ИСТИНА

Основным содержанием проекта является проведение фундаментальных исследований по влиянию разобщения дыхания и окислительного фосфорилирования на скорость образования активных форм кислорода, слияние и фрагментирование (динамику) митохондрий, индукцию апоптоза и митофагии, а также влияния окислительного стресса на развитие разнообразных патологий и старение организма. Также будут исследованы ранее синтезированные в нашей лаборатории митохондриально-направленные соединения, обладающие антиоксидантной активностью. Кроме того, планируется синтезировать новые митохондриально направленные соединения для индукции окислительного стресса в клетках, а также красители специфически измеряющие перекисное повреждение липидов митохондриальных мембран. Будет исследована возможная роль мягкого разобщения в реализации антиоксидантной активности данных соединений.

Во-первых, ожидаемым результатом проекта является разработка новых инструментов для изучения структуры и функции митохондрий, а именно - митохондриально-направленных соединений (измерительных зондов, антиоксидантов, ингибиторов ферментов, активаторов ионных каналов), разобщителей-протонофоров, ионофоров ит.д., изучение свойств этих соединений на модельных системах. Наиболее перспективными кандидатами являются катионные соединения – коньюгаты природных антиоксидантов стрифенилалкилфосфониевым катионом. Они избирательно электрофоретически накапливаются в митохондриях и, соответственно, их токсическое и иное действие на другие внутриклеточныемембраны резко ослаблено. Вторым ожидаемым результатом является изучение действия этих соединений на изолированные митохондрии животных и дрожжей, а также на клетки в культуре и на животных. Разработка методов профилактики и репарации окислительного повреждения митохондрий при помощи этих соединений, регулирующих уровень митохондриальных активных форм кислорода (мАФК). Третьим ожидаемым результатом является идентификация деталей механизмов эндогенных адаптивных клеточных сигнальных каскадов, направленных на защиту клетки от окислительного повреждения и идущих с участием митохондрий. Такие механизмы будут также изучены на моделях нейрологических патологий (ишемия и травма мозга,модели болезни Альцгеймера), что имеет очевидное практическое значение: разработка новых методов борьбы с соответствующими патологиями. Четвертым ожидаемым результатом является открытие новых естественных модуляторов энергетической функции митохондрий методом генетического скрининга на одноклеточных эукариотах. Еще одним ожидаемым результатом является детальное изучение изменения статуса митохондрий на всех стадиях патогенеза модели запрограммированной гибели. А именно, изучение функционирования митохондрий в их естественном окружении, то есть без их выделения из клетки; расшифровка эндогенных сигнальных систем защиты клетки с участием митохондрий, в частности антиишемической защиты.

Нами освоены и модифицированы для широкого круга тканей методы выделения митохондрии, определения активных форм кислорода, имеются наборы специфичных антител на анионные переносчики и разобщающий белок. Ранее нами были разработаны схемы получения гомогенных препаратов ряда ферментов, методы флюорометрического определения концентрации активных форм кислорода, определения величины мембранного потенциала митохондрий в различных энергетических состояниях с помощью сафранинового метода и тетрафенилфосфониевого электрода. За более чем 10 лет исследования структуры и функций контактных сайтов нами были предложены оригинальные методики их выделения (ионообменная хроматография и электрофоретическое разделение белковых комплексов в нативных условиях). Мы разработали способ определения функции белковых комплексов контактных сайтов по встраиванию их в бислойные липидные везикулы, нагруженные низкомолекулярными веществами, способными освобождаться при индукции неспецифической проницаемости. Кроме того, нами отработаны методы синтеза и очистки препаратов митохондриально-направленных соединений, а также широкий спектр методов по изучению протонофорной и антиоксидантной активности синтезированных соединений.

В 2016 году было показано, что разобщение митохондрий стимулирует не столько митофагию, сколько систему митохондриальных aaa-протеаз отвечающую за деградацию поврежденных органелл. При этом для выживания клеток при повреждении митохондрий необходима активация аутофагии, т.к. ингибирование аутофагии на стадии её инициации стимулирует гибель клеток с поврежденными митохондриями. Кроме того, были продолжены эксперименты с митохондриально направленным сенсором измеряющим перекисное окисление митохондриальных мембран – MitoBODIPY. Было показано, что данный краситель можно использовать для измерения степени окисленности митохондрий при окислительном стрессе и этот параметр хорошо коррелирует с последующей гибелью клеток. Митохондриально-направленные антиоксиданты оказались наиболее эффективным способом предотвратить окислительное повреждение митохондрий в условиях окислительного стресса.