![]() |
ИСТИНА |
Войти в систему Регистрация |
ИСТИНА ИНХС РАН |
||
Анализ строения цитоскелета клеток губок, а также его динамики и роли в ходе эпителиальных и мезенхимных морфогенезов. Особое внимание будет уделено изучению взаимодействия систем актиновых филаментов и микротрубочек в процессе движения клеток, в частности, предполагается описать взаимодействие цитоскелетных систем через каскады малых ГТФаз из семейства Rho.
Morphogenetic processes in Metazoa occur due to changes in the shape and coordinated movement of cells, which, in turn, are determined by their cytoskeleton. The internal skeleton of a cell, built of actin microfilaments, tubulin microtubules and intermediate filaments of various proteins, thus determines the shape and polarity of the supracellular structures - primordia, organs, tissues. Dynamic changes in the cytoskeleton are crucial for many processes in development and regeneration; it is not surprising that epithelial-mesenchymal transitions occurring both in normal ontogenesis and during cell malignancy are accompanied by cytoskeletal rearrangements. The dynamics of actin and tubulin cytoskeletal elements has been described mainly in cell cultures and in vertebrates; however, there are practically no data on the evolutionary conservation of these systems; our knowledge about regulation of cytoskeleton dynamics are sparse. Moreover, it is the regulation of the cytoskeleton, which determines the shape and behavior of the cell, and, as a consequence, morphogenesis, that plays a decisive role in the morphogenetic processes. Our proposed study is aimed to describe the cytoskeleton in evolutionarily distant species of marine sponges Leucosolenia variabilis, Halisarca dujardini, and Lycopodina hypogea, during normal development and regeneration. It is supposed to describe the dynamics of actin and tubulin cytoskeleton subsystems during reparative regeneration and metamorphosis, as well as evaluate its role using pharmacological inhibitors. We have chosen one of the regulatory pathways based on the small GTPase RhoA, the participation of which in the interaction of the actin cytoskeleton with tubulin ones was shown earlier. The participation of the RhoA cascade is proposed to be revealed by changes in the cytoskeleton after treatment of cells with RhoA modulators. Thus, using modern methods of intracellular structures analysis, novel data will be obtained on the structure and role of the cytoskeleton during ontogenesis of evolutionarily ancient animals - sponges. Data on the regulation of the dynamics of the cytoskeleton in sponges are important not only for understanding fundamental biological processes, but are also important for the search for new methods for modulating the cytoskeleton (for example, inhibitors of epithelio-mesenchymal transitions in the treatment of cancer). The results obtained will correspond to the world level of modern research in the field of developmental and cell biology. Another important consequence of this joint project is the strengthening of bilateral scientific ties and scientific cooperation between the research teams of Lomonosov Moscow State University and St. Petersburg State University in Russia and specialists from the Aix-Marseille and Montpellier universities in France in the field of developmental biology.
В рамках предлагаемого проекта с использованием современных методов будут получены оригинальные фундаментальные данные о строении и динамике цитоскелета в клетках губок, одной из древнейших групп многоклеточных животных. Будут впервые получены данные о строении цитоскелета в основных типах клеток интактных тканей трех видов губок на нескольких стадиях онтогенеза и при протекании восстановительных морфогенезов. Кроме того, будут впервые детально описаны перестройки цитоскелета в ходе ряда эмбриональных, постэмбриональных и восстановительных морфогенезов, а также исследована роль цитоскелета в этих процессах методами ингибиторного анализа. При этом особое внимание будет уделено вопросам взаимодействия и взаимной регуляции систем актиновых филаментов и микротрубочек через малые ГТФазы. Данные по структуре Rho-каскада и уровню эволюционного консерватизма его элементов позволят подтвердить наличие функционального Rho-каскада у исследуемых видов, а также предположить его связь с цитоскелет-ассоциированными эффекторами каскада, т.е. точки взаимодействия между внутриклеточным сигнальным путем и поведением клетки. Совокупность полученных данных позволит впервые перейти от качественного описания отдельных систем цитоскелета в некоторых типах клеток губок к систематическому комплексному описанию динамики и регуляции цитоскелета у низших многоклеточных животных, а также выявить его роль и участие в морфогенетических явлениях. Использование в качестве модельных объектов губок из классов Demospongiae и Calcarea, значительно различающихся по своему филогенетическому положению, анатомическому строению и особенностям морфогенезов, что позволит провести сравнительный анализ полученных данных как внутри губок, так и с Eumetazoa. Исследование поведения микротрубочек, их взаимосвязи с активностью RhoA и перестройками актинового цитоскелета в процессах распластывания и движения клеток у губок позволит получить более полное представление о взаимодействии компонентов цитоскелета и роли Rho-каскада в организации клеточной подвижности. Полученные результаты позволят определить эволюционную консервативность взаимодействий и взаиморегуляций систем микротрубочек и актиновых филаментов, оценить вклад этих явлений в морфогенетические процессы у базальных групп многоклеточных животных, а также расширить представления об активности цитоскелета в ходе морфогенетических процессов.
Участники коллектива имеют опыт работы с губками, как с интактными взрослыми животными, так и с процессами их нормального развития и регенерации; владеют широким спектром методик фиксации и последующей обработки материала для гистологических, ультраструктурных, иммуногистохимических исследований; имеют опыт работы на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе; владеют полным спектром методов молекулярной и клеточной биологии (ПЦР, ПЦР в реальном времени, трансфекция, трансдукция, иммуноблоттинг). В группе отработаны методики получения и анализа изображений для различных видов световой и конфокальной микроскопии, а также анализа структур цитоскелета (прижизненная съемка, модели экспериментальной раны, свободного блуждания). Борисенко И.Е. владеет молекулярно-биологическими методами изучения экспрессии генов, такими как анализ транскриптомных данных in silico, ПЦР, молекулярное клонирование, гибридизация РНК in situ, а также методами изучения активности сигнальных путей (иммуноцитохимия, вестерн-блоттинг, иммунопреципитация, масс-спектрометрия, ингибиторный анализ, конструирование репортерных векторов и их доставка в клетки). К настоящему моменту коллективом отработаны методы получения и работы с эмбриональным материалом H. dujardinii, методы индукции метаморфоза и осаждения личинок, проведения микрохирургических операций по репаративной регенерации тела губки. Коллективом описаны гистологическое и цитологическое строение интактных тканей, а также основные стадии и динамика процесса регенерации стенки тела у L. variabilis. Основные клеточные преобразования в ходе регенерации стенки тела исследованы на гистологическом и ультраструктурном уровне.
МГУ | Координатор |
грант РФФИ |
# | Сроки | Название |
1 | 1 января 2021 г.-15 января 2022 г. | Динамика, роль и Rho-опосредованная регуляция цитоскелета в развитии и регенерации у губок |
Результаты этапа: 1) Поиск и анализ in silico ортологов генов, вовлеченных в регуляцию цитоскелета через каскады малых ГТФаз из семейства Rho в геномных и транскриптомных базах данных L. variabilis и H. dujardinii Белки цитоскелета искали в транслированном in silico транскриптоме Leucosolenia variabilis и Halisarca dujardinii с помощью blastp, используя в качестве запросов аминокислотные последовательности белков человека, мыши, ланцентника Branchiostoma floridae, лягушки Xenopus laevis, асцидий Ciona intestinalis и Halocynthia roretzi, из открытых баз данных. В части микротрубочек и ассоциированных с ними белков, у обоих видов были обнаружены: тубулины (альфа, бета, гамма, дельта, эпсилон), кинезины (в т.ч. легкие цепи), динактины, динеины (легкие, тяжелые и промежуточные цепи), компоненты комплекса гамма-тубулина, тубулин-полиглутамаза; гомологов статмина, стимулирующего разборку микротрубочек, обнаружено не было. Среди компонентов актинового цитоскелета обнаружены собственно актины, центрактин, динактин, миозин (тяжелые, легкие, и легкие регуляторные цепи), тропомиозин. Идентификация тропонинов осложнена их структурным сходством с кальмодулинами, составляющими другую группу кальций-связывающих белков, и небольшим размером (около 150 ак остатков). Судя по результатам филогенетического анализа белков, обнаруживаемых с помощью BLAST, тропонины у исследуемых видов губок отсутствуют. Среди актин-связывающих белков обнаружены тропомодулин, кэпирующие белки (capping actin protein), актинины, альфа-катенин, филамин, спектрин, винкулин (ранее описан у губок как участник межклеточных контактов; Miller et al., 2018), профилин, гельзолин и виллин. Исходя из анализа, выполненного путем сравнения транскриптомов H. dujardinii и L. variabilis с базой KEGG PATHWAY, содержащей аннотации белков относительно приуроченности к тому или иному процессу в клетке, у обоих видов присутствует практически полный набор участников регуляции актинового цитоскелета (Рис. 1.1). Регуляция актинового цитоскелета осуществляется через систему малых ГТФаз Rho, а также их аффекторных киназ. В составе системы малых ГТФаз Rho у L. variabilis было установлено следующее. Среди Rho ГТФаз обнаружены по 2 паралога RhoA и cdc42, а также 3 паралога Rac1. Все гомологи демонстрируют высокие уровень консерватизма на уровне последовательности, что характерно для малых ГТФаз (Рис. 1.2, 1.3). У L. variabilis было обнаружено 2 паралога ROCK (Rho-associated protein kinase) – киназы, ключевого регулятора цитоскелета, активируемого при связывании с RhoA. Их филогенетическая близость к другим ROCK подтверждена наличием РН-домена (pleckstrin homology) на С-конце пептида, что характерно именно для этих киназ. При поиске белков промежуточных филаментов использовали следующие белки: кислые и основные кератины I и II типов, десмин, глиальный кислый фибриллярный белок (GFAP), периферин, виментин, интернексин, синкоилин, ламины А/С и В, и легкие цепи нейрофиламентов. В результате у губок L. variabilis и H. dujardinii было обнаружено по два белка, имеющих характерные домены — домен IF rod (intermediate filament, Pfam:PF00038) и LTD (lamin tail domain, Pfam:PF00932). Лишь один белок из двух у каждого вида имел сигнал ядерной локализации (NLS; contig 3546 у H. dujardinii и contig 5696 у L. variabilis); именно его мы предположили в качестве функционального гомолога ядерного ламина. Второй белок в паре, вероятно, имеет цитоплазматическую локализацию (contig 1264 у H. dujardinii и contig 18 у L. variabilis; Рис. 1.4А). Для проведения филогенетического анализа мы использовали эти впервые идентифицированные последовательности, а также последовательности ламинов Bilateria и белков промежуточных филаментов Caenorhabditis elegans из NCBI, белки промежуточных филаментов стрекающих (nematocilin и cytovec), белки нейрофиламентов головоного моллюска Doryteuthis pealeii. Кроме того, с помощью BLAST мы обнаружили подобные белки в доступных транскриптомах губок Amphimedon queenslandica и Ephydatia muelleri, и доступном нам транскриптоме голожаберного моллюска Onchidoris muricata. Деревья строили по методу ML по модели LG+I+Г, выбранной с помощью ProtTest3, а также путем байесовского предсказания с помощью MrBayes (3 независимых запуска по 1 млн итераций, сэмплинг каждые 200 построений). NLS предсказывали с помощью NLStradamus. Топология деревьев, полученных разными методами, не отличалась. На филодендрограмме все настоящие ламины билатерально симметричных животных, в т.