирование Mcl-1L. В то же время действие селективного антагониста Mcl-1L, препарата S63845, не приводило к ускорению прохождения клеточного цикла. Эти данные позволяют предположить, что ингибирование Mcl-1 с помощью BH3-миметиков безопасно в контексте их влияния на клеточный цикл. Что касается повышенной экспрессии Mcl-1S, она отражалась в накоплении повреждений ДНК, что может быть прямым следствием ускоренного прохождения клеток через S-фазу. Для изучения роли аутофагии в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающего препарата цисплатина в условиях депривации сыворотки (SD – serum deprivation) был использован ингибитор аутофагии Бафиломицин A1. Ингибирование процесса аутофагии в опухолевых клетках, обработанных цисплатином в бессывороточной среде, оказывало различное влияние на уровень гибели в клеточных линиях Caov-4 (усиление гибели) и HeLa (снижение гибели). В обеих клеточных линиях действие ингибитора аутофагии Бафиломицина A1 вело к стабилизации Mcl-1 в клетках, обработанных цисплатином в условиях депривации сыворотки. Эти данные предполагают, что аутофагия может отвечать за деградацию Mcl-1 при генотоксическом стрессе в условиях SD. В то же время, в клетках U1810 деградация Mcl-1 наблюдалась только при культивировании клеток в среде HBSS, содержащей сниженное количество питательных веществ, но не в условиях SD. Следовательно, в данной клеточной модели для деградации Mcl-1 требовался более сильный стимулятор процессов аутофагии. Примечательно, что использование нокаутных по аутофагии клеток U1810 ATG13КО или применение ингибитора аутофагии Бафиломицина А1 не предотвращало падения уровня Mcl-1, что свидетельствовало об ином, не зависящем от аутофагии, механизме его деградации. Использование ингибитора протеасом MG-132 приводило к стабилизации Mcl-1 в условиях культивации в среде HBSS в клетках U1810, что говорит о протеасомо-зависимой деградации данного белка. Таким образом, деградация Mcl-1 в клетках U1810 в условиях ограничения питательных веществ происходит независимо от аутофагии.
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 6 марта 2020 г.-31 декабря 2020 г. | Повышение чувствительности опухолевых клеток к терапии путем таргетирования антиапоптотического белка Mcl-1 |
Результаты этапа: Селективная детекция изоформ Mcl-1S и Mcl-1L с помощью ПЦР в реальном времени требует подбора праймеров, специфичных для каждого транскрипта, при этом один из пары праймеров для короткой изоформы должен располагаться на стыке экзонов ("splice-junction"), соседствующих после исключения промежуточного экзона (для изоформы Mcl-1S: стык экзонов 1 и 3 после исключения экзона 2 в процессе АС). Создание обычного праймера, специфичного к splice-junction, является наиболее простым, экономичным и, как правило, достаточным для реализации поставленных задач. Подбор праймеров осуществляли с помощью онлайн-ресурса NCBI Primer-BLAST (NIH), также дающего возможность выявить неспецифические внутриклеточные мишени подобранных праймеров и избежать нежелательных продуктов амплификации. Помимо этого, придерживались стандартных эмпирических критериев подбора праймеров для ПЦР в реальном времени (размер праймера - 15-25 п.н., длина полученных ампликонов 75-200 п.н. и другие). Селективность подобранных праймеров была проверена методом качественной ПЦР и секвенированием продуктов амплификации (секвенирование образцов после постановки количественной ПЦР было выполнено компанией Евроген, Россия). Полученные результаты свидетельствовали о создании селективных условий для изучения экспрессии MCL-1L и MCL-1S методом ПЦР в реальном времени. Доступные для покупки первичные антитела, распознающие Mcl-1L, также детектируют Mcl-1S, более того они способны распознавать и их протеолитические фрагменты, содержащие эпитоп узнавания. Необходимо отметить, что антител для иммуноблоттинга, узнающих