Пролиферация и апоптоз как механизмы поддержания гомеостаза тканей губокНИР

Proliferation and apoptosis as mechanisms for maintaining tissue homeostasis in sponges

Соисполнители НИР

МГУ Координатор

Источник финансирования НИР

грант Президента РФ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2021 г.-31 декабря 2021 г. Пролиферация и апоптоз как механизмы поддержания гомеостаза тканей губок
Результаты этапа: 1. Выявление основной популяции пролиферирующих клеток и оценка уровня пролиферации в интактных тканях Halisarca dujardinii и Leucosolenia variabilis Для исследования пролиферации в интактных тканях губок H. dujardinii и L. variabilis была адаптирована иммуноцитохимическая окраска с использованием меченых нуклеотидов EdU (маркер клеток в S-фазе) и антител к фосфорилированному гистону 3 (рН3, маркер клеток в G2/M фазах). Живых губок держали в 5 мл чашках Петри с фильтрованной морской водой и мечеными нуклеотидами; оптимальные концентрации и сроки инкубации в EdU (12 ч в 200 мкМ растворе для H. dujardinii и 6 ч в 20 мкМ растворе для L. variabilis) были выяснены в процессе подготовки. После инкубации, объекты (8 особей H. dujardinii и 6 особей L. variabilis) фиксировали 4% раствором параформальдегида (PFA) в фосфатном буфере (PBS) в течение 12 часов. Далее, объекты отмывали в PBS и пермеабилизовывали блокирующим раствором в течение 1,5 часов. Визуализация встроенных в ядра меченых нуклеотидов проводилась с помощью клик-реакции в растворе, содержащем 4 мМ CuSO4, 10 мкМ Lumiprobe Sulfo-Cyanine3 Azide и 20 мг/мл L-аскорбата натрия. После клик-реакции, объекты инкубировали в блокирующем растворе и окрашивали первичными антителами к фосфорилированному гистону (Sigma-Aldrich H0412) и ацетилированному альфа-тубулину (Sigma-Aldrich T6793). После отмывки от первичных антител блокирующим раствором, объекты инкубировали в растворе вторичных антител. Ядра визуализировали с помощью окраски DAPI. После окраски, объекты отмывали в PBS и помещали в 90% глицерин для изучения на конфокальном микроскопе Nikon A1 (Nikon, Япония). В процессе микроскопии особое внимание уделялось съемке различных участков тела объектов. У H. dujardinii, активность пролиферации была исследована в трех участках тела: в оскулярной трубке, участках эндосомы рядом с оскулярной трубкой и участках эндосомы на расстоянии от оскулярных трубок. С каждого препарата получали по одному Z-стэку с шагом 1 мкм и средней толщиной 48 мкм. Всего было получено 4 Z-стэка оскулярных трубок, 8 Z-стэков эндосомы рядом с оскулярной трубкой и еще 8 Z-стэков эндосомы на расстоянии от оскулярной трубки. В случае L. variabilis, мы исследовали пролиферацию в семи участках тела: в оскулярном кольце (10 Z-стэков), в дистальной (10 Z-стэков), средней (10 Z-стэков) и проксимальной (10 Z-стэков) частях оскулярной трубки, в дистальных (14 Z-стэков) и проксимальных (14 Z-стэков) частях дивертикулов, в трубках кормуса (11 Z-стэков). Был разработан метод полуавтоматического подсчета клеток в ПО Bitplane Imaris v7.2.1. Подсчет производился инструментом «Spots», который в зависимости от предполагаемого диаметра и интенсивности сигнала самостоятельно выделяет объекты по предварительно выставленному фильтру. Выбранный диаметр объектов составлял 4 мкм; подсчет производился со включенной настройкой «Background substitution»; в качестве фильтра использовался параметр «Quality», учитывающий размер объекта и интенсивность сигнала от него. Фильтр выставлялся таким образом, чтобы оказались выделены самые бледные ядра. Яркие, но не специфичные сигналы, которые отмечались при таких настройках, удалялись вручную. Отдельно производился подсчет хоаноцитов: сперва строилась поверхность («Surface») вокруг хоаноцитных камер/хоанодермы, затем анализируемый канал дублировался внутри этой поверхности. Таким образом, отсекались все сигналы от клеток мезохила. В H. dujardinii, поверхность строилась вручную; в случае L. variabilis поверхность строилась автоматически по окраске жгутиков хоаноцитов. После подсчета, полученные параметры (доля EdU-положительных клеток, доля рН3-положительных клеток и т.д.) подвергались статистической обработке: высчитывались средние значения и стандартные отклонения и сравнивались непараметрическим тестом Краскела-Уоллеса с последующими попарными сравнениями тестом Данна. Ткани обоих видов содержат значительное количество пролиферирующих клеток (Рис.1, А-С; Рис. 3, А-Н). Так, общая доля EdU-положительных клеток у H. dujardinii составляет 8,18±1,57% в участках эндосомы на расстоянии от оскулярной трубки (Рис. 2, А). Синтезирующие ДНК клетки присутствуют как среди хоаноцитов, так и в мезохиле. Доля меченых EdU хоаноцитов составила 7,52±1,45% от всех клеток и 13,34±1,31% от всех хоаноцитов. Содержащие EdU ядра клеток мезохила составили 0,67±0,51% от общего числа клеток. Таким образом, синтез ДНК происходит преимущественно в хоаноцитах: от общего числа меченых клеток они составляют 92,08±6,11%. Общая доля меченых антителами к pH3 клеток составила 0,12±0,08%. Большая их часть (90,83±9,75% от всех pH3-положительных клеток) располагается в хоанодерме. Аналогичные параметры, полученные для участка эндосомы рядом с оскулярной трубкой, не демонстрируют статистически значимых отличий. Общий процент EdU-положительных клеток составил 8,26±2,91% (Рис. 2, А). Синтезирующие ДНК хоаноциты составляют 7,69±2,94% от всех клеток и 13,05±4,01% от всех хоаноцитов. Доля EdU-положительных клеток в мезохиле составила 0,57±0,46%. Меченые нуклеотиды преимущественно включались в ядра хоаноцитов: доля меченых хоаноцитов от всех EdU-положительных клеток достигает 91,44±8,48%. Общая доля меченых антителами к pH3 клеток составила 0,11±0,07%, из них 94,64±9,83% хоаноцитов. Оскулярная трубка отличается отсутствием хоаноцитов и низким уровнем пролиферации (Рис. 1, С). Общая доля EdU-положительных клеток в этой части тела составила 0,64±0,67%. Ни одной рН3-положительной клетки в этой части тела зарегистрировано не было (Рис. 2, А-D). Значительное количество пролиферирующих клеток также содержат ткани L. variabilis (Рис. 3, А-Н). Участки тела, содержащие развитую хоанодерму, демонстрируют высокую скорость пролиферации. В большинстве этих участков (трубках кормуса, проксимальной части дивертикул, различных участках оскулярных трубок) наблюдается одинаковое количество пролиферирующих клеток: около 10% EdU-положительных и 0,6% рН3-положительные клеток (Рис. 4, А-В). В дистальных отделах дивертикул доля pH3-положительных клеток остается прежней (0,50 ± 0,20%), в то время как доля EdU-положительных клеток снижается (6,53 ± 2,08%) (Рис. 4, А-В). Уменьшение количества EdU-положительных клеток статистически значимо по сравнению с дистальной и средней частями оскулярных трубок. В других попарных сравнениях различия не были значимыми, но p-значения слабо превышали 0,05. Наименьшая активность пролиферации наблюдается в оскулярном кольце, где непрерывный слой хоаноцитов, характерный для остальных участков тела, замещается эндопинакоцитами (Рис. 3, А). Окулярное кольцо содержит только 0,40 ± 0,96% EdU-положительных и 0,17 ± 0,20% pH3-положительных клеток (Рис. 4, А-В). Большинство EdU- и pH3-положительных клеток L. variabilis являются хоаноцитам (Рис. 3, А-Н). Однако некоторые из EdU-положительных и pH3-положительных клеток принадлежат к слою мезохила/пинакодермы. Доля хоаноцитов в общем количестве EdU-положительных клеток остается почти одинаковой (в среднем 95%) в разных частях оскулярной трубки, трубках кормуса и дивертикулах (Рис. 4, C-D). Что касается pH3-положительных клеток, хоаноциты составляют примерно 75% всех клеток в G2/M фазах. В дистальных частях дивертикул их доля уменьшается (40,64 ± 22,29%) (Рис. 4, C-D). Это различие значимо по сравнению с трубками кормуса, средней и проксимальной частями оскулярной трубки (p= 0,0023, 0,0003 и 0,0002 соответственно). Распределение клеток по фазам клеточного цикла оценивали по количественному окрашиванию ДНК суспензий отдельных клеток, полученных путем механической диссоциации в безкальциевой и безмагниевой морской воде (CMFSW-E: 20 мМ KCl, 300 мМ NaCl, 10 мМ Tris-HCl и 15 мМ EDTA в дистиллированной воде). Перед диссоциацией губки отделялись от субстрата, очищались от эпифауны и помещались в CMFSW-E на 20 минут при +10°С; далее их мацерировали в свежий раствор через газ с диаметром ячеи 30 мкм. В таком виде суспензии хранились при +10°С около 30 минут, затем их центрифугировали, сменяли раствор на свежий и ресуспендировали клетки. После этого, клетки центрифугировали и фиксировали в 70% этаноле при -20°С. В случае L. variabilis, этот способ получения суспензий был признан неэффективным, и суспензии получали из заранее зафиксированных в этаноле особей. Зафиксированные кусочки тканей отмывали CMFSW-E и продавливали через 30 мкм газ, затем несколько раз ресуспендируя в свежих порциях CMFSW-E. После получения суспензий, их переводили в PBS и отбирали аликвоты по 1,5 млн клеток в 200 мкл раствора. Полученные аликвоты проводили через 50 мкм фильтр для уменьшения количества агрегатов клеток и дебриса и окрашивали Hoechst 33342 и пропидий-йодидом (PI) в концентрации 1 мкг/мл. Суспензии анализировали с помощью клеточного сортера FACSAria III SORP (BD BioSciences, USA), используя лазеры 405 нм (для Hoechst 33342) и 488 нм (для PI). Пропидий-иодид предоставил лучшее качество кривой клеточного цикла, поэтому основной анализ проводился с использованием суспензий, окрашенных PI. Основная часть клеток H. dujardinii (38,94 ± 5,90%) образует диплоидный пик популяции клеток в G0/G1 фазах клеточного