ч. идентифицированный впервые ламин моллюска Onchidoris и описанный ранее преламин А/С гидры, формируют кладу (рис. 1.4В). Сестринскую по отношению к ней кладу формируют белки губок, белки промежуточных филаментов книдарий, а также ламиноподобный белок асцидии Ciona. Оба белка Amphimedon несут NLS, тогда как оба белка Ephydatia его лишены. В эту кладу входят оба белка Halisarca (с NLS и без него), и только один белок Leucosolenia (с NLS). Ephydatia – одна из единичных губок, у которых собран геном со скаффолдами околохромосомного размера, поэтому мы полагаем, что отсутствие NLS в ее белках обусловлено несовершенством методов предсказания, либо высоким уровнем дивергенции последовательностей. Присутствие же белков стрекающих как в кладе с истинными ламинами, так и в смешанной кладе Porifera+Cnidaria, вероятно, вызвано дивергенцией последовательностей стрекающих. Так, паралоги ламиноподобных белков могли приобрести специализацию – один белок сохранял NLS и оставался в составе ядерной ламины, а второй утрачивал NLS и выполнял функции промежуточных филаментов. У стрекающих этот процесс привел к появлению белков cytovec и nematocilin, не входящих в кладу ламинов (Hwang et al. 2008; Zimek et al. 2012). Третья клада включает белки настоящих промежуточных филаментов, наиболее полно описанные среди беспозвоночных для C. elegans, нейрофиламенты модельного объекта нейробиологии – кальмара D. pealeii, впервые обнаруженный белок O. muricata и один из ламиноподобных белков губки L. variabilis. Все они лишены NLS. Ранее, в связи с недостаточным числом последовательностей губок, не удавалось разрешить их положение (Kollmar 2015). До настоящего времени белок contig 18 не был нами обнаружен, т.к. BLAST выполнялся против сборки, полученной на материале взрослой интактной губки. Сейчас мы обнаружили ряд ламиноподобных белков в транскриптоме, собранном на материале регенератов разных стадий L. variabilis. Количественные данные по экспрессии показывают, что ламин (contig 5696) экспрессируется у интактной губки и в ходе регенерации, тогда как ламиноподобный белок без NLS (contig 18) – только в ходе регенерации. Еще не менее 5 генов ламиноподобных белков проявляют такой паттерн экспрессии – экспрессируются при регенерации, но не у интактного животного, однако уровни экспрессии их значительно ниже (несколько ТРМ (transcript per million), тогда как описываемые 2 гена экспрессируются вплоть до 150 ТРМ). Мы полагаем логичным следующее объяснение этого явления. Ламин (contig 5696) относится к генам «домашнего хозяйства» и экспрессируется в норме постоянно. Ламиноподобный белок, не имеющий NLS (contig 18), экспрессируется в морфогенезах, принимает участие в формировании статичной части цитоскелета и далее не экспрессируется, пока не возникает необходимости в перемещении каких-то клеток, как это происходит в регенерации. Такая система статичного цитоскелета из промежуточных филаментов описана у тихиходок (Hering et al. 2016). На уровне первичной структуры идентифицированные у губок белки демонстрируют высокий уровень сходства с ламинами и белками промежуточных филаментов Bilateria (Рис. 1.5). Моделирование вторичной и третичной структур белка с помощью Jpred4 и Phyre2 показало наличие у обоих белков L. variabilis двух структурных доменов – альфа-спирали coiled-coil, соответствующей домену IF rod, а также С-концевому иммуноглобулин-подобному глобулярному домену, состоящему из бета-складок. Этот С-концевой домен совпадает по локализации с LTD (lamin terminal domain). Домен IF rod промежуточных филаментов и ламинов содержит гептамерные повторы аминокислот, которые обеспечивают конформацию суперскрученной спирали; IF rod состоит из трех частей (1А, 1В и 2), соединенных короткими линкерами (Herrmann, Aebi 2016). Притом для ламинов характерно присутствие в сегменте 1В шести дополнительных гептамеров, т.е. IF rod ламинов на 42 ак остатка длиннее. У обоих белков L. variabilis мы наблюдали 1В сегмент домена IF rod длиной около 160 ак остатков, т.е. характерный скорее для ламинов, нежели для промежуточных филаментов (около 120 ак остатков). На основании этого мы полагаем, что среди губок как минимум у L. variabilis один из паралогов ламиноподобных белков участвует в формировании цитоплазматического скелета клетки. Любопытно, что такое изменение функции предполагается у представителя класса Calcarea, тогда как у губок из класса Demospongiae все паралоги ламиноподобных белков лежат внутри клады Porifera+Cnidaria. 2) Фиксация образцов интактных тканей взрослых губок L. variabilis и H. dujardinii, личинок и метаморфизирующих куколок H. dujardinii, образцов разных стадий регенерации стенки тела L. variabilis Сбор интактных взрослых губок проводили с мая по октябрь 2021 года в окрестностях Беломорской биологической станции МГУ во время отлива с верхней сублиторали. После сбора губок вместе с небольшим количеством естественного субстрата помещали в лабораторный аквариум (естественная морская вода, 70 л, 10-12С, биологический фильтр, ежедневная смена 40% воды) на 1-2 суток. Перед фиксацией губок L. variabilis отделяли от субстрата и разрезали кормус на небольшие фрагменты с помощью микроножниц. В случае H. dujardinii выбирали небольших губок, которых фиксировали целиком с небольшим объемом субстрата (субстрат удаляли после фиксации). Для иммуноцитохимических исследований фиксации проводили 4% параформальдегидом на 1xPBS (4% PFA PBS) (+4С), 2,5% глютаровым альдегидом на 1xPBS (2.5% GA PBS) (+4С) или ледяным метанолом (-20С). Образцы хранили в фиксаторах до проводки и окраски (глютаральдегидные и параформальдегидные фиксации – не более 3 месяцев; метанольные фиксации – не более 1 месяца). Для гистологических и ультраструктурных исследований образцы фиксировали 2,5% глютаровым альдегидом на модифицированном 0,1M натрий-какодилатном буфере с последующей постфиксацией 1% OsO4 на том же буфере. Затем образцы обезвоживали и заключали в эпоксидную смолу по стандартной методике (Lavrov et al. 2022; Lavrov, Ereskovsky 2022). Зрелые личинки H. duajrdinii получали путем спонтанного вымета в репродуктивный сезон (конец июня – начало июля). Губок, содержащих в тканях личинок (такие особи окрашены в белый цвет), помещали в емкости с естественной морской водой и содержали при 12-14С, проверяя дважды в день. По мере завершения эмбриогенеза и созревания личинок, они выметывались материнским организмом и всплывали к поверхностной пленке; личинки собирали с поверхности воды и фиксировали для иммуноцитохимических исследований по описанной выше методике. Осаждение и метаморфоз личинок индуцировали, помещая их в чашки Петри с фрагментами проксимальной части таллома фукуса. Полученные метаморфизирующие куколки фиксировали для иммуноцитохимических исследований по описанной выше методике или использовали для прижизненных экспериментов. Для индукции регенерации стенки тела у L. variabilis ее оскулярные трубки разрезали перпендикулярно главной оси на кольца шириной 2-4 мм с помощью микроножниц. Полученные кольца тканей культивировали в стерильной морской воде (фильтрация через фильтр с размером ячеи 0,22 мкм) (СМВ), смену половины среды проводили каждые 12 часов. Регенерация происходила путем формирования регенеративных мембран (РМ) на торцевых сторонах колец, перпендикулярно интактным стенкам тела. Фиксации проводили на стадии растущей РМ (12-24 часа после операции (чпо)) и полной РМ (24+ чпо) по описанной выше методике. 3) Структура систем актиновых филаментов и микротрубочек в основных типах клеток интактных тканей L. variabilis и H. dujardinii Для визуализации систем цитоскелета зафиксированные образцы тканей губок трижды отмывали в 1xPBS, а затем инкубировали в блокирующем растворе (1% BSA, 0,1% cold‐water fish skin gelatin, 0,5% Triton X‐100, 0,05% Tween‐20 на 1xPBS). В случае глютаральдегидных фиксаций образцы перед инкубацией в блокирующем растворе обрабатывали 2,5% боргидридом натрия на 1хPBS для подавления автофлуоресценции, вызываемой глютаровым альдегидом. После блокирующего раствора образцы инкубировали в растворе первичных антител в течение 8-12 ч при 4°С. От первичных антител образцы трижды отмывали блокирующим раствором, а затем инкубировали в свежей порции блокирующего раствора в течение 8-12 ч при 4°С. После инкубации в блокирующем растворе образцы помещали в раствор вторичных антител на блокирующем растворе в течение 8-12 ч при 4°С. После инкубации во вторичных антителах образцы трижды отмывали 1xPBS и проводили окрашивание ядер с помощью 2 мкг/мл раствора DAPI на 1xPBS в течение 30-60 мин. После окрашивания ядер образцы трижды отмывали в 1хPBS и заключали в 90% глицерин с 2,5% DABCO на 1xPBS. В случае тканей L. variabilis перед заключением в глицерин образцы обрабатывали 5% водным раствором ЭДТА для удаления спикул. Для визуализации систем актинового цитоскелета были использованы следующие первичные антитела: 1) Анти-бета-актин (мышь), клон 4С2, Bio-Rad, MCA5775, разведение 1:100 2) Анти-бета-актин (кролик), клон 6L12, Sigma-Aldrich, ZRB1312, разведение 1:100 Для визуализации системы микротрубочек были использованы следующие первичные антитела: 1) Анти-альфа-тубулин (мышь), клон DM1a, Sigma-Aldrich, T9026, разведение 1:100 2) Анти-ацетилированный(Lys40)-альфа-тубулин (кролик), клон RM318, Sigma-Aldrich, SAB5600134, разведение 1:100 3) Анти-детирозинированный)-альфа-тубулин (кролик), поликлональные, Abcam, ab48389, разведение 1:100 4) Анти-тирозинированный-альфа-тубулин (мышь), клон TUB-1A2, Sigma-Aldrich, T9028, разведение 1:100 Во всех случаях были использованы следующие вторичные антитела: 1) Donkey Anti-Mouse IgG Alexa 488 (A21202, Thermo Fisher Scientific), рабочая концентрация 5 мкг/мл 2) Donkey Anti-Mouse IgG Alexa 546 (A10036, Thermo Fisher Scientific), рабочая концентрация 5 мкг/мл 3) Donkey Anti-Mouse IgG Alexa 555 (A-31570, Thermo Fisher Scientific), рабочая концентрация 5 мкг/мл 4) Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa 546 (A10040, Thermo Fisher Scientific), рабочая концентрация 5 мкг/мл 5) Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa 647 (A-31573, Thermo Fisher Scientific), рабочая концентрация 5 мкг/мл Полученные препараты изучали на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon A1 (Nikon). С каждого препарата получали Z-стэки общего вида тканей с шагом 1 мкм для описания клеточного состава, а также Z-стэки отдельных клеток с зумом 2.5-4х и шагом 0.150-0.300 мкм для детального описания систем цитоскелета. Полученные Z-стэки изучали с помощью программ NIS Viewer v.4.5, FiJi ImageJ v.1.52i и Bitplane Imaris v.7.2.1. Морфологию клеток описывали с использованием 3 параметров: площадь, округлость и вытянутость (соотношение осей) (данные приведены как среднее ± стандартная ошибка). Выборки проверяли на нормальность тестом Шапиро-Уилка. Статистический анализ проводился с использованием непараметрических критериев. Для сравнения средних в двух группах использовали односторонний U-критерий Манна-Уитни. Для множественных сравнений использовали критерий Краскелла-Уоллиса с последующими пост-хок тестами Данна с применением поправки Бенджамини-Хохберга. Leucosolenia variabilis Актиновый цитоскелет Интактные экзопинакоциты имеют Т-образную форму и состоят из погруженного в мезохил клеточного тела и наружной цитоплазматической пластинки. Клеточное тело экзопинакоцита имеет овальную форму и несет множество филоподии (Рис. 3.1A). Плоская многоугольная цитоплазматическая пластинка (Рис. 3.1A,B) соединена с телом клетки тонкой тонким цитоплазматическим мостиком. Пластинки экзопинакоцитов образуют внешним слой тела губки. Актиновый цитоскелет в экзопинакоцитах представлен кортикальным слоем актина, который выявляется по границам как клеточного тела, так цитоплазматической пластинки, а также актином в составе выростов филоподий (Рис. 3.1A,B). Морфологические параметры были измерены отдельно для клеточных тел и цитоплазматических пластинок экзопинакоцитов. Тела имеют площадь 67,01 ± 1,941 мкм2 (n = 73), низкую округлость (0,1284 ± 0,008, n = 67) и низкую вытянутость (1,547 ± 0,037, n = 67). Цитоплазматические пластинки имеют значительную площадь (199,6±5,188 мкм2, n=266), относительно высокое значение округлости (0,6745±0,006, n=268) и низкую вытянутость (1,514 ± 0,019, n = 256). Такие значения позволяют предположить, что в интактной стенке тела экзопинакодерма не проявляет миграторной активности и представляет собой стабильный слой клеток. Хоаноциты представляют собой плотно упакованные призматические клетки с воротником микроворсинок и жгутиком на апикальной стороне. Актиновые структуры в хоаноцитах представлены кортикальным слоем актина и актином в составе коротких филоподий (Рис. 3.1D). Эти клетки имеют небольшую площадь 29,74±0,5146 мкм2 (n=131) и в поперечном сечении являются практически круглыми: значение округлости составляет 0,9071±0,0042 (n=131), а вытянутость 1,177±0,0083 (n=129). Пороциты, формирующие остии, представляют собой цилиндрические клетки со сквозным каналом. Клетку можно разделить на клеточное тело, несущее ядро, и каналобразующий вырост клетки, который формируют собственно остию и представляет собой тонкий слой цитоплазмы. Клеточное тело с ядром слегка выдается в мезохил. Актиновый цитоскелет в экзопинакоцитах представлен кортикальным слоем актина, а также актиновыми пучками в составе коротких немногочисленных филоподий (Рис. 3.1C). Клетки мезохила являются гетерогенной популяцией. Они различаются по морфологии и, скорее всего, по функциям. С помощью иммуноцитохимии мы смогли различить два типа клеток – склероциты и крупные амебоидные клетки. Склероциты имеют веретенообразную форму, очерчены кортикальным актином и часто имеют немногочисленные филоподии с длинным актиновым пучком внутри. Иногда они несут параллельные актиновые пучки, похожие на стресс-фибриллы (Рис. 3.1E). Склероциты характеризуются площадью 113,9±4,275 мкм2 (n=99), низким значением округлости (0,3048±0,0112, n=99) и высоким значение вытянутости (3,019±0,0933, n=99). Крупные амебоидные клетки имеют овальное ядро и очень длинные ветвящиеся цитоплазматические отростки. После окраски этих клеток антителами к бета-актину они демонстрируют гомогенную яркую флуоресценцию всей цитоплазмы (Рис. 3.1F). Крупные амебоидные клетки имеют площадь 224,8±16,78 мкм2 (n=19), очень низкое значение округлости (0,0816±0,0122, n=19), обусловленное ветвящимися отростками, и относительное невысокое значение вытянутости (1,837±0,09, n=19), что указывает на то, что выросты клетки направлены скорее во все стороны, чем в одном выбранном направлении. Помимо антител мы пытались использовать для прижизненной визуализации актина краситель SiR-actin (Spirochrome). Для этого мы добавляли стоковый раствор красители в СВМ для получения финальных концентрациях 0.5, 1, 2 и 10 мкМ. Также тестировали разные длительности экспозиции – 1, 2, 3, 6 и 24 ч. Однако получить прижизненных окрасок не удалось. Затем мы попытались использовать этот краситель для окраски фиксированных тканей. Были использованы фиксации тканей 4% PFA PBS, 2,5% GA PBS и ледяным метанолом. После фиксаторов ткани отмывали в 1xPBS. Стоковый раствор SiR-actin добавляли в 1xPBS до финальной концентрации 1 мкМ; время экспозиции – 1 ч. Получить окраску удалось только в тканях, зафиксированных 4% PFA PBS. Качество и детализации окраски SiR-actin в целом не отличались от окрасок антителами (Рис. 3.2). Микротрубочки Окраска антителами к альфа-тубулину позволяет выявить плотную сеть микротрубочек во всех клетках интактных тканей L. variabilis. В телах экзопинакоцитов пучки микротрубочек радиально расходятся от единого центра организации микротрубочек (ЦОМТ), лежащего около ядра (обычно около его апико-латеральных частей, реже около базальных) (Рис. 3.3A,B,D). Часть пучков микротрубочек, огибая ядро, направляется через цитоплазматический мостик в пластинку экзопинакоцитов (Рис. 3.3A,B). В пластинке экзопинакоцита пучки микротрубочек расходятся радиально к ее краям (Рис. 3.3C). В хоаноцитах ЦОМТом является кинетосома жгутика, расположенная в апикальной части клетки. От нее пучки микротрубочек радиально расходятся в латеро-базальном направлении (Рис. 3.4A). Достигая цитоплазматической мембраны, пучки микротрубочек идут вдоль нее в базальном направлении (Рис. 3.4B). В самых базальных частях хоаноцитов пучки микротрубочек отходят от цитоплазматической мембраны и формируют нерегулярную сеть (Рис. 3.4C). Также в хоаноцитах выявляется аксонема жгутика (Рис. 3.4A). В пороцитах пучки микротрубочек также расходятся от единственного ЦОМТа, лежащего около ядра в базальной части клетки. Пучки микротрубочек идут в каналобразующий вырост клетки, где формируют нерегулярную сеть (Рис. 3.5). В склероцитах микротрубочки представлены пучками, расходящимися от единственного ЦОМТа около ядра вдоль длинной оси клетки (Рис. 3.6). Обширная сеть микротрубочек сохраняется в склероцитах и во время синтеза спикул (Рис. 3.7). В крупных амебоидных клетках пучки микротрубочек формируют плотную нерегулярную сеть, которая заходит в том числе и в цитоплазматические выросты клетки. Все пучки расходятся от единственного ЦОМТа, находящегося около ядра (Рис. 3.8). После исследования общей структуры сети микротрубочек мы оценили наличие и распределение в этой сети пост-трансляционных модификаций альфа-тубулина: тирозинированный альфа-тубулин, детирозинированный альфа-тубулин и ацетилированный альфа-тубулин. Тирозинированный альфа-тубулин является доминирующей формой в клетках L. variabilis: выявляемая с помощью антитела к тирозинированному альфа-тубулину сеть микротрубочек качественно не отличается от сети, выявляемой антителами к общему альфа-тубулину. Антитела к детирозинированному альфа-тубулину выявляют активную центросому в экзопинакоцитах. Центросома лежит околоядерной области. (Рис. 3.9A-D). В ходе митоза экзопинакоцитов центросома удваивается и лежит на каждом из полюсов веретена деления (Рис. 3.9E). Наличие активной центросомы в экзопинакоцитах свидетельствует об необходимости роста новых микротрубочек, необходимых для транспорта и поддержания полярности клетки. Кроме того, антитела к детирозинированному альфа-тубулину позволили обнаружить еще один тип клеток мезохила: мелкие округлые клетки (изредка они имеют цитоплазматические выросты, куда заходят пуски микротрубочек) с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением (Рис. 3.10). Они лежат в непосредственной близости от базальных частей хоаноцитов, и вся сеть микротрубочек в этих клетках построена из детирозинированного альфа-тубулина. При этом в этих клетках не удается обнаружить единого ЦОМТа, и сеть микротрубочек имеет несколько фокусов схождения (Рис. 3.10). Известно, что сеть детирозинилированных микротрубочек более стабильна и устойчива к деполимеризации и является важным компонентом устойчивости клеток к механическим воздействиям. Кроме того, сеть детирозинилированных микротрубочек играет важную роль в митозе, регулируя движение хромосом по кинетохорным микротрубочкам. Возможно, такие клетки являются предшественниками зрелых клеток мезохила с более высоким пролиферативным потенциалом. Использование антител к ацетилированному альфа-тубулину показало, что этой пост-трансляционной модификацией богаты аксонемы жгутиков хоаноцитов и веретена деления митотических хоаноцитов (Рис. 3.11) (вероятно, это справедливо и для других типов клеток, но поскольку их митозы редки, они не были обнаружены на наших препаратах). Также в небольшом количестве хоаноцитов вся сеть микротрубочек построена из ацетилированного альфа-тубулина (Рис. 3.12). Такие хоаноциты обычно лежат парами и, вероятно, представляют собой дочерние клетки только что закончившие митоз и использовавшие микротрубочки веретена деления для построения своего цитоскелета. Ультраструктурные исследования В ходе ультраструктурных исследований мы сосредоточились на кинетосоме хоаноцитов L. variabilis, который также является и ЦОМТом в этих клетках. Кинетосома расположена в самой апикальной части клетки и состоит из триплетов микротрубочек. Конусовидная базальная ножка своим широким основанием прикрепляется к проксимальной части кинетосомы под прямым углом. Развитый фибриллярный корешок идет от проксимального конца кинетосомы прикрепляется к апикальной поверхности ядра. Дополнительная центриоль ортогональна кинетосоме и лежит под ней ниже базальной ножки. Дополнительную центриоль окружает аморфный электронно-плотный материал (Рис. 3.13A) (Lavrov et al. 2022). При исследованиях оскулярного кольца (наиболее дистальная часть оскулярной трубки, где эндопинакодерма сменяет хоанодерму на внутренней выстилке стенки тела) L. variabilis в мезохиле нами были обнаружены вытянутые клетки, явно несущие в своей цитоплазме толстые параллельные пучки актиновых фибрилл (Рис. 3.13B). Это могут быть сократимые клетки «миоциты», которые обеспечивают сократительную активность оскулярного кольца губки. Halisarca dujardinii Получить качественные иммуноцитохимические