ИСТИНА

Создание активной платформы спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) для предсказания кардиальных рисков с помощью разработки новых высокочувствительных и селективных методов молекулярной диагностики тканеспецифических форм белков в плазме крови человека на базе спектроскопии ГКР.

This project is intended to explore the possibilities of identification of tissue-specific forms of angiotensin-converting enzyme (ACE) using SERS spectroscopy. ACE is a widespread glycoprotein in mammals, a zinc-dependent peptidase that metabolizes various biologically active peptides (angiotensin 1, bradykinin, AcSDKP, etc.) playing a key role in the regulation of blood pressure and in many cardiovascular pathologies. The level of ACE in the blood of healthy individuals is maintained at a constant level and is determined by its intake mainly from the lung capillaries. An increase of ACE level in the blood indicates the development of a number of diseases, for example, sarcoidosis and Gaucher disease, due to ACE entry into the blood from sarcoid granulomas and Gaucher cells. It is important that ACE from different types of cells, while its amino acid sequence is the same, differs in the structure of glycan moiety both in the type of oligosaccharide chains and the degree of sialylation. This fact made it possible to determine ACE originated from sarcoid granulomas and Gaucher cells in the blood by binding of monoclonal antibodies to ACE that recognizes changes in the topography of the enzyme surface. This approach, however, is unable to provide the detection of "extraneous" ACE in the blood in case of its intake from a source, different from the lung capillaries, in small amounts. Of particular interest is the fact that small additional amounts of ACE can enter the blood from the heart tissues in case of cardiovascular pathology, in particular, atrial fibrillation. Since normally the proportion of ACE entering the blood from the heart tissues does not exceed 1%, its increase even several times does not allow pathology diagnostics, based on the results of determining ACE activity by conventional methods, as well as by analyzing the binding of monoclonal antibodies to this form of the enzyme against the background ACE level in the blood. Therefore, the urgent task is to find new ways of identifying ACE that enters the bloodstream, not from the lung capillaries, but from other tissues / organs to predict the development of pathologies, in particular, cardiac risks, such as the development of heart attacks, cardiac deaths, severe heart failure (ejection fraction less than 35-40%), cardiac arrhythmias - atrial fibrillation and ventricular arrhythmias of high gradations, ventricular tachycardia; implantation of a cardioverter / defibrillator and / or resynchronization device. This method of identification can be precisely SERS since it satisfies the set requirements to analyze the content of ACE in the blood. The formulated task has both undoubted fundamental importance and practical significance. The implementation of the SERS platform will be the result of the synthesis of several modern relevant scientific physicochemical and mathematical methods and high-tech products of chemical synthesis and vacuum spraying technologies. Its implementation will consist in the simultaneous use of new SERS-active substrates, which make it possible to detect arrays of spectra of tissue-specific forms of ACE at different excitation wavelengths using an analytical apparatus based on multi-parameter statistics methods that will allow us to separate the spectra of tissue-specific forms of ACE. As a result of the work, the SERS active platform will be created to assess cardiac risks based on information on the ACE content in human plasma, since it is assumed that its plasma level is determined by the degree of cardiac risk and increases with cardiac pathologies. The SERS spectra of ACE produced by epithelial cells (ACE from seminal fluid), endothelial cells (ACE from the lungs), as well as endothelial cells and cardiomyocytes (ACE from the heart) will be measured and the optimal parameters of spectroscopic analysis will be determined to obtain the spectra of the listed analytes. The obtained spectra arrays will be analyzed using methods of multi-parameter statistics to determine the contributions of the structural specificity of ACE forms and concentration contributions of ACE to the final spectra. Experiments will be conducted to determine tissue-specific ACE in plasma in normal and pathological conditions based on a research selection of at least 20 plasma samples from patients with cardiovascular diseases. This study will expand the scope of the SERS method and make it possible to assess cardiac risks. The results obtained will have undoubted novelty, scientific and applied value, since today there are no methods for reliable and accurate determination of ACE entering the blood from the heart in case of cardiovascular diseases.

