ИСТИНА

В рамках проекта планируется создание флуоресцентных зондов нового типа для количественного определения тиолов различного строения и происхождения. Ключевая особенность таких зондов состоит в использовании четвертичного катиона N-арил-DABCO в качестве электрофильного реакционного центра (платформы) для ковалентного связывания группы SH в результате раскрытия гетероциклического фрагмента DABCO. Для достижения этой цели планируется решение следующих задач: 1. Провести дизайн флуоресцентных зондов на основе замещенных кумаринов, нафталимидов и дицианометилен(бензо)пиранов в качестве флуорофоров. 2. Осуществить синтез нескольких представителей каждого ряда флуоресцентых красителей указанных в п.1, содержащих ключевой фрагмент четвертичного аммониевого катиона N-арил-DABCO и другие заместители различной электронной природы. 3. Изучить реакционную способность синтезированных соединений по отношению к тиолам различного строения, в том числе аминокислотам, пептидам, олигонуклеотидам и лекарственным препаратам, содержащим SH-группу. Определить селективность реакции в присутствии других нуклеофильных функциональных групп. 4. Детально изучить спектральные свойства синтезированных флуоресцентных зондов и продуктов их реакций с тиолами. 5. Провести анализ структура – свойство для серии синтезированных соединений. 6. Провести исследования наиболее эффективных флуоресцентных зондов в условиях, близких к физиологичеким.

Fluorescent probes are widely used as a tool for solving important problems in biomedical and environmental research, including the diagnosis of various diseases and the determination of environmental pollution. In the project, it is planned to design, synthesize, and a detailed study of the physico-chemical properties and reactivity of the novel fluorescent reagents (probes), comprising a fluorescent dye moiety and a quaternary N-(het)aryl-DABCO cation as an electrophilic platform for conjugation to different SH-containing analytes, including drugs, bithiols, peptides, proteins, oligonucleotides, and antibodies. This type of electrophilic pratform has never been used before for the development of fluorescent probes. Featured earlier by the authors of the Project, high reactivity of N-(het)aryl-DABCO salts toward S-nucleophiles, their easy solubility in water, as well as the solubility of the resulted N-arylpiperazines at physiological pH values, suggest a number of advantages of this novel electrophilic platform compared to those previously reported.

В результате проведенного исследования будут получены флуоресцентные реагенты нового типа, ключевой особенностью которых является беспрецедентная электрофильная платформа – катион N-(гет)арил-DABCO. Полученные результаты имеют высокую прикладную значимость, поскольку могут быть использованы для создания новых флуоресцентных реагентов для связывания тиолов для медицинской диагностики, биологических и аналитических исследований, отличающихся от применяемых в настоящее время более высокими показателями хемоселективности, биосовместимости, растворимости в водных средах, а также дешевизной получения. Результаты выполнения проекта могут быть востребованы при создания диагностических тест-реагентов для медицинского, биологического, аналитического, экологического применения, а также реагентов для визуализации биоматериалов в медицинской диагностике и проведении медицинских исследований.

Разработанные впервые в лаборатории авторов проекта методы синтеза четвертичных солей N-арил-DABCO основаны на арилировании sp3-гибридного атома азота 1,4-диазобицикло[2.2.2]октана трифлатами арил(мезитил)иодония. Аналоги таких четвертичных аммониевых солей могут быть также получены при реакции DABCO с активированными электрофильными реагентами N-оксидами пиридинов и хинолинов. Реакции N-(гет)арил-DABCO проходят с раскрытием цикла и образованием N-арилпиперазинов; ранее было установлено, что наиболее легко этот процесс осуществляется для S-нуклеофилов. Тиолы различного строения реагируют уже при комнатной температуре в слабощелочных средах, в то время как другие нуклеофилы (амины, спирты, фенолы и др.) требуют более жестких реакционных условий.

В ходе выполнения проекта был осуществлен дизайн и впервые получен ряд уникальных флуоресцентных зондов, включающих в свою структуру флуоресцентный краситель и четвертичный катион N-арил-DABCO непосредственно связанный с флуоресцентным красителем. Ранее не доступные к получению четвертичные соли N-арил-DABCO были впервые представлены в качестве высокоселективной сенсорной платформы для тиолов и селенолов. Для получения зондов применены стратегии арилирования третичного sp3-гибридного атома азота DABCO впервые полученными несимметричными солями иодония на базе флуоресцентных красителей и стратегия деоксигенативного С(2)-H аминирования N-оксидов азинов. Получены спектральные характеристики зондов и продуктов их реакций с S- и Se-нуклеофилами. Был выбран наиболее эффективный зонд на базе кумарина как флуоресцентного красителя, содержащий четвертичный катион DABCO в 7-м положении кумаринового кольца. Зонд обладает хорошей растворимостью в воде, низкой фоновой флуоресценцией (квантовый выход флуоресценции ~ 0.05%) и, что наиболее важно, демонстрирует высокую селективность к арилтиолам и селенолам по сравнению с их алифатическими аналогами и другими распространенными нуклеофилами. В реакции зонда с пара-тиокрезолом за счет селективного раскрытия кватернизированного кольца DABCO наблюдается значительное увеличение интенсивности флуоресценции (более чем в 1400 раз!), в результате чего образуется производное пиперазина с высоким квантовым выходом флуоресценции (~73%). Более того, зонд может быть применен не только для селективного обнаружения ароматических тиолов в среде с алифатическими, ароматических селенолов в среде с алифатическими, но и для обнаружения ароматических селенолов в среде тиофенолов. Кроме того, продемонстрирована стабильность зонда к наиболее часто используемым восстановителям дитиотреитолу (DTT) и трис(2-карбоксиэтил)фосфину (TCEP). Пределы обнаружения пара-тиокрезола и фенилселенида составили 22 нМ и 6 нМ соответственно.