только Mcl-1S, но не Mcl-1L, в литературе не описано и также не было обнаружено у коммерческих предприятий. Для отличия с помощью Вестерн-блота Mcl-1S от других белковых форм, узнаваемых антителами к Mcl-1, необходим либо параллельный мониторинг каждого эксперимента методом ПЦР в реальном времени, либо введение положительного контроля. Первый способ не является предпочтительным, так как не дает прямого подтверждения того, что детектируемая методом Вестерн-блота полоса, по интенсивности коррелирующая с уровнем мРНК, относится именно к Mcl-1S. Более того, повышение уровня мРНК не всегда коррелирует с повышением уровня белкового продукта, что может вести к отсутствию согласованности между двумя измерениями разными методами. В связи с этим было принято решение ввести положительный контроль, позволяющий четко определять положение полосы Mcl-1S при иммуноблоттинге. Повышение уровня Mcl-1S в положительном контроле достигали с помощью фармакологического ингибирования белка сплайсосомы SF3B1, приводящее к проапоптотическому сплайсингу пре-мРНК MCL1. Для этого был использован низкомолекулярный ингибитор FR901464. Повышенный уровень MCL-1S при действии FR был подтвержден методом количественной ПЦР. Действие FR901464 также вело к появлению характерной полосы с молекулярной массой, соответствующей массе Mcl-1S , что показывает, что данный агент может быть использован в качестве положительного контроля для детекции Mcl-1S с помощью метода Вестерн блота. Далее была протестирована способность различных генотоксических агентов вести к повышению уровня Mcl-1S. С этой целью клетки HEK293T обрабатывали разными концентрациями цисплатина (3-15 мкМ), доксорубицина (0,1-2 мкМ) или этопозида (0,3-8 мкМ) в течение 16 часов либо постоянной дозой доксорубицина (0,5 мкМ) для разных периодов инкубации. Как можно судить по ATR / ATM-опосредованному фосфорилированию p53, указанные препараты вели к инициации клеточного ответа на повреждение ДНК. Тем не менее, ни один из указанных агентов не вел к накопления белка Mcl-1S. Дальнейшим этапом исследования стало изучение эффектов агента монастрола, обратимо нарушающего прогрессию клеточного цикла за счет ингибирования моторного белка кинезина-5. В отличие от ДНК-повреждающих агентов, действие монастрола фазоспецифично к G2/M-стадиям и опосредовано другим механизмом – нарушением динамики микротрубочек. Мы обнаружили, что обработка клеток HEK293T в течение 24 ч приводила к небольшому увеличению уровня белка Mcl-1S лишь при использовании низких концентраций агента (25мкМ), тогда как стандартные более высокие концентрации монастрола не вели к изменению уровня белка Mcl-1S. В отличие от изменений в уровне белка, уровень мРНК Mcl-1S значительно повышался (в среднем в 6.89 раз) по сравнению с контрольным уже после 4 ч инкубации клеток HEK293T с монастролом в концентрации 25 мкМ и достигал 14-кратного повышения после 24 ч обработки монастролом в указанной концентрации. В то же время значимое накопление MCL-1S по сравнению с контролем при обработке 100 мкМ монастролом отмечалось лишь на 24 ч и было ниже такового при действии 25 мкМ. Чтобы определить, происходит ли накопление Mcl-1S в процессе клеточного цикла, клетки HEK293T были синхронизированы в G1/S-фазах путем двойного тимидинового блока. Затем клетки дважды промывали PBS и добавляли среду DMEM с содержанием эмбриональной телячьей сыворотки 10% и смесью антибиотик-антимикотик Gibco. По истечении указанного времени (2, 4, 6 или 8 ч) клетки анализировали с помощью методов Вестерн-блот анализа и проточной цитометрии. Было обнаружено, что уровень белка Mcl-1S возрастает по мере входа клеток в предмитотическую и митотическую фазы. Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемый эффект специфичен только для клеток HEK293T, был проведен анализ уровня белка Mcl-1S в фазах S и G2/M на клеточных линиях разного происхождения. В экспериментах помимо HEK293T были использованы клеточная линия эмбриональных фибробластов легкого – IMR90 и клеточные линии опухолевой этиологии – HeLa (аденокарцинома шейки матки), Caov-4 (аденокарцинома яичников), HCT116 (колоректальная карцинома), U1810 (немелкоклеточная карцинома легкого). Тенденция к накоплению изоформы Mcl-1S в фазе G2/M сохранилась во всех клеточных линиях. Тем не менее, выраженность эффекта варьировала между разными клеточными линиями. Возможным объяснением этому являются различные внутриклеточные условия, а также разная эффективность синхронизации в подобранной экспериментальной модели. В следующей части данного проекта мы изучили влияние ингибирования аутофагии на клеточную гибель в условиях генотоксического стресса и ограничения питательных веществ. Известно, что удаление факторов роста и питательных веществ из среды может приводить к усилению процессов аутофагии. Следовательно, мы выбрали депривацию сыворотки как потенциальную in vitro модель ограничения питательных веществ. Для определения интенсивности процессов аутофагии в выбранной экспериментальной модели исследовали уровень маркера аутофагии белка LC3 в клетках линий Caov-4 и HeLa. Стимулирование аутофагии приводит к конъюгации LC3-I с фосфатидилэтаноламином и появлению активной формы LC3-II, которая обладает большей электрофоретической подвижностью и детектируется в геле ниже, чем LC3-I. Повышение соотношения LC3-II/ LC3-I, как правило, свидетельствует об усилении в клетке процессов аутофагии. Для анализа уровня аутофагии клетки Caov-4 и HeLa инкубировали в стандартной среде или в условиях SD c добавлением цисплатина или без него в течение 2, 6, 12 или 18 часов, в качестве контроля клетки инкубировали в течение 2 часов в стандартной среде. Вестерн-блот анализ показал, что в условиях SD происходило накопление LC3-II, что свидетельствует о выраженном усилении аутофагии уже спустя 2 часа культивирования вне зависимости от присутствия цисплатина. Добавление цисплатина не влияло на перераспределение двух форм LC3 в течение 18 часов после начала инкубации. Далее была проведена оценка влияния ингибиторов аутофагии на интенсивность клеточной гибели и уровень антиапоптотического белка Mcl-1. С этой целью клетки Caov-4 и HeLa были предварительно обработаны ингибитором аутофагии Бафиломицином A1 в концентрации 50 нМ, после чего клеточную гибель индуцировали 70 мкМ цисплатина в стандартной или бессывороточной средах в течение 18 часов. Об эффективности ингибирования аутофагии судили по накоплению форм LC3I и LC3II, а также по уровню белка p62, который отвечает за доставку убиквитинилированных белков в аутофагосомы. Kлеточную гибель регистрировали по появлению одного из маркеров апоптоза – фрагмента p89 белка PARP. Данный фермент отвечает за репарацию ДНК при повреждениях. Расщепление PARP эффекторными каспазами ведет к его инактивации и свидетельствует об интенсивности протекания процессов апоптоза в клетке. Добавление Бафиломицина A1 снижало деградацию PARP и накопление фрагмента р89 после обработки клеток цисплатином в условиях SD, что свидетельствовало об уменьшении уровня клеточной гибели в клетках HeLa, в то время как в клетках Caov-4 аналогичные условия вели к увеличению клеточной гибели. Вестерн-блот анализ также показал, что действие Бафиломицина A1 ведет к стабилизации Mcl-1 в зависимости от способа обработки и типа клеток. Так, в клетках Caov-4 Бафиломицин A1 вел к стабилизации Mcl-1 в клетках, обработанных цисплатином, как в стандартной, так и в бессывороточной средах. В клетках HeLa стабилизирующий эффект Бафиломицина A1 на Mcl-1 наблюдался только при обработке цисплатином в условиях SD. С целью количественной оценки влияния ингибирования аутофагии посредством Бафиломицина A1 на величину апоптотической популяции при действии цисплатина был проведен цитофлуориметрический анализ с окраской Аннексином V-FITC и йодидом пропидия клеток Caov-4 и HeLa, обработанных Бафиломицином A1 в конечной концентрации 50 нМ. Время инкубации обеих клеточных линий с цисплатином составляло 18 часов. Показано, что в клетках Caov-4 при действии цисплатина независимо от среды культивирования Бафиломицин A1 ведет к небольшому увеличению популяции гибнущих клеток (т.