цикла (Рис. 5, А). Тетраплоидные клетки в G2/M фазах образуют менее различимый пик, характеризующийся 2-кратной интенсивностью флуоресценции в сравнении с G1/G0 клеткам. Популяция G2/M клеток содержала 9,28 ± 1,78% от всех клеток. Клетки в S-фазе располагаются между популяциями G0/G1 и G2/M и составляют 20,18 ± 6,14% от общей популяции. Популяция SubG1, отличающаяся более низким содержанием ДНК, чем G1/G0 клетки, содержит небольшие и сильно гранулированные объекты - возможно, умирающие клетки и дебрис. Сделанные в CMFSW-E суспензии L. variabilis не давали надежных данных, отличаясь большим количеством SubG1 клеток и незначительной долей G2/M клеток. Такие суспензии не демонстрировали достаточного разрешения для получения точной картины распределения по клеточному циклу, и в конечном итоге были исключены из дальнейшего анализа. Суспензии из предварительно зафиксированных тканей содержали меньше SubG1 клеток и демонстрировали хорошо различимые G0/G1 и G2/M пики (Рис. 5, В). По общему виду гистограмма была похожа на таковую в суспензиях H. dujardinii. Доля G0/G1 клеток составляла 53,88±2,59%, 12,58±0,76% для клеток в S-фазе и 4,63±1,79% для G2/M клеток. В совокупности с иммуноцитохимической окраской, распределение по клеточному циклу подтверждает факт постоянной пролиферации клеток в интактных тканях исследуемых губок. Проточная цитофлуориметрия дает большие значения доли пролиферирующих клеток – видимо, за счет клеток в G2 фазе, которые нельзя зарегистрировать на конфокальном микроскопе с используемым нами набором маркеров. В целом активность пролиферации, по-видимому, равномерно распределена по телу губок (за исключением областей, не содержащих хоаноцитов). Основное физиологическое значение пролиферации, по-видимому, заключается в возобновлении пищедобывающих структур путем пролиферации хоаноцитов. 2. Экологическая и физиологическая изменчивость активности пролиферации В процессе обработки материала мы столкнулись с проявлением определенной экологической и физиологической изменчивости пролиферации. Общая доля EdU- и рН3-положительных клеток в различные годы остается более или менее постоянной, однако наблюдается значительная вариация в значениях колокализации сигналов EdU и рН3. Среди рН3-положительных клеток могут встречаться клетки, несущие также метку EdU (Рис. 3, Н); такие клетки на момент начала инкубации находились в S-фазе, а к моменту фиксации дошли до М-фазы клеточного цикла. Таким образом, по степени колокализации сигналов рН3 и EdU можно судить о скорости прохождения клеток через G2 фазу. В особях H. dujardinii, исследованных в 2019 году, после 12 ч инкубации в EdU 10,7% рН3-положительных клеток содержали в своих ядрах EdU. В 2021 году после 12 ч инкубации в EdU колокализации сигналов не наблюдалось; первые рН3- и EdU-положительные клетки появились лишь на 13 часах инкубации в EdU. Аналогично с L. variabilis после 6 ч инкубации, в 2019 году степень колокализации достигала 60%; в 2020 и 2021 годах аналогичная инкубция дает единичные клетки с колокализацией сигналов. Таким образом, вероятнее всего, межсезонные изменения в активности пролиферации связаны не с изменением объема пролиферирующей популяции клеток, а с динамикой их клеточного цикла. У H. dujardinii были также отмечены вариации в активности пролиферации в зависимости от возраста животных. Более крупные губки (1-3 см в диаметре) содержали значительно большее количество EdU- и рН3-положительных клеток, чем мелкие (<1 см в диаметре) особи: 13,8±2,48 EdU- и 0,27±0,16 рН3-положительных клеток против 8,18±1,57% и 0,12±0,08%, соответственно. Предположительно, это связано с наличием у крупных особей более развитой водоносной системы, что приводит к более эффективной и быстрой фильтрации и, следовательно, большему притоку ресурсов и энергии. 3. Качественная и количественная оценка активности апоптотических процессов Тетраметилродамин-этанол (TMRE, ThermoFisher Scientific, T669) и CellEvent Caspase-3/7 Green ReadyProbes Reagent (ThermoFisher Scientific, R37111) (CellEvent) использовали в качестве маркеров апоптотической активности в исследованиях с использованием проточной цитофлуориметрии. В клетках млекопитающих, отсутствие флуоресценции TMRE служит признаком проницаемости внутренней мембраны митохондрий, что характерно для ранних стадий апоптоза. CellEvent - индикатор активности эффекторных каспаз, присутствующих в клетках на средней и поздней стадиях апоптоза. Живых губок (по три особи для каждого вида) инкубировали в 1 мл эппендорфах с фильтрованной морской водой и CellEvent в разведении 1:100, фиксируя через 2 часа в 4% PFA PBS. После этого, объекты готовили к конфокальной микроскопии по описанному для выявления пролиферации протоколу (исключая клик-реакцию и окрашивание антителами к pH3). Для каждой особи H. dujardinii снимали по 3 стэка эндосомы; для каждой особи L. variabilis снимали по одному Z-стэку средней части оскулярной трубки, трубок кормуса, дистальной и проксимальной частей дивертикул. Полученные Z-стэки обрабатывали в ПО Imaris и подсчитывали общее количество апоптотических клеток на стэк. Количество апоптотических клеток в интактных тканях обоих видов незначительно (Рис. 6, А-G). У H. dujardinii апоптотические клетки единичны. У L. variabilis ни в одном из участков тела доля апоптотических клеток не превышает 1%. Из нефиксированных суспензий H. dujardinii и L. variabilis были взяты образцы объемом 250 мл, содержащие по 1,5 млн клеток. Всего было получено 4 образца из 4 губок каждого вида. Суспензии были получены в безкальциевой и безмагниевой воде описанным выше способом. Образцы инкубировали в CellEvent (разведение 1: 100) при 10° С в течение 30 мин в темноте. Затем образцы центрифугировали, фиксировали 4% PFA PBS при 4° С и хранили в течение 2 месяцев. Перед анализом проточным цитофлуориметром клетки трижды промывали PBS. Все суспензии анализировали на приборе FACSAria SORP (BD Biosciences, США) с длиной волны возбуждающего лазера 488 нм. Любая клетка, превышающая автофлуоресценцию неокрашенного контроля, считалась CellEvent-положительной (апоптотической) клеткой. Клетки H. dujardinii образовывали один пик с низкой/отрицательной флуоресценцией CellEvent (Рис. 6, Н). Доля апоптотических клеток была низкой: CellEvent-положительные клетки составляли только 1 ± 1,15% от общей популяции. В суспензиях L. variabilis клетки были четко разделены на две субпопуляции по уровню флуоресценции CellEvent (Рис. 6, Н). CellEvent-положительные клетки с повышенной автофлуоресценцией составляли 60,8 ± 13,46%. Мы рассматриваем этот результат как артефакт пробоподготовки: скорее всего, диссоциация вызывает быстрый апоптотический ответ в клетках этого животного. Это наблюдение подтверждается также завышенной долей SubG1 клеток в окрашенных PI суспензиях L. variabilis, которые могут служить индикатором активности апоптотических процессов (Рис. 5, В). Таким образом, в случае L. variabilis полученные значения не отражают реальную долю клеток, подверженных запрограммированной клеточной смерти. Наблюдаемые различия в развитии апоптотического ответа у исследуемых видов могут быть связаны с филогенетическим положением и типом организации тела. Большая часть тела H. dujardinii (обыкновенной губки) занята мезенхимальной тканью, в то время как L. variabilis (известковая губка) в основном состоит из непрерывных слоев хоанодермы и пинакодермы. В целом, известковые губки демонстрируют более эпителиальную организацию, основанную на межклеточных взаимодействиях. Например, у обыкновенных губок регенерация происходит через образование бластемы и мезенхимальные морфогенезы, тогда как у известковых губок регенерация зависит от морфаллактической реорганизации прилегающей интактной ткани через эпителиальные морфогенезы. В таком случае, нарушение естественной системы клеточных взаимодействий во время диссоциации в CMFSW-E может приводить к резкому апоптотическому ответу у известковых губок. Нами также были проведены прижизненные исследования апоптоза в суспензиях. Нефиксированные суспензии анализировались как с помощью проточного цитофлуориметра (количественно), так и конфокальноо микроскопа (качественно). Суспензии получали в безкальциевой и безмагниевой воде описанным выше способом. Сначала, суспензии окрашивали TMRE (конечная концентрация - 100 мкМ), CellEvent (разведение 1: 100) и Hoechst 33342 (разведение 1: 100) при 10° С в течение 30 мин в темноте и анализировали. В ходе этого эксперимента мы использовали микроскоп Nikon A1 (Nikon, Япония) с лазерами 405 нм (DAPI), 488 нм (CellEvent) и 561 нм (TMRE). Количественный анализ не проводился; полученные изображения были использованы для иллюстрации данных проточной цитометрии. В живых суспензиях обоих видов встречаются следующие типы клеток (Рис. 7, А): 1. TMRE+ CE- клетки, обладающие функциональными митохондриями (на что указывает флуоресценция TMRE) и без активных эффекторных каспаз (отсутствует четкий ядерный сигнал CellEvent); 2. TMRE- CE- клетки, характеризующиеся отсутствием работоспособных митохондрий или активных эффекторных каспаз (т.