окраски интактных тканей H. dujardinii пока не удалось: в большинстве случаев мы наблюдали более или менее гомогенную флуоресценцию в образцах. Лишь в нескольких случаях у образцов, зафиксированных метанолом, удалось визуализировать микротрубочки в мигрирующих клетках мезохила (амебоцитах или лофоцитах) в эктосоме (наиболее поверхностный слой тела губки) (Рис. 3.14). Мы полагаем, что причина плохой окраски – сильно развитый внеклеточный матрикс мезохила, который блокирует проникновение антител. В следующем году мы попробуем несколько модификаций протоколов фиксации и пробоподготовки тканей H. dujardinii для иммуноцитохимических исследований. В связи с описанными сложностями работы с личинками и куколками H. dujardinii будут также перенесены на следующий год. 4) Структура систем актиновых филаментов и микротрубочек в основных типах клеток при регенерации стенки тела L. variabilis Операция для получения регенератов и условия их последующего культивирования, а также методы фиксации и пробоподготовки образцов описаны выше. Кольца, полученные после операции, имеют две раневые зоны, расположенные в плоскостях среза. Процесс регенерации приводит к формированию новых стенок тела, которые закрывают раневые отверстия и располагаются перпендикулярно неповрежденным стенкам кольца. Регенерация колец происходит сходно с регенерацией стенки тела при удалении ее небольшого фрагмента (Lavrov et al. 2018; Ereskovsky et al. 2021). Центральным событием является формирование временной структуры - регенеративной мембраны (РМ). РМ появляется примерно через 12-24 часа после операции (чпо) на краю раны и постепенно растет в центростремительном направлении. В процессе роста РМ имеет толщину 10-15 мкм и состоит из трех слоев: наружной экзопинакодермы, внутренней эндопинакодермы и очень узкого мезохила между ними. Как было показано ранее, эндопинакоциты РМ появляются путем трансдифференцировки хоаноцитов в области раны (Lavrov et al. 2018; Ereskovsky et al. 2021). Контакты экзо- и эндопинакоцитов на растущем крае РМ изолируют мезохил от внешней среды. Полная РМ, закрывающая раневое отверстие, обычно формируется к ~48 чпо. Однако уже к ~24-30 чпо начинается трансформация РМ в стенку тела. Этот процесс включает в себя: 1) замещение эндопинакоцитов хоаноцитами на внутренней стороне РМ, 2) появление пороцитов, пронизывающих РМ, 3) синтез новых спикул в мезохиле РМ. Все эти процессы начинаются в периферической части РМ и постепенно протекают в центростремительном направлении. Преобразование РМ в стенку тела заканчивается к 72 чпо. В плоских экзопинакоцитах РМ актиновый цитоскелет представлен кортикальными филаментами. Клетки на переднем крае растущей РМ часто имеют филоподии с вн (Рис. 4.1). Кроме того, клетки на переднем крае формируют мощный актиновый пучок (Рис. 4.1). Прижизненные наблюдения показывают, что растущий край РМ находится под натяжением, которое, вероятно, создается за счет сокращения актинового пучка. Это указывает на возможное участие в росте РМ у L. variabilis механизма «purse-string», описанного, в частности, при регенерации ран у эмбрионов высших многоклеточных животных (Brock et al. 1996; Martin et al. 1992). Сеть микротрубочек в экзопинакоцитах РМ также перестраивается. Она представляет собой систему из радиальных извилистых пучков микротрубочек, которые расходятся от единственного ЦОМТа, расположенного рядом с ядром (Рис. 4.2A). Во время роста РМ ее внутренний слой представлен плоскими полигональными эндопинакоцитами. Эти клетки происходят из хоаноцитов, которые уплощаются и теряют воротничок микроворсинок и жгутик. Актиновый цитоскелет в этих клетках представлен кортикальными микрофиламентами. Сеть микротрубочек в этих клетках сходна с сетью в экзопинакоцитах РМ: она состоит из радиальных извилистых пучков микротрубочек, которые расходятся от единственного ЦОМТа, расположенного рядом с ядром (Рис. 4.2B). На поздних стадиях, когда происходит трансформация РМ в интактную стенку тела, эндопинакоциты начинают редифференцироваться в хоаноциты и приобретают округлую форму. Актиновый цитоскелет этих клеток по-прежнему представлен кортикальными филаментами. Система микротрубочек в этих клетках будет изучена в ходе дальнейшей работы. Мезохил в РМ достаточно тонкий, клетки в нем немногочислены. Клетки мезохила имеют множество филоподий с параллельным пучком актиновых филаментов внутри и, судя по прижизненным наблюдениям, активно мигрируют. Тем не менее, у них отсутствуют стресс-фибриллы. Система микротрубочек в этих клетках также будет изучена в ходе дальнейшей работы. Поскольку изменение формы клеток экзопинакодермы и хоанодермы, вероятно, вносят основной вклад в процесс регенерации, мы оценили изменения их морфологические параметры. Нам удалось показать, что изменение формы этих клеток при формировании и трансформации РМ отражается в статистически значимом изменении их морфологических параметров. При уплощении экзопинакоцитов их площадь значимо увеличивается до 231,2±6,367 мкм2 (n=196; p=0,0001), округлость снижается до 0,6286±0,0081 (n=196; p<0,0001), вытянутость увеличивается до 1,587±0,027 (n=196; p<0,05) (Рис. 4.3А-С). Такое изменение морфологических параметров указывает на повышение миграторного потенциала клеток, что, вероятно, говорит о переходе экзопинакоцитов к направленному движению. Трансдифференцировка хоаноцитов в эндопинакоциты сопровождается значимыми изменениями всех морфологических параметров клетки: площадь возрастает до 89,63±7,535 мкм2 (n=50; p<0,0001), округлость снижается до 0,6499±0,0189 (n=52; p<0,0001), вытянутость повышается до 1,56±0,0493 (n=51; p<0,0001) (Рис. 4.3D-F). Редифференцирующиеся хоаноциты имеют морфологические параметры, отличающиеся как от интактных хоаноцитов, так и от эндопинакоцитов РМ: площадь 62,04±0,8904 мкм2 (n=285), округлость 0,881±0,0023 (n=245) и вытянутость 1,226±0,0086 (n=276) (Рис. 4.3D-F). Очевидно, что и в этом случае трансдифференцирующиеся хоаноциты приобретают больший миграторный потенциал и способность к направленному движению. Вклад клеток мезохила в процесс регенерации остается не ясным. Кроме того, на данном этапе мы не смогли сопоставить типы клеток мезохила в интактных тканях губки и при регенерации. 5) Тестовые эксперименты по функциональному анализу роли систем цитоскелета при регенерации стенки тела L. variabilis и метаморфозе личинок H. dujardinii, подобрать эффективные концентрации действующих веществ Регенерация стенки тела L. variabilis Операция для получения регенератов и условия их последующего культивирования описаны выше. Ингибиторы полимеризации актина Определение эффективных концентраций ингибиторов полимеризации актина проводилось без иммуноцитохимического окрашивания, с применением фазово-контрастной световой микроскопии и цейтраферной съёмки. Образцы с неполной и полной РМ помещались в свежую СВМ, туда же добавляли ингибиторы в тестируемых концентрациях (100 нМ и 200 нМ для латрункулина В; 0.5 мкМ, 1.0 мкМ, 1.5 мкМ, 2 мкМ, 3.5 мкМ, 4.5 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ для цитохалазина D). В контрольные чашки добавляли ДМСО в эквивалентном объёме. Все чашки оставляли на шейкере на 10 минут (70 об/мин, 8-11С), а затем инкубировали при 9-10С 300 минут (за температурой внимательно следили, так как это важный фактор динамики актиновых филаментов). После инкубации образцы фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом на PBS (4 часа, 4С), отмывали в трёх сменах PBS и делали временные препараты для просмотра в световой микроскоп LEICA DM2500 с объективами 10х, 20х, 40х. Были также сделаны живые препараты в СВМ, чтобы оценить состояние животного. Под воздействием латрункулина B все клетки стенки тела губки L. variabilis ошариваются, увеличиваются в объёме (Рис. 5.1). У живых губок продолжается биение жгутиков хоаноцитов, не отличимое от контрольных. Хоанодерма становится более «рыхлой», при значительных механических воздействиях разрушается (особенно сильно на концентрации 200 нМ), в стенке тела не видны пороциты (Рис. 5.1). Регенеративная мембрана на любой стадии роста после 300 минут инкубации разбирается на обеих тестируемых концентрациях. Концентрации 100 нМ латрункулина В была определена как эффективная и использовалась в дальнейшем, так как при этой концентрации происходит ошаривание клеток, а значит и деполимеризация актиновых филаментов, но целостность хоанодермы сохраняется лучше. Чтобы проследить изменения, происходящие с РМ в течение 300 минут инкубации в 100 нМ латрункулина B, была поставлена цейтраферная съёмка процесса с использованием инвертированного микроскопа Nikon TI-S, оборудованного камерой Toupcam U3CMOS05100KPA и охлаждающим предметным столиком. Эквивалентный размер пиксела составил при съёмке с объективом 40х/0.5 – 0.11 мкм. Режим съёмки: интервал 15 секунд в течение 5 часов (1200 - 1300 кадров). Наблюдаемые образцы располагались в чашках Петри диаметром 35 мм в 5 мл СВМ (100 нМ латрункулина В) при постоянной температуре 9-10С. Под действием латрункулина B неполная РМ быстро разбирается (около 60 минут), в поле зрения остаётся лишь поперечный вид стенки тела, с ошаренными хоаноцитами, бьющими жгутиками. На протяжении всего времени инкубации образование РМ не происходит. В полной РМ можно наблюдать множественные ошаренные клетки мезохила, которые не имеют выростов, необходимых для миграции (склероподий, лобоподий). Кроме того, в полной РМ, вероятно, в местах максимального натяжения, появляется отверстие, постепенно увеличивающееся в размерах. Отверстие может быть не одно. Далее РМ разбирается с увеличивающейся скоростью, сначала разные стороны появившихся отверстий ещё сдерживают многоклеточные тяжи (вероятно, из клеток и внеклеточного матрикса), но в итоге рвутся и они. Таким образом, полная РМ также разбирается, оставляя всю раневую поверхность незакрытой, биение жгутиков хоаноцитов продолжается. Клетки L. variavilis оказались не чувствительны к действию цитохалазина D: ни одна из использованных концентраций цитохалазина D (максимальная – 20 мкМ) не оказали влияние на процесс регенерации L. variabilis. От дальнейшего повышения концентраций решено было отказаться, поскольку нецелевые эффекты столь высокой дозы могут оказывать влияние на получаемые результаты. Ингибиторы полимеризации микротрубочек Определение эффективных концентраций ингибиторов полимеризации микротрубочек проводилось с использованием иммуноцитохимического окрашивания, а также с применением цейтраферной съёмки. Нокодазол вызывает деполимеризацию систем микротрубочек в клетке, а сочетание нокодазола с таксолом в наномолярных концентрациях подавляет динамическую нестабильность микротрубочек (Tvorogova et al. 2018). Образцы с неполной и полной РМ (24 чпо и более, соответственно) помещались в свежую СВМ, туда же добавляли ингибиторы в тестируемых концентрациях (0.5 мкМ, 1.0 мкМ, 1.5 мкМ, 2 мкМ и 4 мкМ для нокодазола или ранее описанное сочетание 100 нМ нокодазола и 50 нМ таксола). В контрольные чашки добавляли ДМСО в эквивалентном объёме. Все чашки оставляли на шейкере