е. клеток, которые прокрашивались Аннексином V-FITC и/или йодидом пропидия). В то же время в клетках HeLa Бафиломицин A1 вел к выраженному снижению (свыше 20% от общего числа клеток в популяции) клеточной гибели при действии цисплатином в условиях SD, в то время как в стандартной среде эффект был минимален. | ||
2 | 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. | Повышение чувствительности опухолевых клеток к терапии путем таргетирования антиапоптотического белка Mcl-1 |
Результаты этапа: Из литературы известна роль Mcl-1S в связывании Mcl-1L и нейтрализации его антиапоптотической активности. В то же время отсутствуют данные о неапоптотической роли Mcl-1S, потому изучение этого вопроса являелось одной из задач исследования. Чтобы оценить влияние Mcl-1S на клеточный цикл, клетки HEK293T исследовали на разных стадиях клеточного цикла после оверэкспрессии Mcl-1S. Клетки трансфицировали плазмидой pcDNA3-hMcl-1S в течение 24 ч, затем синхронизировали двойным тимидиновым блоком (18 + 9 + 18 ч) и анализировали через разные периоды выхода из блока. Клетки с оверэкспрессией Mcl-1S показали статистически значимо более высокую скорость прохождения через S-фазу через 4 часа и тренд через 6 и 8 часов после высвобождения из блока, сравнение сделано с соответствующими контрольными группами. Оверхэкспрессия Mcl-1S также приводила к изменению перехода клеток из фазы G1 в фазу S по сравнению с контролем. Так, 48% клеток с оверэкспрессией Mcl-1S были обнаружены в фазе G1 через 4 часа после высвобождения по сравнению с 35% контрольных клеток. Различия в содержании клеток в фазе G1 между контрольными клетками и клетками, оверэкспрессирующими Mcl-1S, были статистически значимыми для всех исследованных временных точек. Нокдаун Mcl-1L с помощью siRNA продемонстрировал аналогичную тенденцию: клетки с дефицитом Mcl-1L быстрее переходили в стадию G2/M, хотя увеличение скорости прогрессии в данную фазу было менее выраженным. Следует отметить, что использованная siRNA (смысловая цепь: 5’-GCATCGAACCATTAGCAGAdTdT-3’) нацелена специфично на транскрипт Mcl-1L, но не Mcl-1S. Менее выраженный эффект нокдауна Mcl-1L (в сравнении с оверэкспрессией Mcl-1S) можно объяснить недостаточным снижением уровня Mcl-1 с помощью siRNA-опосредованного нокдауна. С учетом специфического антагонистического влияния Mcl-1S на Mcl-1L, наблюдаемые результаты могут свидетельствовать о том, что Mcl-1S действует как ингибитор Mcl-1L в регуляции клеточного цикла. Далее было изучено, оказывают ли специфические антагонисты Mcl-1L схожее влияние на прогрессию клеточного цикла. С этой целью был использован высокоселективный антагонист Mcl-1, BH3-миметик S63845. Условия экспериментов были аналогичны описанным выше для оверэкспрессии Mcl-1S / нокдауна Mcl-1L. Примечательно, что даже высокие концентрации соединения не вызывали апоптоза в исследуемой клеточной линии. Известно, что связывание S63845 приводит к стабилизации Mcl-1L, поэтому накопление Mcl-1L служит индикатором взаимодействия S63845 с мишенью. Соответственно, в экспериментах, связанных с клеточным циклом, использовалась концентрация S63845 300 нМ, поскольку эта доза позволяла получить максимальное накопление Mcl-1L. Не было обнаружено нарушений клеточного цикла при действии S63845 в используемой экспериментальной модели. Эти результаты подтвердили безопасность S63845 в контексте влияния данного препарата на клеточный цикл в указанной концентрации. Обнаруженная