ИСТИНА

В работах последнего десятилетия убедительно доказано, что аномальная устойчивость к программируемой гибели клеток (ПГК) является одним из главных признаков злокачественной трансформации клеток. Более того, установлена связь между формированием у опухолевых клеток резистентности к индукции апоптоза, одного из типов ПГК, и утратой ими чувствительности к действию химиотерапевтических препаратов. Достижения в раскрытии молекулярных механизмов, играющих ключевую роль в патогенезе онкологических заболеваний, стимулировали поиски и создание лекарственных препаратов для целевой, известной также под названием таргетной, терапии. Особое место среди них занимают препараты, основными мишенями действия которых служат гены, а также их продукты, регулирующие функционирование различных звеньев апоптоза. Реактивация апоптоза в опухолевых клетках с помощью целевой терапии открывает новые возможности в лечении онкологических заболеваний, поскольку цитотоксическое действие таких препаратов является высокоизбирательным (не повреждаются клетки нормальных тканей) и эффективным даже в случае опухолей, резистентных к химиотерапии. Тюдор cтафилококковая нуклеаза (TSN) является многофункциональным, высококонсервативным белком, который экспрессируют самые разнообразные организмы, находящиеся в эволюционном развитии достаточно далеко друг от друга. Было показано, что в растительных клетках этот белок является первым обнаруженным субстратом для фермента метакаспазы (Sundström, 2009). В последнее время активно изучается роль TSN в канцерогенезе. В Лаборатории исследования механизмов апоптоза была впервые показана роль TSN в регуляции апоптоза раковых клеток. В частности, было установлено, что сайленсинг TSN приводит к увеличению клеточной гибели при индукции цисплатином. С помощью анализа экспрессии генов и системно-биологического анализа нами были идентифицированны основные гены/белки-мишени TSN, такие как S100A11, BNIP3 и IGFBP2. Нами обнаружена цепь событий, включающая функцию не менее 3 белков (TSN, S100A11 и PLA2) и регулирующая зависимый от супероксидов апоптоз, который инициируется платино-содержащими химиотерапевтическими соединениями в клетках аденокарциномы легких (Zagryazhskaya, 2015). Цель настоящего Проекта – изучение роли TSN и ее белков-мишеней, таких как BNIP3 и IGFBP2, в регуляции механизмов апоптоза и изменении чувствительности раковых клеток к терапии. Развитие данного исследования, сфокусированное на идентификации новых взаимодействующих белков и целевых генов, может привести к появлению нового направления в терапии аденокарциномы легких.

В результате выполнения проекта будут получены новые научные данные о механизмах регуляции программируемой клеточной гибели в клетках аденокарциномы легких. В первый год будут получены данные о способности клеток аденокарциномы легких подвергаться программируемой гибели под действием различных агентов, вызывающих апоптоз, в том числе агентов вызывающих генотоксический стресс (платина-содержащие препараты). Будет установлено соотношение между экспрессией TSN, ВNIP3 и IGFBP2 и уровнем апоптоза в клетках аденокарциномы легких после воздействия химиотерапевтическими препаратами. Кроме того, будут получены данные об экспрессии вышеназванных белков в замороженных клетках, полученных от больных данной патологией (метод Вестерн Блоттинга и микроскопии). Во второй год будет оценен вклад белков регуляторов апоптоза, в частности TSN и ее мишеней (BNIP3 и IGFBP2), в развитие резистенности опухолевых клеток к химиотерапии. Для оценки роли TSN в нарушении механизмов клеточной гибели и химиорезистентности в клетках аденокарциномы легких (H23, A549, H661) мы будем регулировать уровень экспрессии TSN путем трансфекции соответствующими siRNA (siTSN#1; siTSN#2) для замалчивания генов или плазмидами, содержащими данный ген. После чего клетки будут подвергнуты воздействию химиотерапевтического агента. Использование производных платины является одним из наиболее распространённых подходов к лекарственной терапии аденокарциномы легких. Поэтому мы прежде всего используем цисплатин как модель химиотерапевтического воздействия для изучения роли TSN в развитии химиорезистентности. Для изучения роли белков-мишеней TSN (BNIP3 и IGFBP2) в индукции апоптоза и чувствительности к химиотерапевтическим агентам в клетках аденокарциномы будет изменен уровень экспрессии этих белков, используя siRNA технику или повышенную экспрессию плазмидами, содержащими данные гены. Уровень экспрессии будет контролироваться с помощью трансфекции scrambled nontargeting (si scr) конструктов. Используя совокупность методов (Вестерн Блоттинга, проточной цитометрии (величине суб-популяции SubG1) и морфологического контроля будет оценена чувствительность к программируемой гибели под действием различных агентов, вызывающих апоптоз, и агентов вызывающих генотоксический стресс (цисплатин и других) в трансфицированных и контрольных клеточных линиях рака легких (H23, A549, H661). Кроме того, индукция апоптотического ответа после 24-48 часов инкубации с агентами в вышеперечисленных клетках будет проанализирована in vitro с помощью высокочувствительных флуоресцентных методов детекции активности каспаз (основного семейства протеаз, регулирующих апоптоз) и расщепления их субстратов (ПАРП и Ламин). В заключении проекта будут идентифицированы новые регуляторные взаимодействия генов/белков, вовлеченных в регуляцию механизмов устойчивости и перспективных для терапии этих социально значимых онкопатологий. Все предполагаемые данные являются оригинальными и дадут возможность расширить знания по возможным механизмам химиорезистентности и клеточной гибели. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых подходов в персонифицированной медицине.