на 10 минут (70 об/мин, 8-11С), а затем инкубировали при 9-10С 300 минут (за температурой внимательно следили, так как это важный фактор динамики микротрубочек). После инкубации образцы фиксировали холодным 2.5% глютаровым альдегидом на PBS (12 часов, 4С), для выявления системы микротрубочек в клетке использовались антитела к альфа-субъединице тубулина (клон DM1a). Окраску проводили по описанной выше методике. По мере повышения концентрации нокодазола система микротрубочек в клетках стенки тела и РМ губки постепенно становится всё более нарушенной, пучки микротрубочек укорачиваются (Рис. 5.2). В качестве рабочей была выбрана концентрация 4 мкМ. На этой концентрации в клетках сохраняется некоторое количество коротких пучков микротрубочек, сконцентрированных вокруг ЦОМТа. Тем не менее, от дальнейшего повышения концентраций решено было отказаться, поскольку токсические эффекты более высокой дозы могут оказывать влияние на получаемые результаты. Чтобы проследить изменения, происходящие с РМ в течение 300 минут инкубации в 4 мкМ нокодазола была поставлена цейтраферная съёмка процесса с описанными выше параметрами. Неполная РМ разбирается под воздействием нокодазола, однако, имеется значительный лаг-период, в отличие от инкубации в латрункулине В. Клетки мезохила в РМ мигрируют, нарушений в структурах, отвечающих за движение, не замечено. В полной РМ под воздействием нокодазола никаких видимых изменений не замечено, на протяжении 300 минут инкубации процесс регенерации ничем не отличается от контрольного. Образцы, инкубированные в 100 нМ нокодазола и 50 нМ таксола, зафиксированы холодным 2.5% глютаровым альгедидом на PBS. Чтобы проследить изменения, происходящие с РМ в течение 300 минут инкубации в 100 нМ нокодазола и 50 нМ таксола была поставлена цейтраферная съёмка процесса с описанными выше параметрами. Неполная РМ под воздействием смеси нокодазола и таксола может как продолжить свой рост, так и остановиться. Мы предполагаем, что это связано с фазой процесса – на ранних стадиях, когда РМ представляет собой тонкий ободок по периферии раны, её рост под действием ингибиторов не происходит, а на более поздних стадиях наличие ингибиторов никак не отражается на процессе закрытия раны. В полной РМ смесь нокодазола и таксола никак не влияет на процесс регенерации, клетки мезохила также сохраняют свою подвижность, идёт спикулогенез. Модуляторы активности Rho-киназы Определение эффективных концентраций ингибитора и активатора Rho-киназы проводилось без иммуноцитохимического окрашивания, с применением световой микроскопии. Образцы с неполной и полной РМ помещались в свежую СМВ, туда же добавляли ингибиторы в тестируемых концентрациях (0.5 мкг/мл, 1.0 мкг/мл и 2.0 мкг/мл для Rho-activator, CN03; 1 мкг/мл, 4 мкг/мл и 8 мкг/мл для Rho-inhibitor, CT04). Чашки оставляли на шейкере на 10 минут (70 об/мин, 8-11С), а затем инкубировали при 9-10С 300 минут (за температурой внимательно следили, так как это важный фактор динамики цитоскелета). После инкубации образцы фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом на PBS (12 часов, 4С), отмывали в трёх сменах PBS и делали временные препараты для просмотра в световой микроскоп LEICA DM2500 с объективами 10х, 20х, 40х. Были также сделаны живые препараты в СВМ, чтобы оценить состояние животного. Выбранные эффективные концентрации составили 2.0 мкг/мл для Rho-activator (CN03) и 4 мкг/мл для Rho-inhibitor (CT04). Выбранные концентрации веществ не оказывают значительного влияния на морфологию клеток стенки тела губки и скорость процессов регенерации. Морфологию актинового цитоскелета под действием ингибитора и активатора Rho ещё предстоит установить. Для дальнейшего анализа эффектов ингибитора и активатора Rho методом вестерн блотинга целые губки, очищенные от дебриса, были инкубированы (300 минут, 9-10С) в 1 мл СВМ c выбранными концентрациями веществ. К контрольным губкам добавляли MilliQ в эквивалентном объёме. После инкубации губки были помещены в 200 мкл RIPE буфера c 1 мМ PMSF и заморожены на -80С. Метаморфоз Halisarca dujardinii Методы получения метаморфизирующих куколок и условия их последующего культивирования описаны выше. Поскольку индуцировать единовременный метаморфоз множества личинок невозможно, в одном эксперименте могли использоваться куколки разного возраста. В 2021 году проводили только эксперименты и фиксировали материал. Оценка влияния ингибиторов на системы цитоскелета и выбор действующей концентрации будет проведен в начале 2022 года. Ингибиторы полимеризации актина Куколок вместе с небольшим количеством субстрата помещали в свежую СВМ, туда же добавляли ингибиторы в тестируемых концентрациях (100 нМ и 200 нМ для латрункулина В; 0.5 мкМ, 1.0 мкМ, 1.5 мкМ, 2 мкМ, 3.5 мкМ, 4.5 мкМ для цитохалазина D). В контрольные чашки добавляли ДМСО в эквивалентном объёме. Все чашки оставляли на шейкере на 10 минут (70 об/мин, 8-11С), а затем инкубировали при 9-10С 300 минут (за температурой внимательно следили, так как это важный фактор динамики актиновых филаментов). После инкубации образцы фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом на PBS (4С) и хранили в нем для последующего исследования. Ингибиторы полимеризации микротрубочек Куколок вместе с небольшим количеством субстрата помещали в свежую СВМ, туда же добавляли ингибиторы в тестируемых концентрациях (0.5 мкМ, 1 мкМ, 1.5 мкМ и 2 мкМ для нокодазола или ранее описанное сочетание 100 нМ нокодазола и 50 нМ таксола). В контрольные чашки добавляли ДМСО в эквивалентном объёме. Все чашки оставляли на шейкере на 10 минут (70 об/мин, 8-11С), а затем инкубировали при 9-10С 300 минут (за температурой внимательно следили, так как это важный фактор динамики микротрубочек). После инкубации образцы фиксировали 2.5% глютаровым альдегидом на PBS (4С) и хранили в нем для последующего исследования. 6) Подготовка научных статей и участие в конференциях по материалам проекта По материалам проекта было подготовлено 2 статьи в международных научных журналах, индексируемых в базах WoS и Scopus. Еще одна статья, описывающая морфологические изменения клеток при формировании регенеративной мембраны у L. variabilis, находится на стадии подготовки. Также по материалам проекта было сделано 2 устных доклада на научных конференциях. | ||
2 | 30 мая 2022 г.-17 января 2023 г. | Динамика, роль и Rho-опосредованная регуляция цитоскелета в развитии и регенерации у губок |
Результаты этапа: 1) Поиск и анализ in silico ортологов генов, вовлеченных в регуляцию цитоскелета через каскады малых ГТФаз из семейства Rho в геномных и транскриптомных базах данных L. variabilis и H. Dujardinii В ходе in silico анализа транскриптомов Leucosolenia variabilis и Halisarca dujardinii в части микротрубочек и ассоциированных с ними белков, у обоих видов были обнаружены: тубулины (альфа, бета, гамма, дельта, эпсилон), кинезины (в т.ч. лёгкие цепи), динактины, динеины (лёгкие, тяжёлые и промежуточные цепи), компоненты комплекса гамма-тубулина, тубулин-полиглутамаза; гомологи плюс-концевых (CKAP5), минус-концевых (Patronin), дестабилизирующих (MCAK, stathmin) и разрезающих (katanin, spastin, fidgetin) белков. Среди компонентов актинового цитоскелета обнаружены собственно актины, центрактин, динактин, миозин (тяжёлые, лёгкие, и лёгкие регуляторные цепи), тропомиозин. Среди актин-связывающих белков обнаружены тропомодулин, кэпирующие белки (capping actin protein), актинины, α-катенин, филамин, спектрин, винкулин (ранее описан у губок как участник межклеточных контактов; Miller et al., 2018), профилин, гельзолин и виллин. Исходя из анализа, выполненного путём сравнения транскриптомов H. dujardinii и L. variabilis с базой KEGG PATHWAY, содержащей аннотации белков относительно приуроченности к тому или иному процессу в клетке, у обоих видов присутствует практически полный набор участников регуляции актинового цитоскелета. Регуляция актинового цитоскелета осуществляется через систему малых ГТФаз Rho, а также их эффекторных киназ. В составе семейства малых ГТФаз Rho у L. variabilis было обнаружены по 2 паралога RhoA и cdc42, и 3 паралога Rac1. Все гомологи демонстрируют высокие уровень консерватизма на уровне последовательности, что характерно для малых ГТФаз. Для всех найденных малых ГТФаз характерны следующие (общие для всех) сайты и домены: сайт связывания GTP/Mg2+, сайт взаимодействия с GAPs, сайт взаимодействия с GEFs, сайт взаимодействия с GDIs. Эти сайты и мотивы совпадают с тем, что известно об этих белках у высших многоклеточных животных. Найденные эффекторные регионы Switch I и Switch II обеспечивают конформационные изменения, сопровождающие связывание белком ГТФ, а G1-G5 консервативные мотивы ответственны за связывание и гидролиз ГТФ. В найденных нами последовательностях ортологов малых ГТФаз были показаны следующие уникальные (для каждой отдельной ГТФазы) сайты и домены: a) у ГТФаз Rho были найдены сайт взаимодействия с ROCK, сайт взаимодействия с PKN/PRK1 (киназа, задействованная в передаче сигналов, регулирующих динамику цитоскелета); сайт взаимодействия с mDia (эффектор, связанный со стабилизацией МТ). b) у ГТФаз cdc42 были найдены сайт взаимодействия c эффекторами из семейства CRIB (cdc42/Rac-связывающиеся эффекторы); сайт взаимодействия с белком комплекса полярности Par6; сайт взаимодействия с тирозинкиназой ACK. c) у ГТФаз Rac1 были найдены сайт взаимодействия p67PhoxTPR (обеспечивает сборку комплекса NADPH-оксидазы); сайт взаимодействия с Arfaptin/Por (обеспечивает взаимосвязь с ГТФазами из подсемейства Arf); Все перечисленные выше сайты составляют уникальный набор каждой ГТФазы из семейства Rho и хорошо иллюстрируют функции, выполняемые белком в клетке. Учитывая высокую консервативность ортологов малых ГТФаз, найденных у L. variabilis, и наличие у них сайтов взаимодействия с регуляторами и основными эффекторами, можно предположить их полноценную функциональность. У L. variabilis было обнаружено гомолог серин-треониновой киназы ROCK (Rho-associated protein kinase) – ключевого регулятора актинового цитоскелета, активирующегося при связывании с RhoA. Эта киназа у позвоночных имеет следующие домены и мотивы: непосредственно каталитический домен, AGC-киназный С-терминальный домен, REM-1 (Rho эффекторный мотив-1), сайт связывания Rho и Rho-ассоциированный PH-домен (pleckstrin homology). Внутри последнего расположен сайт связывания форбола/диацилглицерола (далее PE-DAG). У найденных нами в транскриптоме L. variabilis последовательностей отсутствует REM-1 и иное местоположения PE-DAG. Для проведения филогенетического анализа мы использовали впервые идентифицированные нами последовательности, а также последовательности ROCK других представителей Porifera, а также представителей Cnidaria, Placozoa и Bilateria. У L. variabilis было обнаружено 2 паралога серин-треониновой киназы LIMK (Lim domain kinase), чья основная функция заключается в ингибировании белка кофилина и, соответственно, стабилизации структур, собранных из актиновых филаментов. У L. variabilis, как и у высших многоклеточных