|
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Простагландин-H-синтаза: исследование нового механизма ингибирования димерного фермента и целенаправленный поиск необратимых ингибиторов нового типаНИР
Prostaglandin-H-synthase: research of the new mechanism of dimeric enzyme's inhibition and direct search of the new type of irreversible inhibitors
- Руководитель НИР: Вржещ П.В.
- Участники НИР: Бархатов В.И., Берзова А.П., Ефремов А.А., Котлов Н.Ю., Кривошей А.В., Кузнецова М.А., Митрофанов С.И., Нуждина Е.О., Филимонов И.С., Швецова Е.Т.
- Подразделение: Международный биотехнологический центр
- Срок исполнения: 11 января 2016 г. - 31 декабря 2018 г.
- Номер договора (контракта, соглашения): 16-04-00737\18
- Номер ЦИТИС: АААА-А16-116020110031-8
- Тип: Фундаментальная
- Приоритетное направление научных исследований: другое
- Приоритеты и перспективы НТР Российской Федерации согласно Стратегии НТР РФ: переход к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения
- ПН России: Науки о жизни
- Направление технологического прорыва России: Медицинские технологии и лекарственные средства
- Критическая технология России: Биомедицинские и ветеринарные технологии
-
Рубрики ГРНТИ:
- 31.27.17 Энзимология
- 34.45.05 Методы доклинического исследования и отбора лекарственных средств
- Классификатор OECD: Биохимические методы исследования, Фармакология и фармацевтика
-
Ключевые слова:
ингибирование, нпвп, необратимые ингибиторы, циклооксигеназная активность, димерный фермент, простагландин-h-синтаза, кооперативные взаимодействия, in silico, кинетическое моделирование, докинг, in vitro
irreversible inhibitors, cyclooxygenase activity, docking, in vitro, cooperations, inhibition, computer modelling, nsaids, dimeric enzyme, prostaglandin h synthase, kinetic modelling, in silico -
Описание:
Димерный белок простагландин-H-синтаза (PGHS) - ключевой фермент биосинтеза простаноидов, регуляторов развития воспаления и функционирования репродуктивной, кровеносной и других систем организма. Молекула белка одновременно катализирует циклооксигеназное окисление арахидоновой кислоты и последующее пероксидазное восстановление, и при этом подвергается необратимой инактивации в ходе катализа. Ингибиторы PGHS – нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) – применяются для снижения температуры, борьбы с воспалением и болями, при многих других медицинских показаниях. Нами обнаружено, что кинетика действия принадлежащего к НПВП ингибитора напроксена не соответствует традиционно постулируемым механизмам и не описывается ни одной из существующих кинетических моделей. Предлагаемый нами новый кинетический механизм, учитывающий кооперативные взаимодействия между субъединицами фермента, позволяет адекватно описать экспериментальные данные и, соответственно, фармакологические свойства препаратов на основе этого ингибитора. Это наблюдение приводит к необходимости пересмотра кинетических механизмов других ингибиторов, имеющих фармакологическое значение, и в рамках настоящей работы планируется в первую очередь исследовать такие ингибиторы, как ибупрофен, индометацин, диклофенак, кеторолак. В работе также планируется путём расчётов найти структуры ингибиторов, контактирующих с радикалом остатка Tyr385 в активном центре фермента, осуществить дизайн новых потенциальных ингибиторов, содержащих антиоксидантные группы, для создания необратимых ингибиторов нового типа. С помощью последовательного применения молекулярного моделирования кооперативных взаимодействий и применения метода докинга планируется найти синергичные ингибиторы димерной PGHS, при совместном применении взаимно усиливающие сродство друг друга к ферменту.
