Молекулярные основы редких неврологических заболеваний, обусловленных мутациями пиридоксальфосфат- и тиаминдифосфат-связывающих белков.НИР

Molecular basis of rare neurological disorders caused by mutations in the pyridoxal-5'-phosphate- and thiamine-diphosphate-binding proteins

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 28 января 2021 г.-2 февраля 2022 г. Молекулярные основы редких неврологических заболеваний, обусловленных мутациями пиридоксальфосфат- и тиаминдифосфат-связывающих белков.
Результаты этапа: В ходе выполнения первого этапа проекта нами была апробирована экспериментальная модель неврологических нарушений при ингибировании пируватдегидрогеназы и 2-оксоадипатдегидрогеназы (ОАДГ) фосфонатными аналогами пирувата и 2-оксопимелата, соответственно. Полученные данные показывают, что наиболее выраженные отклонения физиологических параметров от контрольных наблюдаются при интраназальном введении мембранопроницаемого предшественника ингибитора ОАДГ - триэтилового эфира адипоилфосфоната. Предполагаемый в дальнейшем анализ биохимических параметров мозга экспериментальных животных покажет, связано ли отсутствие наблюдаемых физиологических изменений при ингибировании пируватдегидрогеназы с компенсаторными ответами метаболической сети на биохимическом уровне, в частности, с компенсаторным ростом активности фермента в результате его дефосфорилирования. В 2021 г. были установлены особенности регуляции тиамином пиридоксалькиназы и известных у человека вариантов данного фермента, продемонстрировано влияние введения крысам тиамина на суточную регуляцию активности пиридоксалькиназы и экспрессию связанных с суточными ритмами киназ в мозге (Bunik et al., 2022). Структурно-функциональный анализ известных мутаций в гене DHTKD1 человека выявил мутации, действие которых на развитие неврологических симптомов при болезни Шарко-Мари-Тута и эпилептических судорогах может быть витамин-зависимым. Ввиду близости мутаций V360A, L697R и R715C к сайту связывания тиаминдифосфата можно ожидать, что терапия высокими дозами витамина B1 или его фармакологических производных приведет к ослаблению неврологических симптомов у пациентов с такими мутациями. В ходе дальнейшего исследования по проекту предполагается получить все рекомбинантные компоненты полиферментного комплекса ОАДГ и реконструировать из них активный полиферментный комплекс. В результате будет разработана система, позволяющая проверять предсказанную функциональную роль мутаций ОАДГ in vitro с помощью экспрессии мутантных форм ОАДГ. Мы показали, что активность изолированной ОАДГ слишком низка для достоверной детекции ее изменений как в системе с искусственными акцепторами электронов, так и методом кругового дихроизма. На основе наших экспериментов по термокалориметрии экспрессированной ОАДГ и ранее проведенных исследований гомологичных ОАДГ ферментов можно предположить, что низкая активность связана с малой стабильностью рекомбинантного фермента в отсутствие гетерологических взаимодействий с компонентами комплекса. Таким образом, биологически значимые функциональные исследования ОАДГ требуют включения фермента в состав полиферментного комплекса. С целью разработки методов анализа образцов крови человека на потенциальные маркеры мутаций исследуемых ферментов в 2021 г нами был произведен сбор биологических образцов пациентов с неврологическими патологиями, а также контрольных образцов. Были отработаны и оптимизированы протоколы забора и хранения крови, методы пробоподготовки и анализа уровней НАД+ и белков, связывающих тиаминдифосфат и пиридоксальфосфат, функция которых может нарушаться при патологии Шарко-Мари-Тута и витамин-зависимых эпилепсиях. На последующих этапах проекта предполагается дальнейшее накопление биоматериала и количественный анализ изучаемых маркеров для вывода об их диагностическом потенциале.
2 12 мая 2022 г.-12 января 2023 г. Молекулярные основы редких неврологических заболеваний, обусловленных мутациями пиридоксальфосфат- и тиаминдифосфат-связывающих белков.
Результаты этапа: В ходе выполнения проекта в 2022 г. были охарактеризованы биохимические индикаторы нейропатологий в животных моделях и в крови человека, изучены их изменения по сравнению с контрольной группой, кардиопациентами и при терапевтическом воздействии введения витамина В1: 1 Определили достоверное падение уровня низкомолекулярной формы ОАДГ у неврологических и кардиологических пациентов по сравнению с соответствующими возрасту контрольными группами. 2. Обнаружили одновременные уменьшения экспрессии ОАДГ и уровня НАД+ в крови человека и положительную корреляцию между содержанием ОАДГ и НАД+ в крови неврологических пациентов до витаминотерапии. Введение высоких доз тиамина у неврологических пациентов вызывало рост ОАДГ и исчезновение корреляции. Таким образом, мы показали сопряженные изменения ОАДГ и НАД+. 3. Количественный анализ ПЛФ-зависимых ферментов в крови человека показал, что по сравнению с контролем в группе кардиологических пациентов уровень ПНФО повышается, а ПЛК – понижается. Аналогичные изменения у неврологических пациентов менее выражены: статистическая значимость наблюдается лишь для повышения ПНФО по сравнению с контролем. Существенно, что уровни ПЛК в крови значимо отличаются у мужчин и женщин
3 3 февраля 2023 г.-2 февраля 2024 г. Молекулярные основы редких неврологических заболеваний, обусловленных мутациями пиридоксальфосфат- и тиаминдифосфат-связывающих белков.