животных, LIMK имеют следующие домены: непосредственно каталитический домен, LIM домен, состоящий из двух цинковых пальцев (LIM-1 и LIM-2), связанных гидрофобным линкером, и PDZ домен, отвечающий за связывание мембранных рецепторных белков и компонентов цитоскелета. У LIMK достаточно необычная для серин-треониновой киназы доменная структура: каталитический домен киназы находится на C-конце последовательности, а LIM домены играют важную роль в регуляции каталитической активности киназы. Предсказанная у киназы L. variabilis доменная структура сохраняет эти необычные особенности, что свидетельствует о её высокой консервативности. Для проведения филогенетического анализа мы использовали впервые идентифицированные нами последовательности, а также последовательности ROCK других представителей Porifera, а также представителей Cnidaria и Bilateria. Доменная структура найденных нами гомологов киназ аналогична известной для высших многоклеточных животных, что позволяет предположить сходный функционал и роль в регуляции систем цитоскелета. У L. variabilis обнаружен представитель семейства минус-концевых белков, ассоциированных с микротрубочками (-TIPs), известный под разными названиями: Patronin, Nezha, CAMSAP (Akhmanova et. al 2015) c ключевым специфическим доменом CKK (Microtubule-binding calmodulin-regulated spectrin-associated, или CAMSAP) на С-конце последовательности. У L. variabilis обнаружен представитель семейства плюс-концевых белков, ассоциированных с микротрубочками (+TIPs) – CKAP5 (cytoskeleton-associated protein 5). CKAP5 защищает микротрубочки кинетохора от деполимеризации белком из семейства кинезинов-13 MCAK (mitotic centromere-associated kinesin), который также был нами найден. CKAP5 также играет важную роль в сборке центросомальных микротрубочек. Мы установили его филогенетическое положение и доменную структуру, что позволяет нам говорить о его полной функциональности. У L. variabilis обнаружены представители семейства severing proteins (3 паралога katanin, один spastin и один fidgetin), проведён филогенетический анализ (, топология деревьев, полученных разными методами (Максимальное правдоподобие и Байесовский анализ), не отличалась. При поиске белков промежуточных филаментов использовали следующие белки: кислые и основные кератины I и II типов, десмин, глиальный кислый фибриллярный белок (GFAP), периферин, виментин, интернексин, синкоилин, ламины А/С и В, и легкие цепи нейрофиламентов. В результате у губок L. variabilis и H. dujardinii было обнаружено по два белка, имеющих характерные домены — домен IF rod (intermediate filament, Pfam:PF00038) и LTD (lamin tail domain, Pfam:PF00932). Лишь один белок из двух у каждого вида имел сигнал ядерной локализации (NLS; contig 3546 у H. dujardinii и contig 5696 у L. variabilis); именно его мы предположили в качестве функционального гомолога ядерного ламина. Второй белок в паре, вероятно, имеет цитоплазматическую локализацию (contig 1264 у H. dujardinii и contig 18 у L. variabilis). Для проведения филогенетического анализа мы использовали эти впервые идентифицированные последовательности, а также последовательности ламинов Bilateria и белков промежуточных филаментов Caenorhabditis elegans из NCBI, белки промежуточных филаментов стрекающих (nematocilin и cytovec), белки нейрофиламентов головоного моллюска Doryteuthis pealeii. Кроме того, с помощью BLAST мы обнаружили подобные белки в доступных транскриптомах губок Amphimedon queenslandica и Ephydatia muelleri, и доступном нам транскриптоме голожаберного моллюска Onchidoris muricata. Топология деревьев, полученных разными методами, не отличалась. На филодендрограмме все настоящие ламины билатерально симметричных животных, в т.ч. идентифицированный впервые ламин моллюска Onchidoris и описанный ранее преламин А/С гидры, формируют кладу. Сестринскую по отношению к ней кладу формируют белки губок, белки промежуточных филаментов книдарий, а также ламиноподобный белок асцидии Ciona. Оба белка Amphimedon несут NLS, тогда как оба белка Ephydatia его лишены. В эту кладу входят оба белка Halisarca (с NLS и без него), и только один белок Leucosolenia (с NLS). Ephydatia – одна из единичных губок, у которых собран геном со скаффолдами околохромосомного размера, поэтому мы полагаем, что отсутствие NLS в её белках обусловлено несовершенством методов предсказания, либо высоким уровнем дивергенции последовательностей. Присутствие же белков стрекающих как в кладе с истинными ламинами, так и в смешанной кладе Porifera+Cnidaria, вероятно, вызвано дивергенцией последовательностей стрекающих. Так, паралоги ламиноподобных белков могли приобрести специализацию – один белок сохранял NLS и оставался в составе ядерной ламины, а второй утрачивал NLS и выполнял функции промежуточных филаментов. У стрекающих этот процесс привёл к появлению белков cytovec и nematocilin, не входящих в кладу ламинов (Hwang et al. 2008; Zimek et al. 2012). Третья клада включает белки настоящих промежуточных филаментов, наиболее полно описанные среди беспозвоночных для C. elegans, нейрофиламенты модельного объекта нейробиологии – кальмара D. pealeii, впервые обнаруженный белок O. muricata и один из ламиноподобных белков губки L. Variabilis. Все они лишены NLS. Ранее, в связи с недостаточным числом последовательностей губок, не удавалось разрешить их положение (Kollmar 2015). До настоящего времени белок contig 18 не был нами обнаружен, т.к. BLAST выполнялся против сборки, полученной на материале взрослой интактной губки. Сейчас мы обнаружили ряд ламиноподобных белков в транскриптоме, собранном на материале регенератов разных стадий L. variabilis. Количественные данные по экспрессии показывают, что ламин (contig 5696) экспрессируется у интактной губки и в ходе регенерации, тогда как ламиноподобный белок без NLS (contig 18) – только в ходе регенерации. Ещё не менее 5 генов ламиноподобных белков проявляют такой паттерн экспрессии – экспрессируются при регенерации, но не у интактного животного, однако уровни экспрессии их значительно ниже (несколько ТРМ (transcript per million), тогда как описываемые 2 гена экспрессируются вплоть до 150 ТРМ). Мы полагаем логичным следующее объяснение этого явления. Ламин (contig 5696) относится к генам «домашнего хозяйства» и экспрессируется в норме постоянно. Ламиноподобный белок, не имеющий NLS (contig 18), экспрессируется в морфогенезах, принимает участие в формировании статичной части цитоскелета и далее не экспрессируется, пока не возникает необходимости в перемещении каких-то клеток, как это происходит в регенерации. Такая система статичного цитоскелета из промежуточных филаментов описана у тихиходок (Hering et al. 2016). На уровне первичной структуры идентифицированные у губок белки демонстрируют высокий уровень сходства с ламинами и белками промежуточных филаментов Bilateria. Моделирование вторичной и третичной структур белка с помощью Jpred4 и Phyre2 показало наличие у обоих белков L. variabilis двух структурных доменов – альфа-спирали coiled-coil, соответствующей домену IF rod, а также С-концевому иммуноглобулин-подобному глобулярному домену, состоящему из бета-складок. Этот С-концевой домен совпадает по локализации с LTD (lamin terminal domain). Домен IF rod промежуточных филаментов и ламинов содержит гептамерные повторы аминокислот, которые обеспечивают конформацию суперскрученной спирали; IF rod состоит из трёх частей (1А, 1В и 2), соединённых короткими линкерами (Herrmann, Aebi 2016). Притом для ламинов характерно присутствие в сегменте 1В шести дополнительных гептамеров, т.е. IF rod ламинов на 42 ак. остатка длиннее. У обоих белков L. variabilis мы наблюдали 1В сегмент домена IF rod длиной около 160 ак. остатков, т.е. характерный скорее для ламинов, нежели для промежуточных филаментов (около 120 ак. остатков). На основании этого мы полагаем, что среди губок как минимум у L. variabilis один из паралогов ламиноподобных белков участвует в формировании цитоплазматического скелета клетки. Любопытно, что такое изменение функции предполагается у представителя класса Calcarea, тогда как у губок из класса Demospongiae все паралоги ламиноподобных белков лежат внутри клады Porifera+Cnidaria. 2) Структура систем актиновых филаментов и микротрубочек в основных типах клеток интактных тканей L. Variabilis Актиновый цитоскелет Интактные экзопинакоциты имеют Т-образную форму и состоят из погружённого в мезохил тела клетки и наружной цитоплазматической пластинки. Актиновый цитоскелет в экзопинакоцитах представлен кортикальной сетью актина, которая выявляется по границам как клеточного тела, так цитоплазматической пластинки, а также актином в составе филоподий. Морфологические параметры были измерены отдельно для клеточных тел и цитоплазматических пластинок экзопинакоцитов. Тела имеют площадь 67,01 ± 1,941 мкм2 (n = 73), низкую округлость (0,1284 ± 0,008, n = 67) и низкую вытянутость (1,547 ± 0,037, n = 67). Цитоплазматические пластинки имеют значительную площадь (199,6±5,188 мкм2, n=266), относительно высокое значение округлости (0,6745±0,006, n=268) и низкую вытянутость (1,514 ± 0,019, n = 256). Такие значения позволяют предположить, что в интактной стенке тела экзопинакодерма не проявляет миграторной активности и представляет собой стабильный клеточный пласт. Хоаноциты представляют собой плотно упакованные призматические клетки с воротником микроворсинок и жгутиком на апикальной стороне. Актиновые структуры в хоаноцитах представлены кортикальной сетью актина и актином в составе микроворсинок и коротких филоподий. Эти клетки имеют небольшую площадь 29,74±0,5146 мкм2 (n=131) и в поперечном сечении являются практически круглыми: значение округлости составляет 0,9071±0,0042 (n=131), а вытянутости – 1,177±0,0083 (n=129). Пороциты, формирующие остии, представляют собой цилиндрические клетки со сквозным каналом. Клетку можно разделить на клеточное тело, несущее ядро, и каналобразующий вырост клетки, который формируют собственно остию и представляет собой тонкий слой цитоплазмы. Клеточное тело с ядром слегка выдаётся в мезохил. Актиновый цитоскелет в пороцитах представлен кортикальной сетью актина, а также актиновыми пучками в составе коротких многочисленных филоподий. Клетки мезохила являются гетерогенной популяцией. Они различаются по морфологии и, вероятно, по функциям. С помощью иммуноцитохимии мы смогли различить три типа клеток – крупные амёбоидные клетки, склероциты и гранулярные клетки. Крупные амёбоидные клетки имеют овальное ядро и очень длинные ветвящиеся цитоплазматические отростки. После окраски этих клеток антителами к цитоплазматической изоформе β-актину они демонстрируют гомогенную яркую флуоресценцию всей цитоплазмы. Крупные амёбоидные клетки имеют площадь 224,8±16,78 мкм2 (n=19), очень низкое значение округлости (0,0816±0,0122, n=19), обусловленное ветвящимися отростками, и относительное невысокое значение вытянутости (1,837±0,09, n=19), что указывает на то, что многочисленные выросты клетки направлены скорее во все стороны, чем в одном выбранном направлении. Склероциты