-
Планируемые результаты:
Ожидаемые результаты за первый год: 1) Установлен механизм ингибирования PGHS для следующих ингибиторов: ибупрофен, индометацин, диклофенак, кеторолак с учётом влияния на начальную скорость реакции, константу скорости инактивации, предельный выход продукта реакции. 2) Разработан и применён новый метод непрерывного определения зависимости константы скорости инактивации от концентраций субстратов и ингибиторов из интегральных кривых для изучения ингибирования PGHS. 3) Проведена классификация ингибиторов по типу влияния на уровень предельного выхода продукта реакции в зависимости от механизма ингибирования инактивирующегося фермента. 4) Найдены новые ингибиторы PGHS путём проведения докинга для банка из нескольких тысяч соединений с использованием наиболее подходящей программы и структуры белка. Найденные ингибиторы проверены in vitro. Ожидаемые результаты за второй и третий год: 1) Установлены кинетические механизмы для найденных новых ингибиторов. 2) С помощью компьютерного моделирования описан механизм конформационных изменений при связывании лиганда с субъединицей фермента в составе димера. Найдены пары синергичных ингибиторов, повышающих сродство друг друга к ферменту, а также лиганды, способные за счет кооперативных взаимодействий уменьшать скорость инактивации фермента в процессе реакции и увеличивать выход продукта реакции. 3) Разработан автоматический алгоритм поиска новых ингибиторов PGHS, проведён докинг для PGHS с различной конформацией активного центра. 4) Предсказаны свойства найденных новых ингибиторов на основе классификации по положению в активном центре и образуемым связям. 5) Выделены классы лигандов, контактирующих с остатком Tyr385. Лиганды из этого класса модифицированы с добавлением в их структуру антиоксидантных групп. Созданы необратимые ингибиторы нового типа.
-
Научный задел:
В работах научного коллектива имеется теоретический и экспериментальный задел, позволяющие выполнить поставленные задачи: 1) Разработан метод исследования многосубстратных бифункциональных ферментов, подвергающихся инактивации в ходе реакции. 2) Разработан метод дискриминации механизмов ферментативных реакций, заключающийся в экспериментальном измерении кинетической связности промежуточных форм фермента и дальнейшем выделении класса кинетических моделей, адекватно описывающих полученные экспериментальные результаты. 3) Налажены методики выделения и очистки PGHS-1 из везикулярных желёз барана, определения ферментативной активности. 4) Обнаружено, что взаимодействие напроксена с PGHS описывается в рамках кооперативных взаимодействий субъединиц димерного фермента. 5) Для водно-органических сред разработан кинетический подход для определения истинных кинетических параметров фермента, не зависящих от содержания мицеллярной фазы. 6) Обнаружен кинетический кооперативный эффект PGHS-1 по арахидоновой кислоте. 7) Разработан метод определения кинетического механизма действия и инактивации многосубстратного фермента на примере PGHS. 8) Разработан численный метод взвешенной верификации программ докинга. 9) Обнаружено парадоксальное влияние некоторых циклооксигеназных ингибиторов на инактивацию фермента в процессе циклооксигеназной реакции и на инактивацию фермента в процессе пероксидазной реакции.