е. не наблюдается флуоресценции CellEvent или TMRE); 3. TMRE+ CE+ клетки, обладающие как функциональными митохондриями, так и активными эффекторными каспазами (присутствуют яркие сигналы TMRE и CellEvent); 4. TMRE- CE+ клетки, отличающиеся высокой активностью эффекторных каспаз и отсутствием трансмембранного потенциала митохондрий; эти клетки демонстрируют яркий ядерный сигнал CellEvent, но не обладают флуоресценцией TMRE. Для исследования живых суспензий проточным цитофлуориметром три особи H. dujardinii и две особи L. variabilis были доставлены в Москву в термосах, заполненных естественной морской водой при 10° С. Губок диссоциировали в CMFSW-E в течение 30 минут и окрашивали TMRE и CellEvent (100 мкМ и 1:100, соответственно). После окрашивания суспензии анализировали с помощью прибора FACSAria SORP (BD Biosciences, США) с лазерами 488 нм (CellEvent) и 561 нм (TMRE). Любое событие, превышающее автофлуоресценцию неокрашенного контроля, считалось TMRE/CellEvent-положительной клеткой. Оба вида продемонстрировали сходное распределение клеток (Рис. 7, С-D). Большинство клеток принадлежало к популяции TMRE+ CE-, которая находится в квадранте Q1 и составляет 89,67±1,06% клеток у H. dujardinii и 70,55±1,48% клеток у L. variabilis. Популяция TMRE+ CE+ клеток находилась в области более высокой флуоресценции CellEvent, квадранте Q2. Эта популяция составила 7,51±0,87% у H. dujardnii и 8,58±0,77% у L. variabilis. Все TMRE- CE+ клетки находились в квадранте Q3, не превышали 1% от общей популяции и не образовывали различимого кластера. Все CellEvent-положительные клетки (т.е. клетки, располагающиеся в квадрантах Q2 и Q3) были небольшими и сильно гранулированными, на что указывают параметры светорассеяния. Популяция TMRE- CE- клеток находилась в квадранте Q4 и составляла 1,67±0,35% у H. dujardinii и 13,70±3,25% у L. variabilis. Хотя эти клетки были меньше, чем TMRE+ CE- клетки, они имели тенденцию отделяться от TMRE+ CE+ клеток на диаграммах светорассеяния. Конечно, доля апоптотических клеток в живых суспензиях должна быть в определенной степени завышена относительно интактных тканей. Однако, эксперименты in vivo проливают некоторый свет на механизмы апоптоза. В клетках млекопитающих двойная окраска TMRE и CellEvent обычно выявляет присутствие трех популяций: 1) интактные TMRE+ CE- клетки, характеризующиеся интактными митохондриями; 2) ранние апоптотические TMRE- CE- клетки, в которых митохондриальный трансмембранный потенциал исчез; 3) поздние апоптотические клетки TMRE-CE +, которые содержат нефункциональные митохондрии и активные эффекторные каспазы. Эта ситуация типична для клеток млекопитающих, т.к. показано, что проницаемость внутренней митохондриальной мембраны тесно связана с проницаемостью внешней митохондриальной мембраны (MOMP) [Barteneva и др., 2014]. В свою очередь, MOMP является ключевым событием во время апоптотического процесса и приводит к высвобождению некоторых проапоптотических белков в цитоплазму. Наиболее важным проапоптотическим белком является цитохром с, который способен связываться с цитоплазматическим белком APAF1, образуя апоптосомы и начинающий рекрутировать эффекторные каспазы [Elmore, 2007]. Наши данные показывают, что апоптоз у губок может быть независимым от МОМР, поскольку в суспензиях H. dujardinii и L. variabilis наблюдались значительные количества TMRE+ CE+ клеток (Рис. 7, С-D). Эти клетки содержат активные эффекторные каспазы, но обладают хорошо функционирующими митохондриями. Следовательно, популяция TMRE- CE- содержит не ранние апоптотические клетки (как первоначально предполагалось), а поврежденные или мертвые клеток и клеточный дебрис. Редкие TMRE- CE+ клетки можно интерпретировать как нежизнеспособные клетки с нефункциональными митохондриями; вероятнее всего, это клетки на более поздних стадиях апоптоза. Дополнительно, нами был опробован метод TUNEL для выявления клеток на поздних стадиях апоптоза с фрагментированной ДНК. После фиксации в 4% PFA PBS, объекты отмывали в PBS и пермеабилизовывали в блок-растворе. Далее, в течение 1 часа при комнатной температуре проводили TdT-реакцию, заключающуюся в ферментативном присоединении к двухцепочечным разрывам меченых нуклеотидов EdUTP. В качестве негативного контроля выступали образцы без добавления TdT-энзима в реакционную смесь; положительным контролем выступали губки, предварительно обработанные ДНКазой I в течение одного часа. После TdT-реакции, объекты подготавливали к конфокальной микроскопии по стандартному протоколу с использованием клик-реакции для выявления включенного в ядра EdUTP. По предварительным результатам, количество TUNEL-положительных клеток в интактных тканях исследованных губок незначительно и соотносится с общей долей CellEvent-положительных клеток в предыдущих экспериментах.
2 1 января 2022 г.-31 декабря 2022 г. Пролиферация и апоптоз как механизмы поддержания гомеостаза тканей губок
Результаты этапа: 1. Отслеживание EdU-положительных клеток у Halisarca dujardinii Для исследования миграции клеток в интактных тканях губок H. dujardinii была адаптирована иммуноцитохимическая окраска с использованием меченых нуклеотидов EdU (маркер клеток в S-фазе). Меченые нуклеотиды передаются дочерним клеткам после деления, что позволяет некоторое время отслеживать миграцию пролиферирующих клеток или их потомков по наличию в них сигнала EdU. В рамках этого эксперимента, после инкубации в EdU часть губок пересаживали обратно в проточный аквариум с природной морской водой. Таким образом, поступление в ткани EdU останавливалось, а стандартные физиологические процессы – деление и миграция клеток – продолжались. По 3 особи H. dujardinii были зафиксированы через 0, 1, 3, 5 и 7 суток после 12 ч инкубации в 200 мкМ EdU. Губок фиксировали в 4% растворе параформальдегида (PFA, Carl Roth 0335.2) в натрий-фосфатном буфере (PBS, ThermoFisher Scientific 003002) в течение 12 часов при +4°С. Образцы отмывали от фиксатора в 1x PBS и пермеабилизировали блокирующим раствором. Выявление встроенного в ядра клеток EdU (клик-реакцию) проводили при комнатной температуре в течение 1-2 часов в растворе 1х PBS, содержащем 4 мМ CuSO4, 10 мкМ Sulfo-Cyanine3 Azide (Lumiprobe A1330), 20 мг/мл L-аскорбата натрия (Sigma-Aldrich 11140). Для краткой инкубации в EdU концентрация Sulfo-Cyanine3 Azide была увеличена в 2 раза (предварительные эксперименты показали, что увеличение концентрации азида улучшает качество окраски). Клик-реакция и все последующие манипуляции с объектами производились без прямого контакта со светом. Отмывка от клик-реакции и подготовка к иммуноцитохимии проходила в нескольких сменах блокирующего раствора. Обработку первичными антителами (Mouse Anti-acetylated-α-tubulin, Sigma-Aldrich T6793, 1:1000) проводили в блокирующем растворе на протяжение 12 часов в +4°С. После нескольких смен блокирующего раствора образцы обрабатывались вторичными антителами (Donkey anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, ThermoFisher Scientific A21202; финальная концентрация – 1 мкг/мл) в блокирующем растворе в течение 12 часов при +4°С. Окраска ядер DAPI (Acros 202710100) проходила в 1х PBS в концентрации 2 мкг/мл при +4°С. Далее, объекты заключали в 90% глицерин (MP Biomedicals 193996) с 2,5% 1,4-диазабицикло(2.2.2)октана (DABCO, Sigma-Aldrich D27802) и подготавливали к съемке. Съемка препаратов производилась на ББС МГУ на конфокальном сканирующем лазерном микроскопе Nikon A1 (Nikon, Japan) с использованием лазеров с длиной волны 405 нм (DAPI), 488 нм (Mouse Anti-acetylated-α-tubulin ABI + DAM IgG Alexa Fluor 488 ABII), 561 нм (EdU + Sulfo-Cyanine3 Azide) с шагом 1 мкм вдоль Z-оси (в среднем 20-40 оптических срезов на препарат). Для каждой особи H. dujardinii были получены по 3 Z-стэка участка эндосомы на расстоянии от оскулярной трубки (n=9 для каждой временной точки). Для анализа полученных Z-стеков в ПО Bitplane Imaris v7.2.1 был разработан алгоритм полуавтоматического подсчета клеток. Подсчет производился инструментом «Spots», который в зависимости от предполагаемого диаметра и интенсивности сигнала самостоятельно выделяет объекты по предварительно выставленному фильтру. Выбранный диаметр объектов составлял 4 мкм; подсчет производился со включенной настройкой «Background substraction»; в качестве фильтра использовался параметр «Quality»/«Median intensity». Далее, выделение корректировалось вручную для удаления неспецифических сигналов. Подобным образом анализ проводился в канале DAPI (для подсчета общего количества ядер) и EdU (для подсчета количества ядер в S фазе). Антитела к ацетилированному α-тубулину использовались для идентификации хоаноцитов с помощью инструмента «Surface». На основе полученных в результате обсчета значений для каждого Z-стэка были получены следующие параметры: а) общее количество клеток; б) общая пролиферирующая фракция (общая доля EdU-положительных клеток); в) общая доля хоаноцитов; г) пролиферирующая фракция хоаноцитов и клеток мезохила (доля EdU-положительных клеток от соответствующей популяции); д) доли хоаноцитов среди всех EdU- и рН3-положительных клеток. Для каждого параметра в дальнейшем анализе использовались средние значения для временной точки. Прекращение инкубации в растворе EdU и дальнейшее содержание особей H. dujardinii в проточном аквариуме изменило распределение сигнала EdU относительно картины, наблюдаемой для интактных тканей. Сперва наблюдалось резкое падение общей доли меченых клеток до 1,79%, которое на временной точке в 5 суток сменилось ростом до изначальных значений в 8,4±1,14%. На временной точке в 7 суток произошел очередной спад доли меченых клеток до 3,92±1,66%. Таким образом, в среднем общая доля меченых клеток со временем уменьшалась (критерий Уилкоксона говорит о различии медиан выборок для 0 суток и 7 суток, Р=0,0062). Изменение долей меченых хоаноцитов и клеток мезохила (относительно всех клеток) соответствовало изменениям в общем количестве меченых клеток. Однако, вклад хоаноцитов и клеток мезохила в общий уровень синтезирующих ДНК клеток со временем изменялся. Другими словами, изменялось