ИСТИНА

Целью работы являются: высокопроизводительный поиск новых антибактериальных веществ и анализ механизма их действия; структурно-функциональный анализ белка hTERP, закодированного в теломеразной РНК человека; Определение молекулярных механизмов регуляции трансляции и взаимодействия антибиотиков с рибосомой для создания перспективных антимикробных соединений; исследование появления редких модификаций в РНК; влияние белков человека Ku, SFPQ и NONO на разные этапы репликации ВИЧ-1; изучение ДНК-метилтрансферазы эукариот Dnmt3a как мишень для онкотерапии; дизайн аптамеров и изучение взаимодействия аптамеров с клетками и тканями глиом мозга; цистеиновые и сериновые пептидазы и псевдоферменты тенебрионид (Tenebrio molitor и Tribolium castaneum): бионформатический анализ и структурно-функциональное изучение; исследование влияния экспрессии нативного и мутантного хантингтина на протеостаз клеток разного типа; поиск новых низкомолекулярных веществ, избирательно токсичных против опухолевых клеток; выявление молекулярных причин кардиопатологий, наблюдаемых у людей с природными мутациями в гене митРРазы

A persistent high throughput screening effort will be continuously conducted with the help of the robotic liquid handling station. Mechanism of action of antibacterial compounds will be classified with the help of pDualrep2 reporter construct. To create promising antimicrobial compounds, it is necessary to determine the molecular mechanisms of regulation of translation and interaction of antibiotics with the ribosome. The results of these studies will lead to the possibility of creating a new generation of antimicrobial compounds capable of acting on resistant strains of bacteria. The search for low-molecular-weight drugs that have not been previously used for therapy is one of the priority areas of drug development. Previously we have found hTERP protein encoded in human telomerase RNA. We have shown that hTERP protein is involved in autophagy regulation and cell survival. Structurally-functional analysis of hTERP protein is necessary for understanding its role in cells. Based on obtained data on new inhibitors of HIV1 replication, on the interaction of HIV integrase and cellular proteins; on the mechanism of inhibition of integration by methylene bisphosphonate derivatives, and on the effect of mutations on the activity of HIV1 subtype A integrase of the FSU-A strain, the influence of human Ku, SFPQ and NONO on different stages of HIV-1 replication will be studied. Previously it was shown that eukaryotic DNA methytransferase Dnmt3a is a key enzyme in DNA hypermethylation, and next stage of research will be study of Dnmt3a as a target for cancer therapy. It was found that aptamers are perspective compounds for diagnostics and therapy of several diseases, thus the design of aptamers, and interactions of aptamers with the cells and tissues of brain glioma will be studied. The most significant serine and cysteine peptidases of the digestive complex of tenebrionides, as well as their inactive homologues, will be identified and characterized. Research will be conducted to clarify the possible functional role of inactive pseudoenzymes. It is planned to develop an enzyme complex (based on recombinant preparations of cysteine and serine peptidases), effective in the cleavage of gliadins and their immunogenic peptides. Studies on the effect of the expression of native and mutant huntingtin on the state of proteostasis in cells of different types will be continued.