Результаты этапа: Проведенные нами в ходе выполнения проекта энзимологические, биоинформатические и клинические исследования позволили углубить понимание соотношения структуры и функции ПЛФ-зависимых, создать новые и/или применить уже имеющиеся животные модели БШМТ и эпилепсии для изучения механизмов и разработки терапий данных заболеваний, предложить новые диагностические подходы для понимания механизмов и характеристики терапевтических эффектов в БШМТ, а также апробировать терапевтическое действие витаминов В1 и В6 в целевых невропатологиях. Так, в клинике был апробирован основанный на сделанных нами теоретических предсказаниях подход к терапии БШМТ витамином В1. Мы показали улучшение мышечной силы сгибателей рук и неврологического статуса при ежедневном оральном введении 100 мг витамина В1 или 200 мг сульбутиамина. Поскольку БШМТ - это группа заболеваний, при которых поражаются двигательные и/или сенсорные периферические нервы, что приводит к мышечной слабости и атрофии, а также к потере чувствительности, данный результат хорошо согласуется с известным действием тиамина при невропатологиях, сопровождающихся митохондриальной дисфункцией. Кроме того, поскольку ТДФ является активатором пируватдегидрогеназы (ПДГ) и ингибитором киназы данного фермента, введение тиамина (витамина В1) может быть формой терапевтического лечения пациентов с заингибированной ПДГ. Ингибирование ПДГ наблюдается как при вызывающих БШМТ мутациях ПДГ или ее киназы, так и в результате дисфункции митохондрий, вызванной другими мутациями, ведущими к БШМТ. В результате проведенной работы показано, что диагностика путем иммунохимического определения митохондриальных ТДФ-зависимых дегидрогеназ в крови человека сопряжена со значительными трудностями. Во-первых, основная масса клеток крови - не содержащие ядер и митохондрий эритроциты, поэтому для детекции митохондриальных дегидрогеназ, которые по последним данным также могут быть локализованы в ядрах, требуется концентрация белкового содержимого образцов крови. Во-вторых, солюбилизация белков из концентрированных метанол-уксусных осадков белков крови для иммунохимического анализа уменьшается при хранении осадков, что затрудняет получение сходимых результатов. В-третьих, результаты тестирования специфичности коммерческих антител к целевым белкам в крови у производителей не представлены, а по нашим данным наиболее представленные полосы ТДФ-зависимых дегидрогеназ пирувата и 2-оксодипата, определенных этими антителами в осадках белков крови, обладали нехарактерными для белков молекулярной массой. Несмотря на завышенную массу ПДГ (около 50 кДа), определенную с использованием антител как на ПДГ, так и на ее фосфо-форму, были получены интересные результаты по гендерным различиям в фосфорилировании ПДГ, соответствующие известной из животных экспериментов зависимости экспрессии киназы ПДГ. Для известной изоформы ОАДГ 130 кДа был показан рост экспрессии в крови пациентов в ответ на оперативное вмешательство. Однако основные иммунореактивные полосы в данном случае были на уровне 50 и 36 кДа. В качестве альтернативных индикаторов тиамин-зависимого метаболизма в крови человека мы использовали активность цитозольного ТДФ-зависимого фермента – транскетолазы – и уровень коферментной формы тиамина – ТДФ. Определение данных индикаторов было успешно применено для оценки терапевтического эффекта витамина В1 у пациентов с БШМТ и его молекулярных механизмов. При характеристике ПЛФ-зависимых ферментов найдены потенциальные участки структуры для передачи активного альдегида ПЛФ от ферментов его синтеза к ферментам, использующим ПЛФ в качестве кофермента, и охарактеризована регуляция пиридоксалькиназы тиамином и его производными. Полученные данные применены при разработке терапевтического подхода к коррекции изменений метаболизма мозга, возникающих после судорог, с помощью комбинированного введения витаминов В1 и В6. Разработанная в животной модели схема введения витаминов В1 и В6 показала корректирующее действие витаминов на изменяющиеся вследствие судорог витамин-зависимые процессы, зависимые от 2-оксоглутаратдегидрогеназного комплекса, транскрипционного регулятора р53 и сиртуинов 3 и 5. Таким образом, при реализации проекта получены новые данные о роли витамин-зависимых ферментов и витаминов В1 и В6 в развитии и терапии патологических состояний. На этой основе предложены и реализованы подходы к терапии витамином В1 БШМТ в клинике.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".