распределение сигнала EdU между рассматриваемыми группами клеток: все больше меченых ядер принадлежали клеткам мезохила, в то время как доля хоаноцитов от всех меченых клеток снижалась. Если в начале эксперимента клетки мезохила составляли 7,9% от всех меченых клеток, то через 7 суток после инкубации в растворе EdU доля клеток мезохила от всех меченых клеток достигла 55,1%. Использование критерия Уилкоксона для сравнения краевых точек эксперимента (0 сут и 7 сут) выявило наличие статистически значимых различий между полученными значениями (p=0,0007 для доли меченых клеток мезохила и p=0,0016 для доли хоаноцитов). По аналогии с проведенными на планариях экспериментами, полученную картину можно объяснить миграцией потомков хоаноцитов в мезохил [Reddien et al., 2005]. В таком случае, вне зависимости от природы этой миграции (миграция вследствие асимметричного деления или миграция с последующим делением уже в мезохиле), доли клеток будут изменяться в обратной зависимости. Определенную роль в уменьшении количества EdU-положительных хоаноцитов могло сыграть «разбавление» метки: при делении содержащей EdU клетки меченые нуклеотиды приблизительно в равной пропорции распределяются между дочерними ядрами. В таком случае, интенсивность сигнала в один момент может выйти за порог регистрации. На такое разбавление указывает, в частности, уменьшение общего количества меченых клеток со временем. Нельзя не принять во внимание и альтернативную гипотезу. Есть вероятность, что мезохил содержит в себе независимую от хоаноцитов популяцию пролиферирующих клеток, обладающих собственной динамикой клеточного цикла. В таком случае снижение вклада хоаноцитов происходит за счет описанного выше «разбавления» сигнала из-за слишком активного возобновления; клетки мезохила, в свою очередь, могут обладать гораздо более длительным клеточным циклом. Тогда эффект разбавления будет иметь для них меньшее значение, и на данном отрезке времени может наблюдаться увеличение количества меченых клеток. На данном этапе работы не представляется возможным сделать однозначный выбор между описанными выше гипотезами. Итак, пролиферация хоаноцитов и миграция их потомков может играть значительную роль в поддержании интактных тканей губок. Хоаноциты также активно участвуют в регенерации у Calcarea [Lavrov et al., 2018]. Новые данные свидетельствуют о том, что роль хоаноцитов в регенерации у Demospongiae долгое время недооценивалась, и они являются важным источником новых клеток в процессе заживления ран [Borisenko et al., 2015; Ereskovsky et al., 2020]. Хоаноциты являются предшественниками гамет у Calcarea и некоторых Demospongiae [Ereskovsky, 2010]. В частности, у H. dujardinii и сперматозоиды, и ооциты формируются из жгутиковых клеток водоносной системы [Короткова, Айзенштадт 1976]. В совокупности эти факты позволяют предположить, что хоаноциты являются популяцией активных плюрипотентных стволовых клеток у Porifera. Амебоидные клетки мезохила (в частности, археоциты Demospongiae) в таком случае являются неоднородной совокупностью клеток на разных стадиях дифференцировки. Будучи подвижными клетками, они служат средством доставки клеточного материала в различные участки тела губок; их направленная миграция и дифференцировка являются способом интеграции и связи процессов тканевой динамики в едином организме. Популяция таких клеток может быть в определенной степени самоподдерживающейся (или их деление может быть связано с процессами дифференцировки), как это происходит с транзиторными стволовыми клетками у млекопитающих [Pelletieri, Alvarado, 2007]. Однако, именно хоаноциты играют роль главного источника новых клеток для обновления и роста тканей. 2. Выявление длительности G2-фазы клеточного цикла Длительность клеточного цикла была исследована через оценку длительности G2-фазы клеточного цикла (КЛСМ) и распределения клеток по содержанию ДНК (проточная цитофлуориметрия). Длительность G2-фазы была рассчитана методом накопления меченых митозов (колокализации сигналов EdU и рН3). Если степень колокализации равняется 0% (то есть ни одна рН3-положительная клетка не содержит в себе меченых нуклеотидов), выбранная длительность инкубации меньше длительности G2-фазы: клетки не успевают пройти полный путь от конца S-фазы до М-фазы. Если степень колокализации равняется 100% (то есть все рН3-положительные клетки содержат в себе меченые нуклеотиды), используемая длительность инкубации больше совокупной длительности G2- и М-фаз: учитывая, что М-фаза также занимает определенное время, минимальный «путь» таких клеток в контексте фаз клеточного цикла составляет часть S-фазы, полную G2-фазу и часть M-фазы. Временная точка, соответствующая 50% колокализации сигналов, отвечает инкубации длительностью целой G2- и половине М-фазы, взятых вместе: на момент начала инкубации половина pH3-положительных клеток располагаются максимум за половиной длины М-фазы до конца S-фазы (метятся EdU и приступают к началу М-фазы), половина – максимум через половину длины М-фазы после конца S-фазы (не метятся EdU и заканчивают М-фазу). Таким образом, можно построить накопительную прямую зависимости колокализации сигналов EdU и рН3 от длительности инкубации в EdU и, соответственно, рассчитать длительность G2- и М-фаз клеточного цикла. Губок подвергали инкубациям в EdU различной длительности: 12, 13, 14, 15 и 16 ч для H. dujardinii и 10, 11, 12 и 13 ч для L. variabilis. В случае H. dujardinii было использовано по 3 особи на каждую временную точку. Для L. variabilis были использованы 3 крупные особи, от которых в соответствующие точки отрезали по одной трубке кормуса. После инкубации образцы фиксировали и подготавливали к КЛСМ согласно протоколу, описанному в разделе «Отслеживание EdU-положительных клеток» с использованием антител к фосфорилированному гистону-3 ((Rabbit Anti-phospho-histone H3, Sigma-Aldrich H0412; разведение 1:1000). Для каждой особи H. dujardinii снимали по 3 Z-стэка участка эндосомы на расстоянии от оскулярной трубки, для L. variabilis – по 3 Z-стэка трубки кормуса. В процессе анализа в ПО Bitplane Imaris вручную подсчитывали: а) общее количество рН3-положительных ядер хоаноцитов; б) количество одновременно EdU- и рН3-положительных хоаноцитов; в) индекс колокализации сигналов EdU и рН3 для каждой особи (суммарное отношение количества одновременно EdU- и рН3-положительных хоаноцитов к общему количеству рН3-положительных хоаноцитов за 3 полученных Z-стэка). В ходе увеличения длительности инкубации в меченых нуклеотидах степень колокализации сигналов EdU и рН3 постепенно увеличивается. После 12 часов инкубации только 4,8±8,2 рН3-положительных клеток H. dujardinii содержит в ядрах EdU; через 16 часов после начала инкубации индекс колокализации составляет 70,2±12,9%. Тем не менее, промежуточные временные точки демонстрируют некоторый разброс относительно общего тренда, что может являться следствием индивидуальной изменчивости между особями. Для выявления зависимости колокализации от времени инкубации был проведен анализ методом линейной регрессии. Полученные значения для регрессионной модели составили р=0,0107 и R²=0,36, что указывает на низкое качество модели; вероятнее всего, это связано с упомянутой изменчивостью и необходимостью увеличить количество наблюдений. Тем не менее, коэффициенты регрессионной прямой предсказывают 0% колокализации через 11 часов после начала инкубации и 100% после 18 часов инкубации. 50% колокализации соответствуют 14 часам инкубации в EdU. В случае L. variabilis EdU-содержащие рН3-положительные клетки отсутствовали после 10 часов с начала инкубации в меченых нуклеотидах. После 11 часов инкубации степень колокализации составляет 37,4±36,6%, поднимаясь до 72,2±25,4% через 13 часов с начала эксперимента. В одной из особей на временной точке в 13 часов все pH3-положительные клетки содержат EdU. Линейный регрессионный анализ (р-значение=0,0029 и R²=0,604) предсказывает 0% колокализации для 10 часов инкубации и 100% для 14 часов; 50% колокализации соответствуют 13 часам инкубации в EdU. Таким образом, для обоих видов при увеличении длительности инкубации увеличивается также степень колокализации сигналов EdU и pH3. Полученные данные, к сожалению, демонстрируют значительный разброс и позволяют сделать лишь приблизительные оценки длительности G2-фазы. Объяснением может служить, во-первых, индивидуальная изменчивость пролиферации; во-вторых, использованная нами модель предполагает гомогенность пролиферирующей популяции с точки зрения длительности исследуемых фаз. В случае, когда клетки демонстрируют различия в длительности G2-фазы, можно ожидать более пологой прямой накопления и, соответственно, искаженные оценки для длительности М-фазы. Возможность наличия различающихся по характеристикам цикла субпопуляций клеток показана, например, для интерстициальных клеток гидры [Holstein, David, 1990]. Тем не менее, мы считаем нашу методику применимой с указанными выше оговорками. Полученные данные свидетельствуют о том, что средняя длительность G2-фазы хоаноцитов составляет не менее 12 часов для H. dujardinii и не менее 10 часов для L. variabilis (это временные точки, на которых колокализация равняется 0%). Длительность G2- и М-фаз клеточного цикла не больше 18 часов для H. dujardinii и 14 часов для L. variabilis – для этих временных точек предсказана 100% колокализация. При этом, предсказанная длительность М-фазы хоаноцитов H. dujardinii составляет 6 часов, L. variabilis – 4 часа. Данная оценка вряд ли соответствует реальной длительности M-фазы: доля выявленных митотических (рН3-положительных) клеток в тканях исследованных губок не превышает 0,5%. Столь низкая доля митотических клеток в асинхронной популяции свидетельствует о краткости M-фазы. Установленная через колокализацию длительность М-фазы, вероятнее всего, является завышенной в силу более «пологой» прямой накопления меченых митозов из-за гетерогенности хоаноцитов в длительности G2-фазы. В любом случае, мы знаем верхний предел длительности G2- и М-фаз хоаноцитов; благодаря проточной цитофлуориметрии мы знаем также отношение доли G2/M-клеток к доле клеток в S-фазе. Естественно, не все зарегистрированные проточной цитофлуориметрией S- и G2/M клетки являются хоаноцитами, но, судя по результатам КЛСМ, количество пролиферирующих клеток в мезохиле пренебрежительно мало. Соответственно, мы можем получить грубую оценку длительности S-фазы хоаноцитов: она составляет 18×2,2=39,6 часов для H. dujardinii и 14×2,7=37,8 часов для L. variabilis. Сумма всех известных фаз клеточного цикла занимает 57,6 ч для H. dujardinii и 51,8 часов для L. variabilis. К сожалению, использованный нами подход не способен предоставить оценку доли G1-клеток среди G0/G1 клеток, равно как и общего количества пролиферирующих клеток (т.