В результате выполнения работы будет создана ГКР активная платформа для анализа тканеспецифичных форм АПФ, позволяющая оценивать кардиальные риски. В результате выполнения работы будут проведены эксперименты по измерению спектров ГКР АПФ, продуцируемых эпителиальными клетками (АПФ из семенной жидкости), эндотелиальными клетками (АПФ из легких), а также совместно эндотелиальными клетками и кардиомиоцитами (АПФ из сердца) и определены оптимальные параметры спектроскопического анализа для получения спектров перечисленных аналитов. Полученные массивы спектров будут проанализированы с помощью методов многопараметрической статистики для определения вкладов структурной специфики АПФ и определения концентрационных вкладов АПФ в итоговые спектры. Будут проведены эксперименты по определению тканеспецифичных АПФ в плазме крови в норме и при патологии на основе исследовательской выборки из не менее 20 образцов плазмы крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями с использованием новой ГКР платформы, объединяющей методы детектирования и анализа для обнаружения кардиальных рисков у реальных пациентов, что расширит области применения ГКР метода и сделает возможным оценивать кардиальные риски.

Показана возможность успешной экспериментальной реализации идентификации ряда животных и растительных вирусов с использованием планарных подложек на основе серебра со сложной морфологией и методов многопараметрической статистики, позволяющих распознавать ГКР спектры вирусов, характеризующихся большой схожестью. Также показана возможность определения гликированного альбумина на высоком фоне нативного альбумина, т.е. существует возможность разделения различных форм белка на основе тонких различий в характере и степени их гликозилирования. Экспериментальные наработки, сделанные в данных работах, позволяют прогнозировать их успешное применение для экспериментов, направленных на детектирование тканеспецифичных АПФ в плазме крови, сложных биологических объектов с минимальными различиями в структуре и гликановой составляющей. Тканеспецифичность АПФ в значительной степени выражается именно в различном гликозилировании фермента, продуцированного разными типами клеток. Продуцируемый в различных организмах АПФ может отличаться по количеству реально гликозилированных сайтов и по типу структур олигосахаридных цепей. Количественная оценка общей экспрессии АПФ и в сердце, в частности, может иметь диагностическое значение. Наиболее клинически важным и малоинвазивным методом представляется возможность определять АПФ, поступающий из сердца, непосредственно в крови на фоне общего АПФ крови. Посколько у здорового донора доля АПФ, поступающего в кровь из тканей сердца, составляет не более одного процента, а уровень АПФ в крови может при переходе от одного донора к другому различаться в несколько раз, повышение экспрессии фермента в тканях сердца не может оказать влияния на определяемую активность АПФ в крови пациента. Поэтому необходим принципиально новый метод, который может позволить детектировать тканеспецифичный АПФ из тканей сердца на фоне всего АПФ в составе крови и других белков, входящих в ее состав.

Получены спектры гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) нативного и денатурированного ангиотензин-превращающего фермента человека продуцируемых эпителиальными клетками и проведена полная расшифровка полос колебаний. Показано, что термоденатурация АПФ приводит к заметному увеличению интенсивности ГКР спектра и смещению полос колебаний. Произведена полная расшифровка с соотнесением полос для ГКР спектра нативного АПФ и выяснен сайт взаимодействия молекулы АПФ с поверхностью серебряной подложки. На основе спектров ГКР была охарактеризована область на молекуле АПФ, контактирующая с подложкой, и продемонстрирована модель двудоменного АПФ, адсорбированного на серебряной матрице. Впервые были продемонстрированы хорошо воспроизводимые ГКР-спектры нативного и денатурированного человеческого АПФ с полной расшифровкой. Показано, что денатурация АПФ приводит к увеличению интенсивности ГКР спектров и смещению полос колебания. На основе ГКР-спектров охарактеризована область контакта глобулы АПФ с поверхностью серебра и предложена модель двудоменного АПФ. Возможность регистрации колебательных спектров АПФ методом ГКР является основой дальнейшего метода диагностики. Анализ спектров АПФ может быть полезен для оценки содержания ферментов из различных источников, в частности, для обнаружения тканеспецифичных АПФ.