ИСТИНА

Создание безопасной клеточной системы для изучения роли вирусных белков в процессах репликации генома бетакоронавируса SARS-CoV-2 и синтеза субгеномных РНК, а также определения роли клеточных факторов в этих процессах.

Coronavirus disease COVID-19 is induced by the SARS-CoV-2 novel betacoronavirus, which is the seventh identified coronavirus able to affect humans. Due to the COVID-19 epidemic, the World Health Organization has declared a worldwide public health emergency, and the global risks are estimated as remarkably high. Studies of the pathogenesis of this viral disease, vaccine development, and the search for efficient antiviral drugs are being carried out in numerous research centers worldwide. Nevertheless, our knowledge about the molecular basis of the virus reproduction is still enough limited. In particular, the functions of certain viral proteins are still unknown; the mechanism of synthesis of the subgenomic RNAs from which structural proteins of the virus are translated remains unclear; it is unknown whether cellular proteins are involved in the viral replication. To a large extent, it is due to the lack of simple and safe cellular systems, which allow manipulating the viral genome and performing high throughput screening. In the present project we intend to design such a cell system to study the role of viral proteins in the replication of the viral genome and subgenomic RNA synthesis, as well as the impact of cellular factors on these processes. We are planning to obtain a stable cell line expressing pseudoviral genome RNA containing the necessary regulatory elements of the coronavirus and the genes of two reporter proteins, one of which will be expressed on a low level using the machinery of the cell. The synthesis of the other reporter protein will require the transcription of the genomic RNA by the viral polymerase complex. The upregulation of the first reporter protein due to replication and the expression of the second protein resulting from transcription will be possible only if the necessary viral proteins from plasmid vectors are overexpressed. Performing consecutive expression of various viral proteins will allow us to identify those involved in the virus genome replication and subgenomic RNA synthesis. The knockout of a set of cellular proteins by screening the guide RNA library will allow identification of additional cellular factors influencing the efficiency of viral transcription and replication. Later on, the designed system may be used for a quick search for compounds inhibiting the transcription as well as the replication of the viral genome in a high throughput plate format. This will allow finding potential anti-coronaviral drugs as well as clearly identifying the stage of the virus life cycle influenced by them.

1. Будет получена и охарактеризована работоспособность репортерной конструкции, кодирующей гены двух люцифераз, фланкированные регуляторными последовательностями из генома SARS-CoV-2. Также будет получен вариант репортера с генами флуоресцентных белков. 2. Будут получены клеточные линия A549 и/или HEK293T, стабильно экспрессирующие созданные репортерные конструкции. 3. Будет определен минимальный набор вирусных белков, поддерживающих процессы вирусной прерывистой транскрипции и репликации. 4. Будет получена модифицированная клеточная линия, экспрессирующая репортер с генами флуоресцентных белков, в геном которой будут введены гены, кодирующие выявленные нами вирусные белки, необходимые и достаточные для вирусной прерывистой транскрипции и репликации. 5. Будут определены клеточные факторы - потенциальные участники процесса прерывистой транскрипции SARS-CoV-2.

В коллективе накоплен значительный опыт в проведении генно-инженерных манипуляций и получении различных векторов про- и эукариотической экспрессии, имеется большой опыт работы с клеточными культурами. Имеются конструкции для сборки репликативно-некомпетентных векторов на основе ВИЧ-1, несущих в своем составе гены репортерных белков. Есть необходимые для работы клеточные линии. Среди участников проекта есть специалисты в области молекулярной биологии, биоинженерии, биоинформатики, молекулярной вирусологии. В лаборатории хорошо освоены методики изменения уровня клеточных белков за счет их суперэкспрессии с плазмидных векторов, а также нок-дауна (нок-аута)