е. совокупности клеток в G1-, S-, G2- и М-фазах). В связи с этим невозможно на данный момент сделать вывод о полной длительности клеточного цикла хоаноцитов. Однако уже сейчас можно заключить, что клеточный цикл хоаноцитов H. dujardinii и L. variabilis значительно длиннее, чем приведенные в литературе оценки для Halisarca caerulea, Hymeniacidon sinapium и Sycon ciliatum [Shore, 1971; De Goeij et al., 2009; Kahn, Leys, 2016]. Вероятнее всего, хоанодерма исследованных нами губок содержит большое количество медленно пролиферирующих клеток, гетерогенных в контексте длительности G2-фазы. 3. Анализ апоптотической активности в интактных тканях Для визуализации апоптотических клеток в интактных тканях применяли двойную окраску СellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent (далее CellEvent; ThermoFisher Scientific, R37111) в качестве маркера активных эффекторных каспаз и методом TUNEL (выявление двуцепочечных разрывов в ДНК) [Gavrieli, Sherman, Ben-Sasson, 1992]. Губок инкубировали в FSW с добавлением CellEvent в разведении 1:100 и CellTracker в концентрации 2,5 мкМ в течение 2 часов. В качестве положительного контроля выступали подвергнутые тепловому шоку губки (5 минут при +60°С) и регенерирующая особь L. variabilis (3 часа после отрезания оскулярной трубки). Объекты (по 3 особи для каждого вида) фиксировали в 4% PFA PBS. После отмывки в PBS образцы пермеабилизировывали в 0,5% растворе Triton-X100 в PBS и переводили в буфер для терминальной трансферазы (TdT, NEB M0315 L). TdT-реакция (ферментативное присоединение меченых нуклеотидов к двуцепочечным разрывам ДНК) проходила в течение 2 часов при комнатной температуре в растворе 1000 ед/мл TdT-энзима и 20 мкМ EdUTP (Jena Bioscience CLK-T07) в TdT-буфере (ThermoFisher Scientific 16314015). В качестве положительного контроля к TdT-реакции выступали предварительно обработанные ДНКазой I (ThermoFisher Scientific EN0521) образцы. Результат TdT-реакции визуализировали с помощью клик-реакции в соответствии с протоколом, описанном в разделе «Отслеживание EdU-положительных клеток». Положительным контролем к клик-реакции служили инкубированные в EdU губки. В процессе подготовки к КЛСМ окраску антителами не применяли. Съемка происходила с использованием лазеров с длиной волны 405 нм (DAPI), 488 нм (CellEvent), 561 нм (TUNEL) и 648 нм (CellTracker). Для каждой особи H. dujardinii снимали по 3 Z-стэка эктосомы (от поверхности губки до появления первых хоаноцитных камер; n=9) и участка эндосомы на расстоянии от оскулярной трубки (n=9). У L. variabilis были исследованы: оскулярное кольцо (n=4), дистальный отдел оскулярной трубки (n=3), средний отдел оскулярной трубки (n=3), проксимальный отдел оскулярной трубки (n=3), дистальный отдел дивертикула (n=3), проксимальный отдел дивертикула (n=3), трубки кормуса (n=3). Подсчет клеток в Bitplane Imaris проводили вручную; анализировали общую долю CellEvent-положительных клеток, общую долю TUNEL-положительных клеток, колокализацию сигналов и доли хоаноцитов/клеток мезохила среди CellEvent/TUNEL-положительных клеток. Использованный метод выявляет незначительное количество апоптотических клеток в тканях обоих видов. Эндосома H. dujardinii содержит единичные TUNEL- и CellEvent-положительные клетки, чья доля составляет 0,02±0,02% и 0,02±0,01% от общего количества клеток. В эктосоме доля апоптотических клеток выше и достигает 0,13±0,13% для TUNEL-положительных клеток и 0,07±0,06% для CellEvent-положительных клеток. Полученные значения для эндосомы и эктосомы достоверно различаются (р=0,0121 для TUNEL и р=0,0103 для CellEvent; приведены данные теста Краскела-Уоллеса). При этом сигналы TUNEL и CellEvent редко демонстрируют колокализацию. Среди TUNEL-положительных объектов присутствуют объекты меньшего диаметра, чем нормальные интактные ядра; предположительно, это апоптотические тельца. Среди выявленных апоптотических клеток присутствуют как хоаноциты, так и клетки мезохила; однако, сделать выводы о соотношении клеточных типов среди апоптотических клеток не представляется возможным из-за малого количества последних. В интактных тканях L. variabilis апоптотических клеток больше; участки тела, содержащие хоанодерму (трубки кормуса, средняя часть оскулярной трубки, дистальная и проксимальная части дивертикул) демонстрируют в сумме 0,35±0,29% TUNEL-положительных клеток и 0,04±0,03% CellEvent-положительных клеток. Оскулярное кольцо резко отличается от остальных участков тела и содержит 4,36±1,98% TUNEL-положительных и 1,9±0,77% CellEvent-положительных клеток. В оскулярном кольце также больше клеток, в которых наблюдается колокализация сигналов TUNEL и CellEvent. Статистические различия между участками тела, содержащими хоанодерму, отсутствуют. Оскулярное кольцо отличается от остальных участков тела, взятых вместе, с р=0,0036 для TUNEL и р=0,0034 для CellEvent (приведены данные теста Краскела-Уоллеса). Среди обнаруженных апоптотических клеток присутствуют хоаноциты, экзопинакоциты, амебоидные клетки мезохила. Многие из обнаруженных TUNEL- и CellEvent-положительных объектов (особенно в оскулярном кольце) значительно мельче интактных ядер и располагаются в цитоплазме клеток – это, предположительно, апоптотические тельца. Стоит отметить, что окраска в интактных тканях демонстрирует достаточно низкую специфичность и интенсивность. В каналах обоих маркеров зафиксирована автофлуоресценция цитоплазмы многих клеток – диффузная в канале CellEvent и в виде скопления гранул в канале TUNEL. Из всех исследованных участков тела лучшая окраска была получена для оскулярных колец L. variabilis, в том числе в предварительных экспериментах по тестированию условий окраски. Тем не менее, для выбранных нами маркеров характерная ядерная локализация, по которой возможно выявить истинные TUNEL- или CellEvent-положительные клетки. Адекватность полученных оценок подтверждают использованные нами положительные контроли, в которых присутствуют однозначно апоптотические клетки. Так, через 2 часа после нанесения раны оскулярной трубке L. variabilis на краю раневой поверхности присутствуют яркие TUNEL-положительные клетки; интенсивность флуоресценции CellEvent при этом в них низка. Яркий TUNEL-положительный сигнал несут также ядра образцов, обработанных ДНКазой. Наконец, подвергнутые тепловому шоку особи демонстрируют значительное количество однозначных сигналов как TUNEL, так и CellEvent. 4. Идентификация компонентов канонического Wnt-пути и апоптотического каскада in silico Для анализа in silico в наше распоряжение были предоставлены собранные транскриптомы исследуемых объектов. Выделенную из взрослых животных РНК секвенировали с помощью Illumina HiSeq 2000 (Illumina, UK) с длиной ридов 100 нуклеотидов. Адаптерные последовательности, некачественные и избыточные риды были удалены с помощью TRIMMOMATIC [Bolger, Lohse, Usadel, 2014]. Сборка проводилась в ПО TRINITY [Haas и др., 2013] по стандартным настройкам. В случае H. dujardinii собранный транскриптом выравнивался на риды геномной ДНК, выделенной из личинок; таким образом удалялась потенциальная эукариотическая контаминация. Используя TransDecoder, транкриптомы очищали от коротких, химерных или не содержащих открытые рамки считывания транскриптов. Наконец, схожие последовательности (полиморфизмы и изоформы) были сгруппированы в CD-HIT-EST [Fu и др., 2012] со стандартными настройками. Полнота сборки проверялась в BUSCO – V.4.1.4 [Simão и др., 2015] сравнением с базой данных эукариотических генов домашнего хозяйства (eukaryota_odb10). Первичную аннотацию транскриптомов производили путем сравнения с базой данных KEGG PATHWAY (Apoptosis и Wnt signaling pathway) со стандартными параметрами поиска [Kanehisa и др., 2016]. Полученные результаты (присутствие или отсутствие участников рассматриваемых каскадов и общая схема их взаимодействия) служили отправной точкой для ручной аннотации транскриптомов. Поиск интересующих транскриптов проводили алгоритмом tblastn [Gerts и др., 2006] по локальной базе данных (транскриптомам H. dujardinii и L. variabilis) в ПО BioEdit с матрицей замен BLOSUM62 и верхним значением E-value, равным 1. В качестве поискового запроса tblastn использовались аминокислотные последовательности интересующих белков-паралогов у Mus musculus, полученные с помощью поиска в базе данных UniProt [Bateman и др., 2017]. Отобранные по E-value транскрипты транслировали при