имеют веретенообразную форму, очерчены кортикальным актином и часто имеют немногочисленные филоподии с пучками актиновых филаментов. Некоторые склероциты имеют стресс-фибриллы, направленные вдоль главной оси клетки. Склероциты характеризуются площадью 113,9±4,275 мкм2 (n=99), низким значением округлости (0,3048±0,0112, n=99) и высоким значение вытянутости (3,019±0,0933, n=99). Гранулярные клетки встречаются в основном у особей, собранных в осенний и зимний периоды. Это клетки промежуточного размера, с маленькими ядром, вся цитоплазма которых занята гранулами с равномерной интенсивной флуоресценцией. Актин в этих клетках представлен кортикальными пучками филаментов. Гранулярные клетки имеют площадь 84,85±7,751 мкм2 (n=6), относительно высокое значение округлости – 0,6597±0,05 (n=6) и значение вытянутости, указывающее на малую вытянутость клетки – 1,555±0,071 (n=6). Микротрубочки Окраска антителами к α-тубулину позволяет выявить плотную сеть микротрубочек во всех клетках интактных тканей L. variabilis. Большинство клеток имеет центросомальную (радиальную) организацию сети с единственным центром организации микротрубочек (ЦОМТ). Хоаноциты, вероятно, имеют не-центросомальную сеть микротрубочек. В пороцитах ЦОМТ лежит с стороны ядра, обращённой к полости остии, микротрубочки расходятся от него радиально, в верхнюю и нижнюю части клетки. У некоторых пороцитов есть меньшие фокусы схождения микротрубочек с внешней, обращённой к другим клеткам стороны ядра. У склероцитов единичные ЦОМТы расположены с одного из узких концов овальных ядер. От него в обе стороны по направлению главной оси клетки расходятся пучки микротрубочек, часто изогнутые и пересекающиеся, а не параллельные друг другу. В крупных амёбоидных клетках микротрубочки образуют плотную сеть около ядра, расходящуюся радиально. После исследования общей структуры сети микротрубочек мы впервые оценили наличие и распределение в этой сети пост-трансляционных модификаций α-тубулина: тирозинированный α-тубулин, детирозинированный α-тубулин и ацетилированный α-тубулин. Тирозинированный α-тубулин является доминирующей формой в клетках L. variabilis: выявляемая с помощью антитела к тирозинированному α -тубулину сеть микротрубочек качественно не отличается от сети, выявляемой антителами к общему α-тубулину. Антитела к детирозинированному α-тубулину выявляют активную центросому в экзопинакоцитах. Центросома лежит в околоядерной области. В ходе митоза у экзопинакоцитов центросома удваивается и лежит на каждом из полюсов веретена деления. Наличие активной центросомы в экзопинакоцитах свидетельствует о необходимости роста новых микротрубочек, необходимых для внутриклеточного транспорта и поддержания полярности клетки. Кроме того, антитела к детирозинированному α-тубулину позволили обнаружить ещё один тип клеток мезохила: мелкие округлые клетки (изредка они имеют цитоплазматические выросты, куда заходят пучки микротрубочек) с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Они лежат в непосредственной близости от базальных частей хоаноцитов, и вся сеть микротрубочек в этих клетках построена из детирозинированного α-тубулина. При этом в этих клетках не удаётся обнаружить единого ЦОМТа, и сеть микротрубочек имеет несколько фокусов схождения. Использование антител к ацетилированному α-тубулину показало, что этой пост-трансляционной модификацией богаты аксонемы жгутиков хоаноцитов и веретена деления митотических хоаноцитов (вероятно, это справедливо и для других типов клеток, но поскольку их митозы редки, они не были обнаружены на наших препаратах). Также в небольшом количестве хоаноцитов вся сеть микротрубочек построена из ацетилированного альфа-тубулина. Такие хоаноциты обычно лежат парами и, вероятно, представляют собой дочерние клетки только что закончившие митоз и использовавшие микротрубочки веретена деления для построения своего цитоскелета. В рамках отработки и модификации метода под наш объект все использованные в иммуноцитохимических окрасках антитела были проверены на специфичность с помощью вестерн-блотинга. На мембранах выявляются бэнды с предсказанным весом (~42 кДа для β-актина и ~55 кДа для α-тубулина и антител к его модифицированным формам). Однако, для количественных исследований, метод требует дальнейшей доработки, в первую очередь в том, что касается состава лизирующего буфера. 3) Перестройка систем актиновых филаментов и микротрубочек в основных типах клеток при регенерации стенки тела L. Variabilis Кольцевидные фрагменты тела губки, полученные после операции, имеют две раневые зоны, расположенные в плоскостях среза. Процесс регенерации приводит к формированию новых стенок тела, которые закрывают раневые отверстия и располагаются перпендикулярно неповреждённым стенкам кольца. Регенерация колец происходит сходно с регенерацией стенки тела при удалении ее небольшого фрагмента (Lavrov et al. 2018; Ereskovsky et al. 2021). Центральным событием является формирование временной структуры – регенеративной мембраны (РМ). РМ появляется примерно через 12-24 часа после операции (чпо) на краю раны и постепенно растёт в направлении к центру. Анализ фильмов, полученных методом time-lapse съёмок показывает, что процесс роста РМ является нелинейным и сопровождается флуктуациями. По крайне мере частично флуктуации объясняются тем, что во время роста лидирующий край РМ находится под натяжением и периодически рвётся, что приводит к временному уменьшению площади РМ. В процессе роста РМ имеет толщину 10-15 мкм и состоит из трёх слоёв: наружной экзопинакодермы, внутренней эндопинакодермы и очень узкого слоя мезохила между ними. Как было показано ранее, эндопинакоциты РМ появляются путём трансдифференцировки хоаноцитов в области раны (Lavrov et al. 2018; Ereskovsky et al. 2021). Контакты экзо- и эндопинакоцитов на растущем крае РМ изолируют мезохил от внешней среды. Полная РМ, закрывающая раневое отверстие, обычно формируется к ~48 чпо. Однако уже к ~24-30 чпо начинается трансформация РМ в стенку тела. Этот процесс включает в себя: 1) замещение эндопинакоцитов хоаноцитами на внутренней стороне РМ, 2) появление пороцитов, пронизывающих РМ, 3) синтез новых спикул в мезохиле РМ. Все эти процессы начинаются в периферической части РМ и постепенно распространяются к её центру. Преобразование РМ в стенку тела заканчивается к 72 чпо. Экзопинакоциты РМ имеют уплощенную полигональную форму и возникают из интактных Т-образных экзопинакоцитов путём их уплощения. Актиновый цитоскелет в экзопинакоцитах РМ представлен кортикальной сетью филаментов. Внутренний слой РМ представлен плоскими полигональными эндопинакоцитами. Эти клетки происходят из хоаноцитов, которые уплощаются и теряют воротничок микроворсинок и жгутик. Актиновый цитоскелет в этих клетках представлен кортикальной сетью филаментов. В ходе трансформации РМ в интактную стенку дела эндопинакоциты на её внутренней стороне редифференцируются в хоаноциты. Редифференцирующиеся хоаноциты имеют подушкообразную форму и восстанавливают воротничок микроворсинок и жгутик. Актиновый цитоскелет в хоаноцитах представлен кортикальной сетью филаментов и коровыми пучками в микроворсинках. Изменения морфологии клеток клеток, сопровождающие рост РМ, приводят и к перестройкам сети микротрубочек. При трансформации экзопинакоцитов сложноорганизованная в пространстве сеть микротрубочек у Т-образных клеток преобразуется в радиальную сеть из извилистых пучков, которые расходятся от единственного ЦОМТа, расположенного рядом с ядром. При трансдифференцировке хоаноцитов в эндопинакоциты происходит смена не-центросомальной организации сети микротрубочек (которая состояла из параллельных пучков, направленных от базальной к апикальной части клетки) на центросомальную радиальную сеть с единым ЦОМТом около ядра эндопинакоцита. Пост-трансляционных модификаций α-тубулина в сети микротрубочек у клеток РМ обнаружено не было. Поскольку изменение формы клеток экзопинакодермы и хоанодермы, вероятно, вносят основной вклад в процесс регенерации, мы оценили изменения их морфологических параметров. Нам удалось показать, что изменение формы этих клеток при формировании и трансформации РМ отражается в статистически значимом изменении их морфологических параметров. При уплощении экзопинакоцитов их площадь значимо увеличивается до 231,2±6,367 мкм2 (n=196; p=0,0001), округлость снижается до 0,6286±0,0081 (n=196; p<0,0001), вытянутость увеличивается до 1,587±0,027 (n=196; p<0,05). Такое изменение морфологических параметров указывает на повышение миграторного потенциала клеток, что, вероятно, говорит о переходе экзопинакодермы к коллективному направленному движению. Трансдифференцировка хоаноцитов в эндопинакоциты сопровождается значимыми изменениями всех морфологических параметров клетки: площадь возрастает до 89,63±7,535 мкм2 (n=50; p<0,0001), округлость снижается до 0,6499±0,0189 (n=52; p<0,0001), вытянутость повышается до 1,56±0,0493 (n=51; p<0,0001). Редифференцирующиеся хоаноциты имеют морфологические параметры, отличающиеся как от интактных хоаноцитов, так и от эндопинакоцитов РМ: площадь 62,04±0,8904 мкм2 (n=285), округлость 0,881±0,0023 (n=245) и вытянутость 1,226±0,0086 (n=276). Очевидно, что и в этом случае трансдифференцирующиеся хоаноциты приобретают больший миграторный потенциал и способность к направленному движению. Кроме того, на лидирующем крае РМ клетки формируют мощный актиновый кабель. С ним ассоциирован немышечный миозин II типа, который имеет прерывистый паттерн распределения, что указывает на возможную сократительную активность. Это позволяет предположить, что в росте РМ у L. variabilis может принимать участие сократимый актомиозиновый кабель. Разрывы лидирующего края РМ при её росте демонстрируют, что актомиозиновый кабель действительно сокращается, натягивая РМ. Сокращение кабеля, возможно, является основной силой, приводящей к уплощению клеток и росту мембраны, или же его сокращение играет лишь координирующую роль, указывая клеткам направление уплощения. Сходный механизм («purse-string») описан при регенерации ран у эмбрионов высших многоклеточных животных (Brock et al. 1996; Martin et al. 1992) 4) Оценка экспрессии белков-регуляторов актинового цитоскелета в интактных тканях (H. dujardinii и L. variabilis) и в ходе репаративной регенерации L. Variabilis 4.1) Оценка экспрессии белков-регуляторов актинового цитоскелета в интактных тканях H. dujardinii и L. Variabilis В результате поставленных ПЦР-РВ и дальнейшей обработки результатов мы получили данные относительной нормализованной (по гену ACTG1) экспрессии генов, вовлечённых в регуляцию актинового цитоскелета в интактных тканях двух видов губок – известковой L. variabilis и обыкновенной H. dujardinii. В целом, для L. variabilis характерен меньший разброс значений в выборке, чем для H. dujardinii. Наибольший разброс в выборке для особей L. variabilis был показан для гена малой ГТФазы Rac1 (разница более чем в 4 раза), наименьший – для малой ГТФазы cdc42 (разница менее чем в 2 раза). Для H. dujardinii наибольший разброс в выборке соответствует гену серин-треониновой киназы ROCK (более чем в 10 раз), наименьший – гену малой ГТФазы Rho (менее чем в 1.5 раза). Экспрессия найденных генов Rho, ROCK и LIMK у особей двух видов статистически достоверно различается (непараметрический двусторонний U-критерий Манна-Уитни). Экспрессия гена Rho у L. variabilis составляет 1.961± 0.255; у H. dujardinii – 0.91±0.053 (p=0.008). Для гена ROCK экспрессия в губке L. variabilis составила 10.75±1.664; в H. dujardinii – 0.061±0.014 (p=0.008). Ген LIMK у L. variabilis имеет относительную нормализованную экспрессию 4.604±0.919; у H. dujardinii – 1.071±0.073 (p=0.008). Для Rac1 и cdc42 различия в экспрессии между двумя видами губок статистически не достоверны. 