С помощью скрининга будут найдены новые молекулы с антибактериальной активностью, определены их мишени и механизм действия, оценена минимальная ингибирующая концентрация, эффективность и токсичность, предложены варианты по рациональному улучшения на основании данных по механизму действия. Синтез новых антимикробных соединений на основе хлорамфеникола, антимикробных пролин-богатых пептидов и гидрофобных катионов, которые могут связываться с бактериальными рибосомами в области пептидилтрансферазного центра и рибосомного туннеля, блокируя при этом синтез бактериальных белков. Соединения будут исследованы на аффинность к бактериальным рибосомам, способность ингибировать трансляцию in vitro и in vivo; для исследования комплексов новых соединений с рибосомами будут применены биохимические, структурные методы, а также метод молекулярной динамики. Планируется провести высокопроизводительный поиск (ВПС) тысяч химических соединений в тест-системе на основе конкурентного роста опухолевых и условно-нормальных клеток. Планируется изучить in vitro активность как как найденных в ходе ВПС веществ, так и новых синтезированных нашими коллегами соединений с предполагаемым противоопухолевым потенциалом. Для наработки белка hTERP будет создан штамм E.coli, пригодный для продукции белка hTERP и выделения в растворимой форме, а также клеточная линия HEK293, пригодная для продукции и выделения белка hTERP в растворимой форме. Планируется определить структуру полученных препаратов белка hTERP методом ЯМР. Будут получены антитела, специфично взаимодействующие с белком hTERP. Будет исследовано влияние белков человека Ku, SFPQ и NONO на разные этапы репликации ВИЧ-1 с целью поиска новых мишеней для создания противовирусных препаратов. Методами молекулярной динамики, пептидного фишинга и сайт-направленного мутагенеза будет исследована структура комплекса взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ее клеточным партнером – белком Ku-70. Будут отобраны и синтезированы соединения, являющиеся по данным скрининга наиболее эффективными ингибиторами и проведены их структурно-функциональные исследования с целью выявления наиболее эффективного ингибитора взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с белком Ku-70. Будет проверена способность выявленных ингибиторов влиять на эффективность репарации повреждений, возникающих при интеграции вирусной ДНК в геном клетки. Будет исследовано влияние белков человека SFPQ и NONO на эффективность обратной транскрипции и интеграции ВИЧ-1. Будут получены результаты, позволяющие понять механизмы влияния белков человека Ku, SFPQ и NONO на разные этапы репликации ВИЧ-1: обратную транскрипцию, интеграцию, пост-интеграционную репарацию и транскрипцию с интегрированного провируса. Планируется найти ингибиторы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с белком KU-70, способные блокировать процесс пост-интеграционной репарации. Планируется определить роль повреждения ДНК терапевтическими препаратами, интеркалирующими в двойную спираль, на функционирование Dnmt3a, осуществить поиск новых ингибиторов Dnmt3a на основе аналогов кофактора, провести структурно-функциональный анализ мутантных форм Dnmt3a. Будут созданы аптамеры для тераностики мультиформной глиобластомы. На основе биоинформатического анализа будут выявлены наиболее активные сериновые и цистеиновые пептидазы пищеварительного комплекса тенебрионид, проведено их выделение, идентификация, получение рекомбинатных препаратов и изучение энзиматических свойств. Будет проведено изучение гидролиза коллагенов, глиадинов и их иммуногенных пептидов. С использованием рекомбинантных препаратов цистеиновых и сериновых пептидаз тенебрионид будет предложен ферментный комплекс, эффективный в отношении расщепления глиадинов и их токсических пептидов. На основе анализа геномных и транскриптомных данных будут проведены сборка и филогенетический анализ последовательностей SPH из семейства S1 химотрипсина и СPH из семейства С1 папаина; выбраны и получены рекомбинантные препараты наиболее высоко экспрессируемых гомологов SPH и СPH, проведен прямой молекулярный фишинг с последующим масс-спектрометрическим анализом для идентификации белков - партнеров и выяснения возможной функциональной роли неактивных псевдоферментов. Будут получены данные о состоянии протеасомы в клетках разного типа при экспрессии нативного и мутантного хантингтина. Будет продолжено исследование влияния мутаций на структуру и функцию митРРазы. Планируется получить митРРазу S. сerevisiae и человека и охарактеризовать их свойства in vitro. Планируется разработать систему для исследования свойств митРРазы in vivo.

Создана и апробирована репортерная система pDualrep2, выявляющая антибактериальную активность и механизм действия соединения; проанализировано ~3*10^5 соединений, налажены методы выделения и установки структуры природных метаболитов из сложных природных смесей. Найдены ингибиторы трансляции амикумацин и тетрациномицин Х и изучены механизмы их действия. Создана модель опухолевого микроокружения на основе смешанной культуры карциномы и нормальных фибробластов легкого. Разработан синтез различных пептидов и пептидомиметиков, методы конъюгации аминокислот, пептидов и других органических соединений с антибиотиками-макролидами, хлорамфениколом, цефалотоксином, и с гидрофобными проникающими катионами. Разработана методика оценки связывания производных антибиотиков и других лигандов, а также молекулярно-динамических исследований их комплексов с РТ бактерий. Показано, что повышенное содержание белка hTERP способствует защите клеток в условиях стресса, но требуются дополнительные исследования. С помощью ингибиторов Dnmt3a реактивированы гены-супрессоры опухолей, «молчащие» в клетках MCF-7 из-за гиперметилирования ДНК. Изучено влияние антибиотиков ряда ауреоловой кислоты на функционирование МТазы мыши Dnmt3a. Получены новые аптамеры - антипролиферативные агенты и ингибиторы ферментов системы гемостаза. Определены наиболее активные проламинрасщепляющие ферменты из ПСП человека и насекомых, получены их рекомбинантные препараты. Изучен гидролиз иммуногенных пептидов глиадинов. В E.coli экспрессирована митРРаза из термотолерантных дрожжей из S. сerevisiae, и H. рolymorpha и ряд ее мутантных вариантов, ферменты охарактеризованы. Исследован молекулярный механизм действия системы MMR. Выделены белки MutL, MutS и β-субъединица ДНК-полимеразы III. Предложены ДНК-реагенты, фиксирующие комплексы белок-НК. Разработана система изучения теломеразы и компонентов теломеразного комплекса, методы оценки эффективности теломеразы, и методы геномных манипуляций для термотолерантных дрожжей.