ИСТИНА

Проект нацелен на развитие технологии направленной доставки противоопухолевых препаратов при совместном использовании кремниевых наночастиц и высокочастотного ультразвука, вызывающего активацию и локальное высвобождение высокомолекулярных лекарственных препаратов в опухолевой ткани. В настоящее время созданы высокоэффективные лекарственные препараты для лечения определенных видов рака. Такие лекарства представляют собой высокомолекулярные соединения массой в несколько миллионов Дальтон, и их проникновение через клеточную мембрану опухолевой клетки крайне затруднительно. Именно поиск повышения эффективности доставки высокомолекулярных лекарств в клетку становится одной из самых актуальных задач в современной фармацевтике. Сочетание кремниевых наночастиц с ультразвуком позволит продвинуться в решении этой проблемы. Особенностью кремниевых наночастиц является их полная биосовместимость и способность выводиться из организма естественным путем. Наличие развитой поверхности обеспечивает зародышевую концентрацию газа в микропорах, что позволяет использовать их для существенного снижения порога акустической кавитации в тканях организма. Частицы нанометровых размеров накапливаются в тканях опухоли естественным путем, проникая через поры в кровеносных сосудах злокачественных опухолей, размер которых колеблется от 100 до 300 нм. Обеспечение адресности доставки лекарства можно повысить за счет конъюгации антител, специфичных к антигенам, присутствующим в избыточном количестве на поверхности определенных типов раковых клеток и клеток сосудистой сети. Проникновение лекарств в клетку затруднено за счет наличия барьера в виде клеточной мембраны. Для доставки лекарства в клетку и преодоления барьера наночастицы облучаются ультразвуком с амплитудой давления, превышающей порог инерционной кавитации. Схлопывание пузырька вблизи мембраны вызывает микропотоки и сдвиговые смещения, что существенно снижает барьер и позволяет лекарствам внедряться внутрь клетки. Поскольку процесс достаточно быстрый, то разрушения клетки не происходит. При определенных режимах ультразвукового воздействия возможно непосредственное разрушение опухолевой клетки – этот процесс носит название гистотрипсия. В рамках данного проекта планируется использовать ультразвук, интенсивность которого не превышает терапевтические нормы. Для решения поставленной проблемы в рамках проекта планируется решение конкретных задач, связанных с созданием наноконтейнеров с лекарствами, активации кремниевых наноконтейнеров ультразвуком с целью высвобождения и последующей доставки лекарств в опухолевую клетку: 1. Создание наноконтейнеров для переноса противоопухолевых препаратов на основе биосовместимых и биодеградируемых наночастиц пористого кремния с селективно модифицированной (частично гидрофильной, частично гидрофобной) поверхностью; 2. Обеспечение адресности доставки лекарства за счет конъюгации антител, специфичных к антигенам, присутствующим в избыточном количестве на поверхности определенных типов раковых клеток и клеток сосудистой сети и соединительнотканной структуры опухоли; 3. Разработка методики инициирования направленного выхода лекарства из наноконтейнеров с помощью высокочастотного ультразвука. Разработка технологии изготовления частиц, обеспечивающих минимальный порог кавитации. Изучение влияния формы поверхности, смачиваемости и пористости на порог кавитации. 4. Изучение эффективности доставки лекарств в клетки в экспериментах in vitro. Оптимизация параметров ультразвука для обеспечения максимальной эффективности. 5. Подготовка протокола для проведения исследований на животных in vivo. Проведение эксперимента на модельных опухолях. Разработка рекомендаций по созданию наноконтейнеров и аппаратного комплекса для клинических испытаний. Научная новизна в решении заявленной проблемы состоит в использовании уникальных свойств кремниевых наночастиц и их способности снижать порог акустической кавитации за счет накопления нанопузырьков на пористой поверхности. Это позволяет применять ультразвук, интенсивность которого не превышает допустимые терапевтические уровни. Планируется изучить все аспекты взаимодействия ультразвука с пористыми кремниевыми наночастицами и оптимизировать как параметры ультразвука, так и свойства наночастиц с целью получения максимальной эффективности доставки лекарств