-
Основные результаты:
Осуществлено исследование кинетики мембранного фермента PGHS в водно-мицеллярной среде. Учтено распределение субстратов между водной и мицеллярной фазами, получены истинные значения констант Михаэлиса для арахидоновой кислоты и для растворенного кислорода как для мицеллярной, так и водной фаз, оценены значения коэффициента распределения арахидоновой кислоты между гидрофобной фазой и активным центром PGHS и коэффициента распределения арахидоновой кислоты между мицеллярной и водной фазами. На примере кооперативного ингибитора напроксена показано, что изменение содержания мицеллярной фазы влияет на параметры ингибирования вследствие распределения ингибитора между водной и мицеллярной фазами. Построены теоретические модели ингибирования простагландин-H-синтазы с учётом кооперативности, многосубстратности, инактивации и бифункциональности фермента. Проведено углубленное исследование кинетических механизмов взаимодействия различных ингибиторов с PGHS с учетом их влияния на инактивацию фермента в процессе реакции. Показано, что все исследованные ингибиторы являются обратимыми, определены равновесные и кинетические константы. Выявлены ингибиторы, способные взаимодействовать с радикалом Tyr385 в активном центре фермента. С помощью моделирования с использованием молекулярной динамики подтвержден обнаруженный и исследованный нами ранее кооперативный эффект для ингибитора напроксена. Исследован обнаруженный нами парадоксальный эффект повышения предельного выхода продукта циклооксигеназной реакции на фоне уменьшения начальной скорости в присутствии напроксена, ибупрофена, фенопрофена и толметина. Для других исследованных ингибиторов (индометацин, диклофенак, кеторолак, флурбипрофен, кетопрофен) такой эффект не наблюдается. Проанализирован феномен синергичных ингибиторов, усиливающих сродство друг друга к ферменту, найдены пары синергичных ингибиторов для PGHS-1. Продемонстрировано влияние присутствия ингибитора циклооксигеназной реакции на интегральную кинетику катализируемой PGHS-1 пероксидазной реакции (повышение предельного выхода продукта реакции на фоне отсутствия влияния на начальную скорость). Разработана методика поиска потенциальных ингибиторов PGHS методом докинга. Проведён докинг веществ из базы данных ACB Blocks (6150 соединений). 9 соединений, показавших потенциально наибольшее сродство с PGHS, проверены экспериментально с PGHS-1 из везикулярных желез барана. Для 3 из них ингибирующее действие подтверждено. Все они оказались «быстрыми» и обратимыми ингибиторами. Отработанная процедура поиска новых ингибиторов in silico была автоматизирована: определены важные для проведения докинга наиболее подвижные аминокислотные остатки в активном центре фермента, создана и размещена в свободном доступе в интернете программа PDBParser для упрощения подготовки структур к докингу и для анализа результатов докинга. Проведён докинг выборки размером 136 000 веществ из базы ZINC, в результате чего были отобраны 300 новых потенциальных ингибиторов. Также по результатам докинга осуществлена кластеризация выборки из 31 ингибитора на основании типов взаимодействий с активным центром фермента. Показано, что полученная классификация ингибиторов коррелирует с классификацией по кинетическим свойствам (изменение предельного выхода продукта реакции, кооперативность, скорость связывания фермента с ингибитором).
- Добавил в систему: Кривошей Александр Владимирович
Источник финансирования НИР
| грант РФФИ |
Этапы НИР
| # | Сроки | Название |
| 1 | 11 января 2016 г.-31 декабря 2016 г. | Простагландин-H-синтаза: исследование нового механизма ингибирования димерного фермента и поиск новых ингибиторов |
| Результаты этапа: Осуществлено исследование кинетики мембранного фермента PGHS в водно-мицеллярной среде. Учтено распределение субстратов между водной и мицеллярной фазами, получены истинные значения констант Михаэлиса для арахидоновой кислоты и для растворенного кислорода как для мицеллярной, так и водной фаз, оценены значения коэффициента распределения арахидоновой кислоты между гидрофобной фазой и активным центром PGHS и коэффициента распределения арахидоновой кислоты между мицеллярной и водной фазами. Показано, что изменение содержания мицеллярной фазы влияет и на скорость связывания ингибитора с ферментом, и на эффективность ингибирования в равновесных условиях. Проведено углубленное исследование