при оверэкспрессии Mcl-1S или нокдауне Mcl-1L более быстрая прогрессия через S фазу клеточного цикла может приводить к накоплению повреждений ДНК по сравнению с контрольными группами. Чтобы проверить, накапливают ли клетки с оверэкспрессией Mcl-1S больше повреждений ДНК, чем контрольные клетки, мы провели 16-часовые инкубации в негенотоксических условиях, а также с концентрациями ДНК-повреждающих агентов, достаточными для индукции ответа на повреждение ДНК (что можно оценить по фосфорилированию p53 по сайту Ser15), но не влияют на уровень белка Mcl-1L: 3 мМ цисплатина, 0,3 мМ доксорубицина или 1 мМ этопозида. Действительно, клетки, трансфицированные плазмидой pcDNA3-hMcl-1S, демонстрировали более высокую степень фосфорилирования H2A.X по Ser139 (γ-H2A.X, маркер повреждения ДНК) в сравнении с контрольными клетками как без ДНК-повреждающих агентов, так и при генотоксическом стрессе. Обработка доксорубицином и этопозидом приводила к 2-3-кратному увеличению накопления γ-H2A.X при оверэкспрессии Mcl-1S по сравнению с контрольными клетками. При обработке цисплатином было обнаружено 25-кратное увеличение уровня фосфорилирования H2A.X, что подтверждает чрезвычайно выраженное накопление повреждений ДНК в клетках, оверэкспрессирующих Mcl-1S. Накопление повреждений ДНК было выше в сравнении с контрольными клетками и в клетках с siRNA-опосредованным нокдауном Mcl-1L. Однако увеличение уровня маркера повреждения ДНК, γ-H2A.X, было менее выраженным по сравнению с оверэкспрессией Mcl-1S, что может быть связано с недостаточной эффективностью нокдауна Mcl-1L. Примечательно, что BH3-миметик S63845, для которого в приведенных выше экспериментах показано отсутствие влияния на клеточный цикл, не влиял и на накопление повреждений ДНК. В целом эти результаты демонстрируют, что оверэкспрессия Mcl-1S приводит к накоплению повреждений ДНК. Нокдаун Mcl-1 также способствует увеличению повреждения ДНК, хотя и в меньшей степени. Действие высокоселективного BH3-миметика к Mcl-1 не влияло на накопление повреждений ДНК. Эти данные указывают на то, что BH3-миметики к Mcl-1 лишены неспецифического влияния на прогрессию клеточного цикла, что может иметь значимость в случае применения данных агентов в качестве лекарственных препаратов. Для дальнейшего изучения роли аутофагии во влиянии на уровень Mcl-1 в условиях ограничения питательных веществ (ОПВ) была использована мутантная линия клеток аденокарциномы легкого U1810, нокаутных по гену ATG13, кодирующему одноименный белок, отвечающий за формирование фагосом. В экспериментах использовалась как данная нокаутная линия – U1810 ATG13КО, так и клетки дикого типа U1810. В качестве модели ОПВ использовали не только условия SD, но и альтернативную модель – культивирование клеток в среде HBSS. Для анализа уровня аутофагии клетки U1810 инкубировали в стандартной среде (среда RPMI), в условиях ОПВ в течение 2, 6, 12 или 18 часов, в качестве контроля клетки инкубировали в течение 2 часов в стандартной среде. Методом Вестерн-блот анализа был оценен уровень белка Mcl-1, а также уровень маркеров аутофагии (белков LC3 и р62). Показано, что условия SD не влияли на уровень белка Mcl-1 в клетках U1810, в то время как культивация клеток в среде HBSS на более поздних временных точках (12 и 18 часов) приводила к снижению уровня Mcl-1 практически в 2 раза. Важно отметить, что и условия SD, и условия HBSS приводили к эффективному запуску аутофагии, несмотря на различие уровней LC3-II в используемых экспериментальных моделях. Эту разницу можно объяснить тем, что при усилении уровня аутофагии деградация LC3-II может происходить быстрее преобразования формы LC3-I в LC3-II, что осложняет анализ изменения соотношения LC3-II/LC3-I в разных условиях. Такая деградация отражается в сниженном соотношении LC3-II/LC3-I и может быть неправильно интерпретирована. Тем не менее, в