Дальний транспорт у харовых водорослейНИР

Long-distant transport in characean algae

Соисполнители НИР

Otto-von-Guericke-Universität Magdeburg Соисполнитель

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 14 января 2020 г.-1 февраля 2021 г. Дальний транспорт у харовых водорослей
Результаты этапа: Целью проекта является изучение роли внутриклеточного транспорта в дальней регуляции и сигнализации в клетках растений. На первом этапе проекта была поставлена задача изучить пропускную способность плазмодесм для передачи фотометаболитов между соседними клетками харовых водорослей при водном и солевом стрессе, а также сопоставить результаты у солечувствительных и солеустойчивых видов. Новый подход, основанный на измерениях модулированной флуоресценции хлоропластов на удалении от места приложения локального фотостимула, был успешно применен для изучения роли дальнего транспорта между тандемными интернодальными клетками харовых водорослей. Было оценено время прохождения метаболита из клетки в клетку у пресноводных водорослей Chara corallina (около 11 с), а также коэффициент диффузии метаболитов внутри плазмодесм ( 3.6 10–8 см2/с). Показано, что трансклеточный перенос метаболитов проявляет высокую чувствительность к изменению осмотического давления среды. Увеличение осмолярности внешнего раствора вызывало полное подавление трансклеточного переноса, но не оказывало влияния на внутриклеточный транспорт. Было изучено влияние солей (NaCl и KCl) на дистанционную и трансклеточную передачу метаболического сигнала. Выявлены различия в эффектах повышенного содержания ионов Na+ и K+ на внутриклеточное сообщение в клетках пресноводных видов и межклеточные взаимодействия. Проведены измерения дальней и трансклеточной передачи сигналов в клетках солеустойчивых харовых водорослей Lamprothamnium sp. и у пресноводного вида с повышенной солеустойчивостью Nitellopsis obtusa. Сопоставление результатов, полученных на солечувствительных и солеустойчивых видах водорослей, свидетельствует о сходстве в функционировании плазмодесм у обследованных видов.
2 1 июня 2021 г.-10 февраля 2022 г. Дальний транспорт у харовых водорослей
Результаты этапа: Транспорт ассимилятов и сигнальных молекул тесно связан с фотосинтезом и может лимитировать фотосинтетическую продукцию. Дальний транспорт и дистанционные взаимодействия при фотосинтезе можно изучать по изменениям флуоресценции хлорофилла (Фл Хл) в ответ на локальное освещение участков растительного объекта, расположенных вдали от микрообласти регистрации Фл. Второй подход состоит в сравнении индукционных изменений Фл Хл при разной площади освещения объекта с использованием узкопольного и широкопольного освещения. Расхождения индукционных кривых Фл в этих вариантах обусловлены обменом метаболитов между областью измерения флуоресценции (ОИФ) и прилегающими частями исследуемого объекта. На этапе 2021 г. эти подходы были применены для изучения дальних внутриклеточных и межклеточных взаимодействий в междоузлиях водорослей Chara australis и Nitelloposis obtusa. За изменениями флуоресценции (Фл) хлоропластов следили с помощью метода импульсно-модулированной микрофлуорометрии хлорофилла (Хл). Впервые показано, что фотометаболиты, экспортируемые из хлоропластов в области яркого локального освещения, распространяются с потоком цитоплазмы на расстояния до 10 мм, что представляет максимальную длину пробега фотометаболитов, оцененную в настоящее время методом микрофлуориметрии. Распространение фотоассимилятов вызывает сравнительно быстрое переходное возрастание Фл Хл в ОИФ спустя долгое время (~120 с) после завершения светового стимула. Скорость передачи сигнала составила ~60 мкм/с, что на 25–30% ниже скорости смещения частиц в потоке цитоплазмы. Поскольку водоросли N. obtusa устойчивее к засолению, чем C. australis, можно предполагать, что микрофлуидная сигнализация действует как у чувствительных, так и у устойчивых к действию солей харофитов. Было исследовано влияние температуры на передачу сигналов о локальном освещении в области 8–35°С. Результаты говорят о том, что при повышенных температурах происходит усиление продукции и экспорта фотометаболитов из хлоропластов в движущуюся цитоплазму. Сделан вывод, что их перенос вдоль клетки определяется главным образом скоростью течения цитоплазмы, которая зависит от температуры. Подход с локальным освещением был использован для оценки селективной проводимости плазмодесм, когда измерения флуоресценции и фотостимуляцию проводили в разных граничащих друг с другом клетках. Для изучения работы плазмодесм C. australis провели сравнение межклеточного переноса метаболитов, образующихся