кинетических механизмов взаимодействия ингибиторов (индометацина, ибупрофена, диклофенака, кеторолака) с PGHS с учетом влияния ингибиторов на кинетику инактивации фермента в процессе реакции. Определяли начальную скорость циклооксигеназной реакции, константу скорости инактивации в процессе реакции и предельный выход продукта реакции, степень обратимости действия ингибиторов. Определены равновесные и кинетические константы. Показано, что, замедляя начальную скорость реакции, различные ингибиторы по-разному влияют на константу скорости инактивации и предельный выход продукта реакции. Диклофенак симбатно снижает начальную скорость и предельный выход продукта реакции, кеторолак и индометацин снижают начальную скорость реакции, но почти не изменяют предельный выход продукта реакции, а ибупрофен и напроксен в низкой концентрации снижают начальную скорость реакции, но повышают предельный выход продукта реакции. Построены теоретические модели ферментативного катализа для простагландин-H-синтазы с учётом кооперативности, многосубстратности, инактивации и бифункциональности фермента. Разработан и апробирован метод определения непрерывной зависимости константы скорости инактивации и числа оборотов фермента от концентрации субстрата путем анализа интегральных кинетических кривых накопления продукта ферментативной реакции, позволяющий разделить процессы инактивации фермента и расходования субстрата. Отработана методика поиска потенциальных ингибиторов PGHS методом докинга. Проведено сравнение результатов докинга при использовании программ AutoDock и SOL, и показано, что программа SOL более эффективно отделяет ингибиторы от неингибиторов. Проведён докинг веществ из базы данных ACB Blocks (6150 соединений) с помощью программы SOL. 9 соединений, показавших потенциально наибольшее сродство с PGHS, проверены экспериментально с PGHS-1 из везикулярных желез барана. Для 3 из них ингибирующее действие подтверждено. Все они оказались «быстрыми» и обратимыми ингибиторами. | ||
| 2 | 11 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. | Простагландин-H-синтаза: исследование нового механизма ингибирования димерного фермента и поиск новых ингибиторов |
| Результаты этапа: Проведено подробное исследование кинетических механизмов взаимодействия фермента PGHS с такими ингибиторами, как флурбипрофен, кетопрофен, фенопрофен и толметин. Определены равновесные и кинетические константы. Проанализировано влияние вышеперечисленных ингибиторов, а также таких ингибиторов, как напроксен, ибупрофен, индометацин, диклофенак, кеторолак, и новых ингибиторов, найденных ранее по итогам скрининга базы данных ACB Blocks и проверки in vitro, на инактивацию фермента в процессе циклооксигеназной реакции. Исследован обнаруженный нами парадоксальный эффект повышения предельного выход продукта циклооксигеназной реакции на фоне уменьшения начальной скорости в присутствии напроксена, ибупрофена, нового ингибитора DHT-5027, фенопрофена, толметина. Для других исследованных ингибиторов такой эффект не наблюдается. Продемонстрировано влияние присутствия ингибитора циклооксигеназной реакции на интегральную кинетику катализируемой PGHS-1 пероксидазной реакции (повышение предельного выхода продукта реакции на фоне отсутствия влияния на начальную скорость). В рамках анализа конвергенции кооперативной и гетерогенной моделей взаимодействия фермента с ингибиторами получены в общем виде численные соотношения между кинетическими константами, при соблюдении которых обе эти модели одинаковым образом описывают экспериментальные данные. Разработана и апробирована в случае индометацина и диклофенака методика титрования ингибиторами для определения концентрации центров связывания в препарате PGHS. По результатам докинга осуществлена кластеризация выборки из 31 ингибитора на основании взаимодействий с активным центром фермента. Показано, что данная кластеризация потенциально обладает предсказательной силой, поскольку ее результаты коррелируют со строением исследуемых ингибиторов и с их кинетическими свойствами. Автоматизирована процедура поиска новых ингибиторов in silico. Определены важные для проведения докинга наиболее подвижные аминокислотные остатки в активном центре фермента. Создана и размещена в свободном доступе в интернете программа PDBParser для упрощения подготовки структур к докингу и для анализа результатов докинга. Произведён докинг выборки размером 136 000 веществ из базы ZINC, в результате чего были отобраны 300 новых потенциальных ингибиторов. | ||