помощи ExPasy Translate Tool [Gasteiger и др., 2003] и сохраняли открытые рамки считывания. Полученные рамки считывания проверяли путем обратного поиска pblast по базе данных UniProt. Доменную структуру предполагаемых участников каскадов предсказывали с помощью инструмента InterProScan [Jones и др., 2014]. Сайты фосфорилирования были предсказаны в ПО GPS 5.0 [Wang и др., 2020]; более специфические сайты или мотивы искали вручную. Структуру белков визуализировали вручную в ПО DOG 2.0 [Ren и др., 2009]. Дальнейший анализ проводился построением филогенетических деревьев методами максимального правдоподобия (ML) и байесовского анализа (BI). Для этого, из базы данных UniProt отбирались аминокислотные последовательности интересующих белков у различных животных, в том числе других губок (Amphimedon queenslandica, Demospongiae и Sycon ciliatum, Calcarea). Для проверки автоматически аннотированных последовательностей из UniProt использовался сервис NCBI Batch-CD search [Yang и др., 2020]: последовательности, обладающие нарушенной или неполной доменной структурой, исключались из анализа. Подходящие для анализа последовательности загружали в ПО Geneious 7.1.3 и выравнивали с последовательностями H. dujardinii и L. variabilis алгоритмом MUSCLE [Edgar, 2004] по стандартным настройкам. Байесовский анализ проводился в ПО MrBayes 3.2.6 [Ronquist и др., 2012] с подключенной библиотекой BEAGLE для ускорения обсчета. Для анализа использовали смешанную (mixed) модель аминокислотных замен; каждый анализ включал в себя 4 независимых запуска с 4 марковскими цепями и 10 млн генераций. Отбор проводился каждые 1000 генераций; первые 25% деревьев были исключены из анализа. Анализ методом максимального правдоподобия проводился в сервисе IQTree [Nguyen и др., 2015] с автоматическим подбором матрицы аминокислотных замен. Устойчивость дерева определяли методом ultrafast bootstrap с использованием 5000-10000 повторных псевдослучайных выборок. Визуализацию деревьев проводили в ПО FigTree 1.4.4. 4.1. Wnt-каскад В транскриптомах исследуемых объектов обнаруживаются все необходимые для функционирования классического Wnt-каскада компоненты. Мы идентифицировали 10 потенциальных ортологов Wnt-лигандов у H. dujardinii и 12 ортологов – у L. variabilis. Из всех полученных последовательностей InterProScan предсказывает сайты связывания с рецепторами Wnt только для двух потенциальных ортологов у H. dujardinii и для девяти – у L. variabilis. Проведенный филогенетический анализ показал, что разнообразие известных для губок Wnt-лигандов не представляется возможным однозначно разнести по группам ортологов, известных для Eumetazoa. Большая часть полученных нами последовательностей формирует ветвь, близкую к группе Wnt8; остальные последовательности, найденные у губок, по-видимому, также близки к группе Wnt11. Количество обнаруженных Wnt-лигандов предположительно свидетельствует о Porifera-специфичной экспансии этих генов [Borisenko и др., 2016]. На примере губок Sycon ciliatum и H. dujardinii показано, что известное для них разнообразие Wnt-лигандов демонстрирует в их тканях дифференциальную экспрессию [Leininger et al., 2014; Borisenko et al., 2021]. Все известные для A. queenslandica Wnt относятся к группе Wnt11-подобных белков; у H. dujardinii, S. ciliatum и L. variabilis показано наличие как Wnt11, так и Wnt8. Интерес представляет тот факт, что для Wnt11 Eumetazoa и Wnt4 Drosophila melanogaster (еще одного белка, схожего с Wnt11 губок) предполагается участие в неканонических вариантах Wnt-каскада [Pandur et al., 2002; Murat et al., 2010]. Можно предполагать, что обнаруженные у губок группы Wnt функционально различны: Wnt8-подобные белки могут обеспечивать регуляцию канонического Wnt-каскада, а Wnt11-подобные белки – участвовать в PCP- или Са2+-зависимом пути. Стоит, однако, отметить, что неканонические Wnt-лиганды все еще способны участвовать в поддержании тканевого гомеостаза [Sugimura, Li, 2010], а наличие неканонических вариантов Wnt-каскада у губок часто ставится под сомнение [Adamska и др., 2010]. В исследуемых транскриптомах присутствуют последовательности рецепторов Wnt-лигандов – Frizzled (Fzd). Три идентифицированных для L. variabilis транскрипта кодируют белки, гомологичные известным для Sycon ciliatum FzdA, FzdB и FzdD. Последние два белка составляют единую кладу вместе с FzdB H. dujardinii и Amphimedon queenslandica. FzdA обыкновенных и известковых губок не составляют единой клады, располагаясь, впрочем, в основании группы, включающей все остальные Fzd. Для H. dujardinii также описан уникальный транскрипт, не имеющих прямых гомологов у других губок; мы назвали его Fzd-like. Его расположение на филогенетическом дереве рядом с аутгруппой – белками Smoothened – не позволяет однозначно заключить, является ли этот белок функциональным рецептором к Wnt. Стоит отметить, что InterProScan предсказывает наличие Wnt-связывающих сайтов в рецепторном CRD-домене данного белка; впрочем, С-концевая (цитоплазматическая) часть данного рецептора не несет в себе необходимого для передачи сигнала KTXXXW-мотива. Для FzdA L. variabilis этот мотив также не характерен. Остальные полученные аминокислотные последовательности несут классические для Fzd-рецепторов черты (в том числе С-концевой KTXXXW-мотив); однако, для FzdА и FzdD L. variabilis не предсказывается наличие Wnt-связывающих сайтов. У губок также обнаружены транскрипты, кодирующие корецептор Fzd – LRP5/6. Для обоих исследуемых видов идентифицировано по одному транскрипту; при этом, InterProScan предсказывает для LRP5/6 H. dujardinii нарушенную структуру белка: присутствует лишь два из четырех характерных для внеклеточной части белка YTWD-повтора и два из трех LDLR-A-повторов. Вместе с этим, для внутриклеточной части этого белка предсказываются многочисленные сайты фосфорилирования, необходимые для регуляции работы корецептора. Филогенетический анализ предсказывает близость аминокислотных последовательностей Halisarca LRP5/6 и Leucosolenia LRP5/6 к соответствующим гомологам у Amphimedon queenslandica и Hydra vulgaris. Нам также удалось обнаружить некоторые дополнительные элементы Wnt-каскада, влияющие на взаимодействие между Wnt-лигандами и рецепторами: гомологи Porcupine (Porc), Notum и Secreted Frizzled-related Protein (SFRP). Последовательности, кодирующие Wnt inhibitory factor (WIF), Cerberus (Cer1) и Kremen, обнаружены не были. Тем не менее, у L. variabilis присутствует гомолог Dickkopf (Dkk) – белка, влияющего на Wnt-каскад через Kremen. Наличие Dkk предсказано также для O. lobularis (Homoscleromorpha), но не H. dujardinii и A. queenslandica (Demospongiae): возможно, это объясняется Demospongiae-специфичной утратой Dkk [Adamska и др., 2010; Nichols и др., 2006]. При этом, Dkk часто регулирует рецепцию Wnt-лигандов через взаимодействие с трансмембранным белком Kremen [Niehrs, 2006], который отсутствует у всех исследованных видов губок. По-видимому, Dkk губок связывается с Lrp5/6 напрямую – что, впрочем, не должно мешать Dkk выполнять свои функции [Bao, Zheng, Wu, 2012]. В исследованных транскриптомах были обнаружены последовательности, кодирующие секретируемые Frizzled-подобные белки (SFRP) – две для H. dujardinii и одна для L. variabilis. Они обладают классической доменной структурой, включающей в себя рецепторные CRD-домены и нетриновый домен. Филогенетический анализ показывает родство обнаруженных последовательностей с SFRP1/2 Eumetazoa; гомологи SFRP 3/4 найдены не были. У исследованных объектов также найдены последовательности, кодирующие рекрутируемый рецепторами цитоплазматический белок Dishevelled (Dvl). Для H. dujardinii найдена одна последовательность, отвечающая доменной структуре классических Dvl (идентифицированы домены DIX, PDZ и DEP). У L. variabilis присутствуют две последовательности, одна из которых обладает полной доменной структурой, другая – содержит только PDZ- и DEP-домены. Последовательности, кодирующие модуляторы трансдукции сигнала Dvl – белки Idax и Naked (Nkd) – обнаружены не были. Из белков комплекса деградации бета-катенина – гликоген-синтазы 3-бета (GSK-3), Adenomatous polyposis coli (APC) и Axin – каждый, по-видимому, присутствует у губок. Полученные транскрипты (один для H. dujardinii и два для L. variabilis) кодируют GSK-3 с классической доменной структурой (АТФ-связывающий сайт, активный сайт серин-треониновой киназы и несколько Axin-связывающих сайтов). Обратный blastp и построенные филогенетические деревья показывают, что остальные обнаруженные с помощью tblastn последовательности кодируют иные киназы (CDK20 и ICK). В филогенетическом дереве, построенном только по GSK-3 последовательностям, GSK-3 губок образуют кладу вместе с полученными для стрекающих последовательностями. Кодирующие GSK-3-связывающий белок FRAT последовательности в исследованных транскриптомах отсутствуют. Только в транскриптоме H. dujardinii удалось обнаружить последовательность, которая кодирует белок с характерной для Axin структурой (RGS- и DIX-доменами). В отличие от Axin позвоночных, InterProScan не предсказывает для Halisarca Axin сайты связывания бета-катенина и APC; впрочем, то же самое относится к Axin-подобным белкам Amphimedon queenslandica и Nematostella vectensis. Филогенетический анализ не представляет возможным однозначно определить положение Halisarca Axin и Amphimedon Axin среди гомологичных белков животных в силу низких поддержек узлов. β-катенин (β-catenin) – мишень для GSK3 – также присутствует у исследуемых губок. Для H. dujardinii идентифицирована одна β-catenin-кодирующая последовательность, для