в области локального освещения, в условиях слабой и повышенной интенсивности фоновой подсветки. Показано, что воздействие интенсивного локального светового импульса при низкой и повышенной интенсивностях фонового освещения индуцирует появление в потоке цитоплазмы метаболитов двух типов, вызывающих противоположные изменения Фл Хл. Установлено, что метаболиты-восстановители, образующиеся в условиях слабой фоновой подсветки, свободно проникают через межклеточные барьеры, а продукты-тушители Фл Хл, образующиеся на ярком свету, не могут их преодолеть. По-видимому, плазмодесмы выступают в качестве селективного барьера и способны ограничивать прохождение потенциально деструктивных агентов (предположительно Н2О2), генерируемых на свету повышенной интенсивности. Показано, что генерация потенциала действия (ПД) в междоузлиях Chara подавляет межклеточный перенос метаболитов гораздо сильнее, чем их внутриклеточный транспорт. Результаты указывают на существование специфических механизмов регуляции проводимости плазмодесм за счет повышения [Са2+]цит во время генерации ПД. На этапе 2021 г установлено, что генерация ПД не оказывает влияния на Фл Хл в преобладающих по площади участках, лишенных кристаллов кальция, но вызывает переходное возрастание Фл в областях на границе с зонами отложения CaCO3. Выбирая для измерений некальцифицированные участки клетки, в которых Фл Хл нечувствительна к возбуждению плазмалеммы, изучали влияние генерации ПД на проводимость плазмодесм. Показано, что генерация ПД в междоузлиях Chara подавляет межклеточный перенос метаболитов гораздо сильнее, чем их внутриклеточный транспорт. Результаты указывают на существование специфических механизмов регуляции проводимости плазмодесм, которые опосредованы повышением концентрации Са2+ в цитоплазме во время генерации ПД. Новый и малоизвестный аспект состоит в изучении участия дальних взаимодействий в индукционных переходах при фотосинтезе. Индукция флуоресценции хлорофилла происходит при освещении предварительно адаптированного к темноте объекта и чувствительна к изменениям, которые происходят в фотосинтетической аппарате при адаптации к различным условиям окружающей среды. Показано, что индукционные изменения Фл Хл в клетках C. australis включают задержанные S-M-T переходы большой амплитуды (с максимумом при t ~ 220 c). Время достижения пика М возрастало при понижении интенсивности света. Для выяснения роли светозависимых транспортеров оболочки хлоропластов в индукционных изменениях Фл Хл использовали переходы от зонального (локального) к общему освещению препарата. В отличие от общего освещения клетки, локальное освещение небольшого (∅ 2 мм) участка клетки с центром в области измерения Фл не вызывало переходных изменений S-M-T. Показано, что при таком переходе стадия S-M-T в индукционной кривой Фл определяется как внутренними процессами в хлоропластах ОИФ, так и обменом метаболитами между ОИФ и участками, лежащими за пределами этой области. Амплитуда и положение стадии S-M-T зависели от состояния активируемых светом ферментов, которые участвуют в транспорте фотометаболитов через мембраны оболочки хлоропластов. Установлено, что экспорт фотометаболитов из хлоропластов после перехода темнота-свет начинается значительно (на 50–60 с) раньше, чем поступление метаболитов из цитоплазмы в строму. Сравнение температурных зависимостей для положения пика М на индукционных кривых Фл, измеренных в присутствии и в отсутствие CD, говорит о том, что течение цитоплазмы замедляет достижение пика М. Результаты говорят о том, что медленные стадии индукции Фл (S-M-T), аналогично изменениям F’ в ответ на локальное освещение удаленного участка, отражают динамику содержания восстановительных эквивалентов в подвижной цитоплазме и в строме анализируемых хлоропластов. На данном этапе было показано, что при микроповреждении клеточной стенки стеклянной микроиглой происходит образование активных форм кислорода как внутри, так и снаружи клетки. Данные были получены с помощью флуоресцентных и электрохимических методов, соответственно. Показано, что образование АФК снаружи клетки при микроповреждении происходит в присутствии буфера во внеклеточной среде, что исключает изменения концентрации протонов в апопласте в качестве причины накопления АФК. Ингибиторы НАДФН-оксидазы (дифенилениодониум и фениларсиноксид) подавляли образование АФК в месте микроукола. Полученные данные свидетельствуют в пользу участия НАДФН-оксидазы в наблюдаемых изменениях АФК. Полученные в ходе данного этапа результаты позволяют лучше понять механизмы дальних внутриклеточных и межклеточных взаимодействий у растений.