| 3 | 11 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. | Простагландин-H-синтаза: ингибирование на фоне инактивации, влияние твина-20, контакты с Tyr385, молекулярная динамика, синергичные ингибиторы |
| Результаты этапа: Построены теоретические модели ингибирования простагландин-H-синтазы с учётом инактивации фермента в случае как 1-стадийного медленного ингибирования, так и 2-стадийного ингибирования с быстрой и медленной стадиями. В общем случае, зависимость продукта реакции от времени представляет собой сумму двух экспонент с различными показателями, однако если пренебречь обратимостью медленной стадии, то сумма экспонент переходит в одну экспоненту, и из интегральной кривой можно определить наблюдаемую константу скорости инактивации. Для ингибитора индометацина подтверждено наличие быстрой обратимой стадии, проявляющейся при инициации реакции ферментом, а также медленной стадии, проявляющейся при инициации реакции арахидоновой кислотой после инкубации с ингибитором. Таким образом, взаимодействие фермента с индометацином описывается двухстадийной схемой ингибирования. При инициации реакции ферментом индометацин проявляет себя как конкурентный ингибитор, а при инициации субстратом после прединкубации фермента с ингибитором и достижения равновесия - как неконкурентный. Проанализировали структуры PGHS с различными ингибиторами и определили, как данные лиганды контактируют с Tyr385. Видно, что большинство рассмотренных ингибиторов содержит группы, которые могут находиться в непосредственной близости от тирозинового радикала. Соответственно, на основе данных веществ можно создать их производные, специфически взаимодействующие с Tyr385 в активном центре PGHS и, возможно, гораздо более эффективно ингибирующие активность фермента, чем существующие аналоги. Для проверки кооперативности PGHS по напроксену проводили молекулярную динамику как без ингибитора, так и с ингибитором в активном центре одной из субъединиц (цепи A). Для анализа результатов выбрали по 100 микросостояний на последних этапах динамики для обеих структур. Подсчитали RMSD по тяжёлым атомам цепи B между каждыми двумя выбранными микросостояниями структуры без ингибитора, а также между каждым микросостоянием структуры без ингибитора и каждым микросостоянием структуры с ингибитором в другой субъединице (цепи A). В первом случае среднее значение RMSD составило 1.2 ангстрем, а во втором – 1.7 ангстрем. Из полученных результатов можно сделать вывод, что присутствие ингибитора в одной из субъединиц (цепи A) существенным образом влияет на конформацию другой субъединицы (цепи B), и наличие кооперативного эффекта при ингибировании PGHS напроксеном получает подтверждение методом молекулярной динамики. Гомодимерная структура фермента PGHS и обнаружение кинетически значимых кооперативных взаимодействий открывает новое направление исследований – поиск пар синергичных ингибиторов этого фермента. В этом случае один ингибитор из такой пары присоединяется к активному центру одного мономера белка, а другой – к активному центру другого мономера. Если связывание ингибитора A с димером EE увеличивает сродство ингибитора B к ферменту (что выражается в меньшем значении константы ингибирования), и, соответственно, аналогичное явление наблюдается в обратном случае, то пару ингибиторов A и B можно назвать синергичными. В литературе эффект синергичного ингибирования PGHS наблюдали при исследовании влияния несубстратных жирных кислот на действие различных ингибиторов. Для изоформы PGHS-1 добавление пальмитиновой кислоты усиливает ингибирование диклофенаком и напроксеном, при этом пальмитиновая кислота сама по себе оказывает незначительный ингибирующий эффект. При инкубации с аспирином или флурбипрофеном добавление различных жирных кислот (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая) усиливает эффект ингибирования, а в отсутствие ингибиторов активность также незначительно понижается при добавлении этих кислот. Таким образом, по имеющимся данным можно составить следующие пары синергичных ингибиторов для PGHS-1: - пальмитиновая кислота – с диклофенаком или напроксеном; - аспирин или флурбипрофен – с пальмитиновой, стеариновой или олеиновой кислотой. | ||
Прикрепленные к НИР результаты
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".