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) число онкологических заболеваний во всем мире, в том числе и в России, стремительно увеличивается. Несмотря на успехи медицины в настоящее время количество больных умирающих от рака и сердечно-сосудистых заболеваний, к сожалению, прочно занимает первое место. Последние достижения в изучении молекулярных механизмов, играющих ключевую роль в патогенезе онкологических заболеваний, привели к созданию лекарственных препаратов для целевой, или таргетной терапии. Особое место среди них занимают препараты, основными мишенями действия которых служат гены, а также продукты этих генов, регулирующие функционирование различных звеньев программируемой гибели клеток. Реактивация апоптоза (одного из типов программируемой гибели клеток) в опухолевых клетках с помощью целевой терапии открывает новые возможности в лечении онкологических заболеваний различных органов и тканей, поскольку цитотоксическое действие таких препаратов является высокоизбирательным (не повреждаются клетки нормальных тканей) и эффективным даже в случае опухолей, резистентных к химиотерапии. Кроме того, реактиваторы апоптоза могут применяться в сочетании с широко используемыми противоопухолевыми средствами, существенно усиливая их цитотоксическое действие.

Устойчивость к апоптозу является одним из главных признаков злокачественной трансформации клеток. В нашей лаборатории была впервые показана роль TSN в регуляции апоптоза раковых клеток (Zagryazhskaya A, 2015). В частности, было установлено, что сайленсинг TSN приводит к увеличению клеточной гибели при индукции цисплатином. С помощью анализа экспрессии генов и системно-биологического анализа нами были идентифицированны основные гены/белки-мишени TSN, такие как S100A11, BNIP3 и IGFBP2. Нами обнаружена цепь событий, включающая функцию не менее 3 белков (TSN, S100A11 и PLA2) и регулирующая зависимый от супероксидов апоптоз, который инициируется платино-содержащими химиотерапевтическими соединениями в клетках аденокарциномы легких (Zagryazhskaya, 2015). Цепь событий вовлекающих TSN, BNIP3 и IGFBP2 в регуляцию механизмов апоптоза клеток аденокарциномы легких, и их роль в преодолении развитии химиорезистентности данного типа опухолей совершенно неизвестны. BNIP3 относится к группе “BH3-only” семейства белков-медиаторов апоптоза BCL-2BNIP3 экспрессируется и накапливается в клетках при гипоксии, а активируется при понижении внутриклеточного рН во время ацидоза, вызванного переходом клетки на гликолиз вследствие нехватки кислорода. Наиболее изученный случай подобного действия BNIP3 наблюдается при инфаркте миокарда в тканях сердца. Кроме того, интересен механизм действия BNIP3 на молекулярном уровне, так как он достаточно специфичен. Несмотря на принадлежность к семейству BCL-2, этот белок вызывает каспазо-независимый апоптоз, иногда с признаками некроза (Vijayalingam, 2010). IGFBP представляют собой группу факторов роста, которые структурно похожи на инсулин. IGFBP1 и IGFBP2 являются мощными митогенными факторами для клеток многих злокачественныхопухолей, в т.ч. для рака эндометрия, кроме того,они оказывают антиапоптотический эффект (Pennisi et al., 2002). C помощью технологии CRISPR/Cas9 мы получили клеточные линии аденокарциномы легкого нокаутные по белкам TSN (A549 TSNKo), IGFBP2 (A549 IGFBP2Ko) и BNIP3 (A549 BNIP3Ko). Уровень экспрессии TSN IGFBP2 и BNIP3 в клеточной линиии A549 и нокаутных линиях, был оценен методом Вестерн Блоттинг. Все данные были также подтверждены используя siRNA технику для замалчивания генов. Нами были получены данные о способности клеток аденокарциномы легких подвергаться программируемой гибели под действием различных агентов, вызывающих апоптоз, в том числе агентов вызывающих генотоксический стресс (платина-содержащие препараты). Анализ гибели клеток на проточном цитометре с помощью методики по величине суб-популяции SubG1 после 24 часов обработки цисплатином показал усиление чувствительности к этому химиотерапевтическому препарату в линиях клеток немелкоклеточного рака легких нокаутных по белкам TSN и BNIP3. Этот эффект был нивелирован при действии комбинации игибиторов аутофагии (Пепстатин и Е64d) с цисплатином по сравнению с действием только цисплатина. Сходные данные были получены с помощью метода вестерн-блоттинга – наблюдалась увеличение расщепления PARP в линиях нокаутных по TSN и BNIP3. В то время как добавление ингибиторов аутофагии в значительной мере нивелировало данный эффект. Анализ белка-маркера аутофагии LC3 выявил, что клетки А549 имеют низкий базальный уровень экспрессии данного белка, который не меняется после индукции цисплатином. А549 нокаутные по TSN также имеют низкий базальный уровень экспрессии LC3. Выключение BNIP3 в клетках А 549 привело к увеличению базального уровня и накоплению второй формы LC3. Полученные данные внесут вклад в понимание механизмов апоптоза и взаимодействия с другими типами клеточной гибели, такими как аутофагия, что имеет важнейшее значение для борьбы с онкологическими заболеваниями.