3 8 мая 2022 г.-17 января 2023 г. Дальний транспорт у харовых водорослей
Результаты этапа: В работе подробно исследованы медленные стадии индукционных процессов фотосинтеза у харовых водорослей, которые развиваются в ответ на освещение после предварительной адаптации в темноте. Показано, что медленные стадии индукции фотосинтеза определяются как внутренними процессами в хлоропластах области измерения, так и обменом метаболитами между подвижной цитоплазмой и неподвижными хлоропластами, расположенными в участках за пределами области измерения. В растительных клетках и тканях под действием света происходит образование и накопление продуктов фотосинтеза (НАДФН, триозофосфатов, сахаров). Образовавшиеся в хлоропластах вещества переносятся в цитоплазму с помощью специальных переносчиков на оболочке хлоропластов. Их работа регулируется светом. Активный перенос веществ в потоке цитоплазмы вдоль неподвижного слоя хлоропластов способствует более равномерному распределению образовавшихся на свету веществ. Кроме того, с потоком могут транспортироваться сигнальные молекулы, которые запускают процессы в удаленных частях клетки или даже в соседних клетках. Свет активирует транспортеры оболочки хлоропластов, поэтому можно управлять переносом веществ из хлоропластов в цитоплазму с помощью освещения разной площади объекта: узкого участка или всей клетки. В затененных областях переносчики инактивируются и сообщение между хлоропластами и цитоплазмой прерывается.Перенос веществ может происходить не только в одной клетке, но и между соседними клетками, которые сообщаются между собой через клетки узлового комплекса, содержащие трансклеточные поры – плазмодесмы. Эти структуры обеспечивают транспорт молекул из одной клетки в другую. Показано, что активность межклеточного сообщения в клетках харовых водорослей регулируется как внутриклеточными факторами, так и внешними воздействиями. Для выявления эффекта потенциала действия (ПД) на проводимость плазмодесм и дальний внутриклеточный транспорт природных метаболитов необходимо было выяснить, какое влияние оказывает генерация ПД на Фл Хл. Подобные эксперименты на клетках харовых водорослей при низкой фоновой освещенности ранее не проводились. Установлено, что генерация ПД не оказывает влияния на Фл Хл в преобладающих по площади участках, лишенных кристаллов кальция, но вызывает переходное возрастание Фл в областях на границе с зонами расположения кристаллов (преимущественно CaCO3). Изменения Фл Хл на границе с зоной кальцификации, вызванные генерацией ПД, наблюдали только на свету, что указывает на их зависимость от фотосинтетического транспорта электронов. Выбирая для измерений некальцифицированные участки клетки, в которых Фл Хл нечувствительна к возбуждению плазмалеммы, изучали влияние генерации ПД на проводимость плазмодесм. Показано, что генерация ПД в междоузлиях Chara подавляет межклеточный перенос метаболитов гораздо сильнее, чем их внутриклеточный транспорт. Результаты указывают на существование специфических механизмов регуляции проводимости плазмодесм, которые опосредованы повышением концентрации Са2+ в цитоплазме во время генерации ПД. Роль адвекции и диффузии в межклеточном транспорте через комплекс узловых клеток была изучена с помощью флуоресцентного красителя (флуоресцеин диацетат, ФДА) в качестве индикатора вещества, транспортируемого с потоком цитоплазмы. Для этого проводили визуализацию кинетики проникновения флуорофора через плазмодесмы узлового комплекса тандемных клеток и его дальнейшее распределение по смежной клетке. С помощью генерации потенциала действия вызывали изменения в скорости течения цитоплазмы, что позволило разделить межклеточное проникновение с помощью диффузии от вклада адвекции. Результаты показывают, что плазмодесмальный транспорт флуоресцентного зонда через центральные и периферические клетки узлового комплекса по-разному регулируется физиологическим сигналом - потенциалом действия. Прохождение зонда через центральные клетки узлового комплекса временно прекращается после возникновения потенциала действия в межузловой клетке, в то время как прохождение красителя через периферические клетки узла сохраняется. Из экспериментальных данных установлено, что коэффициент диффузии флуоресцеина в цитоплазме более чем на порядок меньше, чем при диффузии в растворе и составил D = 28 мкм2/с, что может объясняться явлением нехватки свободного внутриклеточного пространства (macromolecular crowding). Для описания кинетики переноса через межклеточный барьер была разработана модель диффузии-адвекции, которая позволила оценить коэффициент проницаемости плазмодесм клеточной стенки на границе узел-междоузлие, который составил 3.8 10-9 см2/с. Сравнение с данными, полученными для фотометаболитов при измерениях Фл Хл, позволяет сделать вывод, что перенос флуоресцеина через плазмодесмы происходит медленнее, чем перенос природных сигнальных молекул. Возможной причиной могла быть разница в размерах переносимых молекул и селективность плазмодесм. Таким образом, разработанный и примененный подход измерения Фл Хл для неинвазивной оценки переноса фотометаболитов, образующихся в ответ на локальное освещение удаленного участка клетки, является более точным и обладает явным преимуществом по сравнению с использованием флуоресцентных маркеров. Таким