условиях HBSS наблюдалась более выраженная деградация белка р62, чем в условиях SD, что свидетельствует о высокой интенсивности процесса аутофагии. Таким образом, более «жесткие» условия ОПВ, полученные при помощи культивирования клеток U1810 в среде HBSS, приводили к выраженной деградации белка Mcl-1, чего не наблюдалось в случае инкубирования в бессывороточной среде. Для выяснения причин деградации Mcl-1 в условиях, стимулирующих аутофагию, к клеткам U1810, растущим в стандартных условиях и в среде HBSS, был добавлен ингибитор аутофагии Бафиломицин A1 в концентрации 50 нМ. Аналогичным образом были обработаны клетки U1810 ATG13КО, в которых нарушена возможность протекания процесса аутофагии. Клетки культивировались в указанных условиях в течение 18 часов. Методом Вестерн-блот анализа был оценен уровень белка Mcl-1, а также уровень маркеров аутофагии (белков LC3 и р62). Показано, что снижение уровня Mcl-1 в условиях HBSS наблюдалось как в случае нокаутных по аутофагии клеток U1810 ATG13КО, так и при применении Бафиломицина А1. Таким образом, суммируя полученные результаты, сделан вывод, что деградация Mcl-1, наблюдаемая в условиях ОПВ, не связана с процессами аутофагии. Как было показано выше, деградация Mcl-1 при культивировании в среде HBSS происходила вне зависимости от процессов аутофагии. Вследствие этого было выдвинуто предположение, что потенциальной причиной снижения уровня данного антиапоптотического белка может стать усиление протеасомной деградации в условиях резкого ограничения питательных веществ. С этой целью к клеткам U1810, культивируемым в стандартных условиях или в среде HBSS, был добавлен ингибитор протеасом MG-132 в концентрации 10 мкМ за 2 часа до приготовления клеточных лизатов. Аналогичным образом были обработаны клетки U1810 ATG13КО, в которых нарушена возможность протекания процессов аутофагии. Методом Вестерн-блот анализа оценивали уровень белка Mcl-1, а также уровень маркеров протеасомной деградации белков (общего убиквитина и убиквитина К48 – цепи полиубиквитина, конъюгированные через остаток лизина К48). Было показано, что уровень короткоживущего белка Mcl-1 возрастал в несколько раз под действием ингибитора протеасом MG-132 в обеих линиях клеток при культировании в стандартной среде, причем более выраженное увеличение Mcl-1 наблюдалась в клетках U1810 ATG13КО. Кроме того, в стандартных условиях роста уровень общего убиквитина и убиквитина К48 был выше в клетках U1810 ATG13КО по сравнению с клетками дикого типа. Данная разница увеличивалась при обработке клеток ингибитором протеасом MG-132, что свидетельствует о том, что в нокаутных по аутофагии клетках U1810 ATG13КО более интенсивно происходят процессы протеасомной деградации по сравнению с клетками U1810 при культивировании в стандартной среде. В условиях HBSS наблюдалось уменьшение стабилизации Mcl-1 в клетках U1810 при обработке MG-132, в то время как в аналогичных условиях в клетках U1810 ATG13КО – отсутствие этой стабилизации, что, по-видимому, связано с усилением гибели нокаутных по аутофагии клеток при культивировании в среде HBSS. Более того, в условиях HBSS снижался уровень общего убиквитина и убиквитина К48, наибольшая разница с инкубацией в нормальной среде была детектирована при использовании ингибитора протеасом. Суммарно эти данные свидетельствуют о том, что культивирование клеток в среде HBSS ведет к торможению процессов протеасомной деградации, что согласуется с литературными данными. Таким образом, было продемонстрировано, что в условиях недостатка питательных веществ деградация антиапоптотического белка Mcl-1 происходила по протеасомному пути. | ||
3 | 1 января 2022 г.-6 марта 2022 г. | Повышение чувствительности опухолевых клеток к терапии путем таргетирования антиапоптотического белка Mcl-1 |
Результаты этапа: |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".