4.2) Оценка экспрессии белков-регуляторов актинового цитоскелета ходе репаративного морфогенеза L. Variabilis В результате поставленных ПЦР-РВ и дальнейшей обработки результатов мы получили данные относительной нормализованной (по генам ACTG1 и GAPDH) экспрессии генов, вовлечённых в регуляцию актинового цитоскелета в интактных тканях и регенеративной мембране у известковой губки L. variabilis. В целом, для интактных тканей характерен меньший разброс значений в выборке, чем для проб с регенеративными мембранами. Наибольший разброс в выборке для интактных тканей был показан для гена малой ГТФазы Rho (разница в ~1.2 раза), наименьший – для гена регуляторной цепи миозина MLC9 (разница в 1.01 раза). Для проб с регенеративными мембранами наибольший разброс в выборке также соответствует гену малой ГТФазы Rho (более чем в 2 раза), наименьший – также гену регуляторной цепи миозина MLC9 (менее чем в 1.3 раза). Экспрессия генов Rho, ROCK, LIMK и MLC9 в интактных тканях и регенеративных мембранах статистически достоверно не различается (непараметрический двусторонний U-критерий Манна-Уитни). Экспрессия гена ROCK в интактных тканях составила 1.027±0.014; в регенеративных мембранах 1.518±0.18 (p=0.1). Для гена Rho экспрессия в интактных тканях составила 1.154±0.078; в регенеративных мембранах 1.967±0.466 (p=0.1). Ген LIMK в интактных тканях имеет относительную нормализованную экспрессию 1.157±0.082; а в регенеративных мембранах – 2.756±0.531 (p=0.2). И, наконец, экспрессия гена MLC9 в интактных тканях составила 1.07±0.06, а в регенеративных мембранах – 1.034±0.086 (p>0.999). Отсутствие статистически достоверных различий в экспрессии между интактными губками и образцами с регенеративной мембраной могут быть связаны с двумя причинами. Первая причина: возможно, изменения в экспрессии элементов сигнального каскада Rho/ROCK происходят не на уровне мРНК, а на уровне белка. Например, увеличивается количество фосфорилированных киназы ROCK и регуляторной цепи немышечного миозина II типа MLC9, а не величина экспрессии их генов в клетке. Проверить такое предположение в будущем позволит метод вестерн-блотинга. Вторая же возможная причина – особенности пробоподготовки, так как существует вероятность, что масса клеток, не затронутых регенеративным процессом в стенках кольцевидного фрагмента, значительно превышает ту, что составляет регенеративную мембрану, что, соответственно, мешает пусть и достаточно чувствительному методу ПРЦ-РВ выявить статистически достоверные различия. Для определения верной из двух выше озвученных причин требуются дальнейшие эксперименты, с адаптированной методикой сбора проб и использованием иных молекулярных методов (дифференциальная экспрессия, вестерн-блотинг). 5) Эксперименты по функциональному анализу роли систем цитоскелета при регенерации стенки тела L. variabilis Ингибиторы полимеризации актина В серии предварительных экспериментов были определение эффективные концентрации ингибиторов полимеризации актина - латрункулина B и цитохалазина D. Клетки L. variavilis оказались не чувствительны к действию цитохалазина D: ни одна из использованных концентраций цитохалазина D (максимальная – 20 мкМ) не оказала влияние на процесс регенерации L. variabilis. От дальнейшего повышения концентраций решено было отказаться, поскольку неспецифические эффекты столь высокой дозы могут оказывать влияние на получаемые результаты. Для латрункулина B минимальная эффективная концентрация составила 100 нМ. Под действием 100 нМ латрункулина B неполная регенеративная мембрана быстро разбирается, в поле зрения остаётся лишь поперечный вид стенки тела, с ошаренными хоаноцитами, бьющими жгутиками. На протяжении всего времени инкубации (300 минут) образование регенеративной мембраны не происходит. В большинстве случае действие латрункулина B не приводит к нарушению строения регенеративной мембраны. Лишь изредка, вероятно, в местах максимального натяжения, в регенеративной мембране может появляется одно или несколько отверстий, постепенно увеличивающихся в размерах. Рост размера отверстий может привести к полной разборке регенеративной мембраны, оставляя всю раневую поверхность незакрытой, биение жгутиков хоаноцитов продолжается. При иммуноцитохимических окрасках было показано, что воздействие латрункулина B приводит к 1) появлению разрывов между пинакоцитами, которые сохраняют лишь точечные контакты друг с другом, 2) ошариванию клеток мезохила и утрате ими филоподий. Нарушений в структуре кортикального актина обнаружено не было. Нарушений в строении сети микротрубочек после воздействия латрункулина B также обнаружено не было. Ингибиторы полимеризации микротрубочек В серии предварительных экспериментов была определена эффективная концентрация ингибитора полимеризации микротрубочек – нокодазола. Она составила 4 мкМ. Неполная регенеративная мембрана разбирается под воздействием нокодазола, однако, имеется значительный лаг-период, в отличие от инкубации в латрункулине В. Клетки мезохила в регенеративной мембране мигрируют; нарушений в структурах, отвечающих за движение, не замечено. В полной регенеративной мембране под воздействием нокодазола происходит формирование отверстий, границы которых образованы вытянутыми веретеновидными клетками. Однако эти отверстия не увеличиваются в размерах, и регенеративная мембрана никогда не разбиралась полностью под действием нокодазола. Помимо отверстий инкубация в нокодазоле вызывает изменения в строении хоанодермы, как редифференцирующейся хоанодермы регенеративной мембраны, так и хоанодермы интактной стенки кольцевидного фрагмента. В обоих случаях в хоанодерме появляются разрывы, которые в случае интактной стенки тела четко ассоциированы с увеличенными в размерах остиями пороцитов. При иммуноцитохимических окрасках было показано, что в клетках значительно нарушена структура сети микротрубочек: сохраняется небольшое количество коротких пучков микротрубочек, сконцентрированных вокруг ЦОМТа; остальные пучки, вероятно, подвергаются деполимеризации. Деполимеризованный тубулин сохраняется в цитоплазме клеток, которая приобретает более интенсивную окраску по сравнению с контрольными образцами. Нарушений в строении актиновых филаментов после воздействия нокодазола обнаружено не было. Также была предпринята попытка оценить влияние подавления динамической нестабильности микротрубочек на процесс регенерации L. variabilis. Для подавления динамической нестабильности микротрубочек использовали сочетание 100 нМ нокодазола и 50 нМ таксола (Tvorogova et al. 2018). Неполная РМ под воздействием смеси нокодазола и таксола может как продолжить свой рост, так и остановиться. Мы предполагаем, что это связано с фазой процесса – на ранних стадиях, когда РМ представляет собой тонкий ободок по периферии раны, ингибиторы препятствуют ее росту, а на более поздних стадиях наличие ингибиторов никак не отражается на процессе закрытия раны. В полной РМ смесь нокодазола и таксола никак не влияет на процесс регенерации, клетки мезохила также сохраняют свою подвижность, идёт спикулогенез. При иммуноцитохимических окрасках было показано, что смесь нокодазола и таксола вызывает в клетках L. variabilis деполимеризацию микротрубочек, а не подавление их динамической нестабильности: в клетках сохраняется небольшое количество коротких пучков микротрубочек, сконцентрированных вокруг ЦОМТа; остальные пучки, вероятно, подвергаются деполимеризации. Как и в случае с 4 мкМ нокодазола цитоплазма клеток имела более яркую окраску по сравнению с контрольными образцами, что может свидетельствовать об увеличении количества димеров αβ-тубулина. Нарушений в строении актиновых филаментов после воздействия смеси нокодазола и таксола обнаружено не было. Модуляторы активности малой ГТФазы Rho В серии предварительных экспериментов определялись эффективные концентрации активатора RhoA (0.5 мкг/мл, 1.0 мкг/мл и 2.0 мкг/мл для Rho-activator, CN03) и ингибитора RhoA (1 мкг/мл, 4 мкг/мл и 8 мкг/мл для Rho-inhibitor, CT04). Тестируемые концентрации веществ не оказывали значительного влияния на морфологию клеток стенки тела губки и скорость процессов регенерации. Однако иммуноцитохимические исследования показали, что оба вещества в концентрациях (кроме 0.5 мкг/мл для Rho-activator) вызывают значительные изменения в морфологии клеток. В мезохиле появляется большое количество пальцевидных фрагментов. Мы интерпретируем это как неспецифическое действие данных веществ. Rho-activator в концентрации 0.5 мкг/мл не оказывал какого-либо воздействие на морфологию клеток. Учитывая данные предварительных экспериментов, основная серия экспериментов не проводилась. 6) Визуализация систем цитоскелета в тканях Halisarca dujardinii В отличии от L. variabilis для H. dujardinii удалось получить лишь крайне ограниченные данные по строению систем цитоскелета. Это связано с трудностями, которые возникли с иммуноцитохимическими окрасками на этом виде. Мы считаем, что проблемы с визуализацией связаны с большим количеством фибриллярного внеклеточного матрикса в мезохиле этого вида, а также с слизью, которая покрывает поверхность губки. Внеклеточный матрикс и слизь могут препятствовать проникновению в ткани и клетки антител. В ходе попыток визуализации систем цитоскелета нами были испробованы не только разные типы фиксаторов (2.5% глутаровый альдегид на 1хPBS; 4% параформальдегид на 1хPBS; ледяной метанол; префиксация ледяным метанолом с последующей фиксацией 4% параформальдегидом на 1хPBS), но разные способы подготовки губок к фиксации, а также разные модификации последующей пробоподготовки. Были попытки короткое время инкубировать губок в растворе L-цистеина и коллагеназы II до фиксации. В качестве модификаций основной пробоподготовки пытались: (1) окрашивать тонкие (менее 1 мм) срезы тканей, (2) добавлять 1-10% DMSO в растворы при пробоподготовке, (3) просветлять ткани с помощью метода Murray Clear. Эти модификации протокола применялись после разных типов фиксации и на разных стадиях жизненного цикла губки. Но, к сожалению, ни один из них не дал удовлетворительного результата: в наиболее успешных случаях окраска присутствовала в области толщиной 20-30 мкм под поверхностью губки. Такая окраска не позволяла исследовать цитоскелет в большинстве типов клеток H. dujardinii. |
Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".