образом, в ходе реализации проекта показано, что активность межклеточного сообщения в клетках харовых водорослей регулируется как внутриклеточными факторами, так и внешними воздействиями. Проницаемость плазмодесм меняется при изменениях тургорного давления, в присутствии повышенных концентраций солей (NaCl и KCl), а также при электрическом возбуждении. Выявлена неоднородность в проводимости клеток узлового комплекса после генерации потенциал действия(ПД): центральные плоские крупные клетки перестают пропускать вещества, но сохраняется перенос через боковые мелкие клетки, окаймляющие центральный участок узлового комплекса. Полученные в ходе выполнения проекта результаты говорят в пользу того, что комплекс узловых клеток вносит важный вклад в межклеточный транспорт за счет регуляции пропускной способности пор в клеточной стенке. Плазмодесмы являются единственным путем межклеточного транспорта вирусной инфекции в растении. Транспортные белки вирусов обеспечивают достаточную пропускную способность этих каналов и транслокацию вирусного генома по их цитоплазматическому рукаву. Тонкая регуляция проводимости плазмодесм, в том числе с помощью генерации потенциала действия, может способствовать защите растительных клеток от вирусных инфекций. Было изучено влияние потенциала действия на индукционные процессы фотосинтеза. Показано, что возбуждение клетки приводит к значительному снижению максимального сдвига Фл Хл при индукции. По всей вероятности, это может быть связано с многократным увеличением [Са2+] в цитоплазме и его входом в строму хлоропластов, где он может стимулировать активацию ферментов Кальвина. Более активное и ранее потребление НАДФН в стадиях синтеза триозофосфатов может приводить к уменьшению амплитуды сдвигов Фл Хл при переходе темнота – свет. Выявлены резкие отличия в амплитуде изменений F’ в индукционный период фотосинтеза при локальном освещении анализируемого участка и общем освещении всего междоузлия светом равной интенсивности и одинакового спектрального состава. При общем освещении амплитуда изменений была намного больше, чем при освещении узким лучом. Это говорит о том, что медленное нарастание F’ в индукционный период в клетках харовых водорослей определяется не только фотосинтетической активностью исследуемого участка, но и взаимодействиями между анализируемой областью и соседними частями клетки. Эти взаимодействия включают модификацию состава и перемещение цитоплазмы, что оказывает влияние на редокс состояние стромы хлоропластов в анализируемом участке клетки. Накопление фотоассимилятов (восстановительных эквивалентов) в хлоропластах при индукционных явлениях фотосинтеза и их выход в цитоплазму могут сказываться на работе транспортных систем плазмалеммы, вызывая потоки ионов и сдвиги трансмембранного напряжения. Для выявления транспортной активности плазмалеммы, коррелирующей с переходным накоплением восстановителей в цитоплазме, были проведены измерения мембранного потенциала при освещении всей клетки после предварительной темновой адаптации. При включении света у темноадаптированной клетки начиналась гиперполяризация, которая через некоторое время сменялась фазой деполяризации. Фаза смещения потенциала к более положительным значениям совпадала с началом роста Фл Хл. Эти данные позволяют заключить, что накопление и выход сигнальных молекул из освещенных хлоропластов оказывает влияние и на работу транспортных систем плазмалеммы. Совместно с группой университета OVGU был применен метод внутриклеточной инъекции для выяснения регуляторной роли восстановительных эквивалентов в качестве переносимого метаболита при передаче сигналов с потоком цитоплазмы. Для измерения Фл Хл был разработан и применен адаптированный подход с использованием конфокального микроскопа. Показано, что данный подход позволяет зарегистрировать кинетики индукции флуоресценции, сходные по основным параметрам с кинетиками, полученными с помощью микрофлуориметрического метода. Выявлено, прямое влияние восстановителя на фотосинтетическую активность хлоропластов в нативной клетке. Показано, что инъекция НАДН вызывает возрастание уровня фактической Фл Хл, измеренного с помощью конфокального микроскопа. Инъекция воды и КCl не вызывали возрастания Фл Хл. Важно отметить, что эти изменения Фл Хл при инъекции НАДН проявлялись только спустя некоторое время после начала освещения темноадаптированных клеток и исчезали спустя несколько минут инкубации в темноте. Данные свидетельствуют о том, что импорт восстановительных эквивалентов из цитоплазмы требует световой активации переносчиков оболочки хлоропластов, что согласуется с литературными сведениями о работе таких систем и результатами наших экспериментов с общим и зональным освещением. Мы предполагаем, что при повышении НАДН в цитоплазме происходит сдвиг баланса восстановительных эквивалентов и малата, что ограничивает их выведение из стромы хлоропластов за счет работы «малатного клапана» и переносчика триозофосфатов. Оба переносчика активируются светом, но в течение нескольких минут в темноте перестают работать. Полученные данные свидетельствует в пользу нашей гипотезы о накоплении и переносе восстановительных эквивалентов в цитоплазму при дальних внутри и межклеточных взаимодействиях.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".