L. variabilis – две. Транскрипт H. dujardinii кодирует белок с 11 armadillo-повторами (против 12 у β-catenin Mus musculus и Amphimedon queenslandica), но обладает характерными сайтами фосфолирирования GSK-3 ближе к N-концу. Последовательности β-catenin L. variabilis отличаются меньшим количеством armadillo-повторов; сайты фосфорилирования, тем не менее, тоже присутствуют. Филогенетический анализ показывает гомологичность найденных последовательностей аннотированным β-катенинам Sycon ciliatum и Amphimedon queenslandica. Дополнительно, в транскриптомах обоих объектов были обнаружены последовательности, кодирующие β-катенин-связывающие белки chibby (Cby1). Транскрипты других регуляторных элементов – β-катенин-взаимодействующих белков ICAT – найдены не были. Также был идентифицирован ряд транскриптов, кодирующих внутриядерные компоненты Wnt-каскада: репрессор Wnt-зависимых генов Groucho (Gro; по одной последовательности для каждого вида), C-терминальный связывающий белок CtBP (одна последовательность для H. dujardinii и две для L. variabilis), δ-катенин (δ-catenin; по одной последовательности для каждого вида) и котранскрипционный фактор TCF/LEF (одна последовательность для H. dujardinii и две для L. variabilis). Таким образом, Wnt-каскад демонстрирует высокую степень консервативности [Agostino, Pohl, 2020; Amerongen Van и др., 2005]. Некоторые минорные компоненты, модулирующие рецепцию (Cer1, Wif, Kremen) и внутриклеточный сигналинг (Idax, FRAT, Nkd, ICAT), могут отсутствовать у губок. Тем не менее, центральные участники каскада (Wnt, Frizzled, Lrp5/6, Dvl, компоненты комплекса деградации β-катенина и Wnt-зависимые транскрипционные факторы) присутствуют и в большинстве своем сохраняют классическую доменную структуру. Наиболее эволюционно лабильным представляется комплекс деградации β-катенина: Axin-подобный белок присутствует только у H. dujardinii, и для него не предсказывается APC- и β-катенин-связывающие участки; структура APC (найденного у обоих видов) также значительно отклоняется от установленной для позвоночных модели. Эти факты поднимают вопрос о функционировании всего комплекса; однако, GSK-3 способна фосфорилировать β-катенин без присутствия APC и Axin [Yost и др., 1996]. Нарушенная структура Axin и APC характерна также для обыкновенной губки Amphimedon queenslandica и кораллового полипа Nematostella vectensis – и, в то же время, эти белки сохраняют свою функциональность [Adamska и др., 2010; Kraus и др., 2016]. Делеции в Axin также лишь частично нарушают его работу у Drosophila melanogaster [Peterson-Nedry и др., 2008]. По-видимому, отсутствие классических Axin и APC не препятствует функционированию канонического Wnt-каскада. Суммируя вышесказанное, губки обладают полностью функциональным каноническим Wnt-каскадом; известны работы, демонстрирующие экспрессию его компонентов в хоанодерме. Одновременно с этим, хоаноциты экспрессируют компоненты TGF-β-каскада – еще одного сигнального пути, определяющего поведение стволовых клеток [Leininger и др., 2014]. Мы предполагаем, что Wnt- и TGF-β-каскады составляют молекулярную основу «тканевой ниши» в хоанодерме и играют решающую роль в определении пролиферативного потенциала клеток. Действительно, сложно представить наличие какой-либо оформленной и постоянной ниши для подвижных археоцитов: существует мнение, что их поведение регулируется внутренними, аутокринными факторами [Okamoto и др., 2012]. 4.2. Апоптотический каскад Из инициаторных компонентов внешнего пути активации апоптоза (лигандов, рецепторов и адаптерных белков) в транскриптомах исследуемых губок были обнаружены кодирующие последовательности TNFα/β-подобных белков (факторы некроза опухолей), TNFR-подобные белки (рецепторы факторов некроза опухолей), Fas-ассоциированные белки с доменом смерти FADD и TNF-ассоциированные факторы TRAF. Последовательности, кодирующие TNFα/β-подобные белки, присутствуют в транскриптомах H. dujardinii и L. variabilis по одной копии. Обратный blastр по базе данных UniProt предсказывает принадлежность этих белков к TNFα (и близость к некоторым неаннотированным белкам стрекающих). TRAIL- и FasL-подобные белки найдены не были. Дальнейший анализ показывает, что идентифицированные последовательности филогенетически близки друг к другу и со слабыми поддержками группируются с TNFα/β-белками позвоночных и Eiger Drosophila melanogaster. Найденные последовательности, кодирующие TNFR-подобные белки, отличаются от классических «рецепторов смерти» – TNFR1, TRAIL и FAS – отсутствием необходимого для взаимодействия с адаптерными белками цитоплазматического домена Death domain. Тем не менее, для этих аминокислотных последовательностей предсказывается достаточно длинный цитоплазматический участок, что делает их структуру похожими на участвующий в апоптозе рецептор Wengen Drosophila melanogaster. Рецепторная часть идентифицированных белков также отличается наличием двух TNFR-характерных цистеин-богатых доменов (CRD) против четырех у TNFR1, TRAIL и FAS позвоночных. Филогенетический анализ (как по полным последовательностям, так и по CRD-доменам) не позволяет однозначно отнести полученные для губок последовательности к известным семействам TNFR-подобных белков из-за низкой поддержки узлов дерева. Из адаптерных белков, связанных с работой рецепторов смерти, у исследованных губок присутствуют FasR-ассоциированные белки с доменом смерти FADD и TNFR-ассоциированные факторы TRAF. TNFR-ассоциированный белок с доменом смерти TRADD и рецептор-ассоциированная протеинкиназа 1 RIP обнаружены не были. При этом, только у H. dujardinii присутствует транскрипт, кодирующий FADD с полноценной доменной структурой (с Death effector domain и Death domain); аналогичная последовательность у L. variabilis кодирует короткий фрагмент белка, содержащий только Death domain. Филогенетический анализ показывает близость FADD H. dujardinii к соответствующему белку Amphimedon queenslandica. Для H. dujardinii и L. variabilis идентифицировано 16 и 19 TRAF-кодирующих транскриптов, соответственно. Большая их часть кодирует белки с классической для TRAF доменной структурой: С-концевой RING-домен, домен цинковых пальцев (Zinc finger) и N-концевой MATH-домен, несущий функцию взаимодействия с рецепторами. Девять последовательностей L. variabilis относятся к группе TRAF2-подобных белков и еще пять – предположительно TRAF5-подобных белков. У H. dujardinii присутствует пять последовательностей, кодирующие TRAF2-подобные белки; оставшиеся пять транскриптов кодируют белки, по-видимому, филогенетически близкие к TRAF-подобным белкам слизевика Dictyostelium discoideum и TRAF4/6 Eumetazoa. Были также обнаружены многочисленные последовательности, кодирующие центральные участники внутреннего пути апоптоза – членов надсемейства Bcl2-подобных белков. Всего было описано пять Bcl2-подобных белков у H. dujardinii и 6 – у L. variabilis. Последовательности, кодирующие Bim, Bid, Bad, Mcl-1, Bcl-W, Bcl-10, Bcl-11, Bcl-12, Puma и Noxa, найдены не были. Из обнаруженных белков ни один не несет характерный для Bcl-2/Bcl-X BH4-домен; для большей части предсказывается наличие BH3-, BH1- и BH2-доменов. У ряда белков доменная структура нарушена, но ни один из них не состоит только из BH3-домена (как, например, представители группы BH3-only белков наподобие Bid, Bad, Bim). Филогенетический анализ методом максимального правдоподобия показывает, что большая часть идентифицированных белков близка к Bok-подобны белкам; также у H. dujardinii обнаруживается один Bax-подобный белок, у L. variabilis – один Bak-подобный белок (поддержки узлов, однако, низки). Наконец, идентифицированы Mcl1-подобный белок у H. dujardinii и Bcl2-подобный белок у L. variabilis; впрочем, поддержки ветвей внутри группы Mcl1/Bcl2/BclX-белков не позволяют сделать однозначный вывод о принадлежности этих белков к определенным группам ортологов. Байесовский анализ подтверждает наличие у исследованных губок Bax- и Bak-подобных белков, но не может разрешить отношения между Bok- и Mcl1/Bcl2/BclX-подобными белками. В целом, набор Bcl2-подобных белков у губок выглядит значительно ограниченным. BH3-only-белки, по-видимому, представляют собой апоморфию Eumetazoa (их отсутствие характерно для губок и пластинчатых, но не стрекающих) [Lasi et al., 2010; Banjara et al., 2020]. Антиапоптотические Bcl2-подобные белки губок не обладают характерным BH4-доменом. Способ достижения пермеабилизации мембраны митохондрий у губок остается не вполне ясным, так как у исследованных губок присутствует лишь по одной копии Bax/Bak-подобных белков (при этом, белок L. variabilis предположительно относится к семейству Bax, а белок H. dujardinii – к семейству Bak). Стоит отметить, впрочем, что мыши, одиночно нокаутированные по Bak или Bax, демонстрируют нормальное развитие и, по-видимому, все еще способны поддерживать нормальный апоптоз [Carpio и др., 2015]. Многообещающим фактом также служит присутствие у губок Bok-подобных белков. Хотя точный механизм работы Bok остается не до конца исследованным, этот белок тоже участвует в пермеабилизации мембраны и не зависит от Bak и Bax [Einsele-Scholz и др., 2016]. Механизм регуляции этого процесса остается во многом не ясным, однако существуют работы, показывающие возможность сборки поры Bax/Bak в отсутствие BH3-only-белков [Zhang и др., 2016]. Дополнительно, были идентифицированы последовательности, связанные с центральным процессом митохондриального пути апоптоза – пермеабилизацией внешней мембраны митохондрий. Так, в транскриптомах исследуемых губок были обнаружены последовательности, кодирующие апоптоз-индуцирующий фактор (AIF) и белок-ингибитор апоптоза (IAP); при этом, активирующий IAP белок Smac/Diablo не был обнаружен ни у одного из видов. Доменная структура Leucosolenia AIF и Halisarca AIF полностью соответствует таковой для белка Mus musculus. IAP-подобные белки L. variabilis отличаются от таковых у позвоночных большим количеством BIR-повторов (четыре или пять против трех у Mus musculus) и отсутствием UBA-домена; впрочем, последний отсутствует также у IAP Drosophila melanogaster и, по-видимому, не является необходимым для функционирования белка. IAP-подобный белок H. dujardinii отличается наличием лишь двух BIR-повторов. Центральные участники апоптотического каскада, цистеиновые протеазы из семейства каспаз, также обнаруживаются у губок. Две последовательности H. dujardinii кодируют инициаторные каспазы с N-концевым Death effector domain (DED; потенциальные гомологи каспазы 8), одна последовательность – инициаторную каспазу с N-концевым CARD-доменом рекрутирования каспаз (потенциальная каспаза 9) и еще одна – каспазу только с С-концевым каталитическим доменом (потенциальная эффекторная каспаза 3/7). Для L. variabilis идентифицированы две последовательности, кодирующие CARD-каспазы, и семь последовательностей предположительных эффекторных каспаз; DED-каспазы для L. variabilis идентифицированы не были. Каспазы губок, похожие по доменной структуре на эффекторные каспазы 3/7, на филогенетическом дереве оказываются также внутри клады CARD-содержащих каспаз. DED-содержащие последовательности H. dujardinii и A. queenslandica принадлежат к группе каспаз 8; интересно, что некоторые последовательности L. variabilis (Leucosolenia CaspA1 и Leucosolenia CaspA2) и A. queenslandica (Amphimedon Casp) также относятся к этой же группе, хотя наличие DED-доменов для них не предсказывается. Так как эффекторные каспазы традиционно считаются ключевыми участниками апоптотического каскада – именно их работа приводит к деградации цитоскелета и ДНК – факт их отсутствия может показаться странным. Даже у базальных Eumetazoa – стрекающих – присутствуют функциональные эффекторные каспазы [Lasi, David, Böttger, 2010]. Однако, существуют примеры животных, у которых апоптотический каскад функционирует без канонических эффекторных каспаз – это Caenorhabditis elegans. Геном этого круглого червя содержит только одну функциональную апоптотическую каспазу CED-3, которая является CARD-содержащей каспазой и совмещает в себе функции как инициаторной, так и эффекторной каспазы [Conradt, Wu, Xue, 2016]. Некоторые CARD-содержащие каспазы позвоночных также демонстрируют схожий с эффекторными каспазами круг субстратов [Krumschnabel и др., 2009]. Это позволяет предположить, что деградация цитоскелета и ДНК может обеспечиваться у губок в условиях отсутствия канонических эффекторных каспаз. Вероятно, наблюдаемый в клетках губок сигнал CellEvent связан в первую очередь с работой именно CARD-каспаз. Низкая интенсивность окраски может быть связана с недостаточной специфичностью работы этих каспаз – CellEvent разработан как реагент для специфического выявления каспаз 3/7. Так как CARD-каспазы обычно действуют вместе с определенными адаптерными белками, было решено проверить наличие соответствующих кодирующих последовательностей у H. dujardinii и L. variabilis. В исследуемых транскриптомах отсутствуют последовательности, кодирующие ассоциированные с каспазами 2 типа белки – p53-индуцируемый белок с доменом смерти PIDD и каспаз-рекрутирующий белок с доменом смерти CRADD. В то же время, мы идентифицировали фактор активации апоптотических каспаз APAF1 – белок, участвующий в рекрутировании каспаз 9 типа и формировании т.н. апоптосомы. В случае H. dujardinii, доменная структура APAF1 оказывается нарушенной (отсутствуют CARD- и NB-ARC- домены); впрочем, эти домены предсказываются для APAF1 A. queenslandica. Наличие у APAF1 губок WD40-повторов представляется необычным в свете экспериментов по прижизненной окраске апоптоза: у C. elegans, в клетках которой апоптоз не зависит от пермеабилизации мембраны митохондрий, гомолог APAF1 лишен WD40-повторов [Lettre, Hengartner, 2006]. Впрочем, APAF1 D. melanogaster одновременно содержит WD40-повторы и формирует апоптосому без участия цитохрома С [Clavier и др., 2016]. Вероятно, похожая картина характерна для APAF1 губок. Одним из субстратов эффекторных каспаз является ингибитор апоптоз-зависимой эндонуклеазы ICAD, который в норме препятствует фрагментации ДНК апоптоз-зависимой нуклеазы CAD. В транскриптоме H. dujardinii, равно как и A. queenslandica, отсутствуют последовательности, кодирующие данные белки; у L. variabilis присутствуют неполные фрагменты CAD- и ICAD-подобные белков, но их доменная структура значительно нарушена. Так, у Leucosolenia CAD отсутствует необходимый для взаимодействия с ICAD CIDE-N домен. Тем не менее, для обоих видов мы идентифицировали транскрипты, кодирующие иной тип апоптоз-специфичных нуклеаз – ассоциированные с AIF EndoG/ExoG. Они демонстрируют типичную для подобных нуклеаз доменную структуру и расположение активных сайтов; однако, филогенетический анализ показывает, что исследуемые белки у губок значительно дивергировали относительно друг друга. Так, аминокислотная последовательность, полученная для H. dujardinii, относится к группе EndoG-белков, в то время как белки L. variabilis и A. queenslandica более близки к ExoG. Так как ExoG/EndoG по своей сути не зависят от работы каспаз [Cymerman и др., 2008], это может объяснять наблюдаемую нами низкую колокализацию сигналов CellEvent и TUNEL. В случае, когда деградация ДНК не зависит напрямую от работы каспаз, TUNEL-положительные клетки могут не содержать явного сигнала CellEvent. Суммируя все вышесказанное, набор белков-участников апоптотического каскада у губок значительно отличается от общепринятой модели. Тем не менее – и вопреки предыдущим предположениям – нет оснований утверждать, что какие-либо критические компоненты этого каскада у губок отсутствуют [Srivastava и др., 2010]. Наши экспериментальные и транскриптомные данные позволяют сказать, что апоптоз участвует в поддержании тканевого гомеостаза у губок. Точный механизм функционирования апоптоза и взаимодействия между его основными участниками, впрочем, остается многообещающей темой для дальнейших исследований. Можно, однако, предполагать, что на примере губок мы столкнулись с некоторым минимальным – предковым – набором белков, необходимых для реализации апоптоза. Дальнейшая эволюция этого каскада, вероятно, была направлена на увеличение общей стабильности процесса через экспансию некоторых белковых надсемейств (Bcl2, каспазы), появление белков с частично перекрывающимися функциями (Bcl2, каспазы и нуклеазы) и новых регуляторных петель (BH3-only белки). Заключение Фундаментальное значение полученных результатов во многом обусловлено филогенетическим положением губок. Поскольку губки представляют собой одну из базальных ветвей многоклеточных животных, данные о динамике их тканей представляют особый интерес в сравнительном аспекте. Тем не менее, подобные исследования проливают свет и на биологию самих губок. Выявление хоаноцитов как основной фракции пролиферирующих клеток в интактных тканях губок из двух классов, Demospongiae и Calcarea, поднимает ряд существенных вопросов о механизмах поддержания тканевого гомеостаза у губок и устройства системы стволовых клеток у этой базальной эволюционной линии животных. Опыты с отслеживанием судьбы потомков пролиферирующих хоаноцитов показывает, что пролиферация этих клеток вносит вклад не только в обновление самой хоанодермы, но и дает начало клеткам из других слоев тела губки. Это указывает, что хоаноциты могут являться ведущим типом стволовых клеток у губок, поддерживая возобновление и рост тканей посредством дифференцировки их потомков. Такой взгляд на систему стволовых клеток губок существенно отличается от доминирующей сейчас точки зрения, где основным типом стволовых клеток считаются подвижные клетки мезохила - археоциты. Дальнейший интерес теперь представляет описание молекулярных механизмов поддержания стволового состояния и регуляции пролиферации хоаноцитов, что позволит разрешить вопрос об устройстве системы стволовых клеток у губок и выявить эволюционно консервативные механизмы, лежащие в основе пролиферации и дифференцировки клеток. Выявленные в интактных тканях исследуемых губок апоптотические клетки, будучи относительно редкими, тем не менее, указывают на эволюционно консервативную роль апоптоза в поддержании тканевого гомеостаза. Прижизненные исследования апоптоза указывают на потенциальные особенности его функционирования у губок (в частности, на возможную независимость апоптоза от трансмембранного потенциала митохондрий). Проведенные in silico исследования компонентов апоптотического каскада показали, что набор белков-участников апоптотического каскада у губок значительно отличается от общепринятой модели. Вероятно, губки содержат минимальный, предковый, набор компонентов апоптотического каскада. Точный механизм развития апоптоза в клетках губок, и взаимодействия между основными белками-участниками каскада является многообещающей темой для дальнейших исследований, которые могут пролить свет на эволюционные истоки апоптоза и пути его эволюции в линии многоклеточных животных. По результатам выполнения проекта опубликовано 2 статьи международных научных журналах, индексируемых в WoS и Scopus; результаты представлены в 6 докладах международных и всероссийских конференциях.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".