The project is aimed at the development of the technology of targeted delivery of antitumor drugs under the combined effect of silicon nanoparticles and high-frequency ultrasound, which causes the activation and local release of macromolecular drugs in the tumor tissue. To the moment, highly effective medicines have been developed to treat certain types of cancer. Such drugs are high molecular compounds with a molecular weight up to several million daltons, so their penetration through the membranes of tumor cells is extremely difficult. It is discovering of ways to increase the efficiency of delivery of macromolecular drugs into the cell which becomes one of the major challenges in the modern pharmaceutical industry. The combination of silicon nanoparticles with ultrasound will allow a progress in solving this problem. An outstanding feature of silicon nanoparticles is their full biocompatibility and ability to be excreted by natural mechanisms. The presence of a developed surface provides a nucleation gas concentration inside the pores, which allows their usage for significant reduction of the acoustic cavitation threshold in the body tissues. Nanoscale particles accumulate in tumor tissues in a natural way by penetrating through pores in the blood vessels of malignant tumors, the size of which ranges from 100 to 300 nm. The targeting of drug delivery can be enhanced by the conjugation of antibodies specific to antigens present in excess amounts on the surface of certain types of cancer and vasculature cells. The penetration of drugs into the cell is difficult due to the presence of a barrier in the form of cell membrane. To achieve drug delivery into the cell and overcome the barrier, nanoparticles can be exposed to ultrasound with a pressure amplitude exceeding the threshold of inertial cavitation. Bubble collapse in the vicinity of membrane causes microflows and shear displacement, which significantly lowers the barrier and allows the drugs to introduce into the cell. Since the process is quite fast, the cell destruction does not occur. Certain modes of ultrasonic exposure may cause the destruction of tumor cells - a process known as histotripsy. The project is aimed at the usage of ultrasound, the intensity of which does not exceed the therapeutic standard. To solve the main problem, the project implementation will address certain problems related to the fabrication of silicon-based drug nanocontainers and activation of the nanocontainers with ultrasound to subsequently deliver and release drug in the tumor cell: 1. Fabrication of nanocontainers for the antitumor drug delivery based on the biocompatible and biodegradable porous silicon nanoparticles with selectively modified (partially hydrophilic, partially hydrophobic) surface; 2. Targeting of the drug delivery due to the conjugation of antibodies specific to antigens present in excess amount on the surface of certain types of cancer, stroma and vasculature cells; 3. Development of technique for the initiation of direct drug release from nanocontainers using a highintensity ultrasound. Development of fabrication technique of nanoparticles providing the minimal cavitation threshold. Investigation of influence of surface smoothness, wettability and porosity on the cavitation threshold. 4. Investigation of the efficiency of drug delivery into the cells in the in-vitro experiments. Optimization of the ultrasound exposure parameters to provide the peak efficiency. 5. Preparation of protocols for the conduction of in-vivo experiments. Carrying out experiments with model tumors. Development of recommendations on the fabrication of nanocontainers and hardware for the clinical trials. The scientific novelty in solving the claimed problem is in the usage of unique properties of silicon nanoparticles and their ability to reduce the threshold of acoustic cavitation due to the accumulation of nanobubbles on a porous surface. This allows the use of ultrasound, the intensity of which does not exceed the permissible therapeutic levels. It is planned to study all aspects of interaction between ultrasound and porous silicon nanoparticles and optimize both the parameters of ultrasound and properties of the nanoparticles in order to maximize the efficiency of drug delivery

1. Разработка наноконтейнеров на основе селективно модифицированных наночастиц мезопористого кремния. Изучение структурных и физико-химических свойств поверхности полученных образцов с помощью методик электронной микроскопии, динамического светорассеяния, ИК-спектроскопии. 2. Покрытие наночастиц FITC-модифицированным декстраном и конъюгация антител на поверхности наночастиц. Покрытие наночастиц термочувствительным полимером. Изучение полученных образцов методами ИК-спектроскопии и термогравиметрии. Проверка конъюгации антител на поверхности наночастиц с помощью иммуноферментного анализа. 3. Загрузка доксорубицина и оптимизация полученных наночастиц для достижения лучших показателей загрузки и выгрузки препарата в модельных биологических жидкостях (фосфатном буфере). 4. Проверка проникновения наноконтейнеров в раковые клетки с помощью конфокального микроскопа in vitro. Оценка первичной цитотоксичности. 5. Численное моделирование эффектов гипертермии и акустической кавитации в водных суспензиях твердотельных пористых наночастиц, индуцируемых ультразвуком мегагерцового диапазона частот. Расчет коэффициента поглощения ультразвуковой энергии в суспензиях при различных частотах, интенсивностях ультразвука, размерах и концентрациях наночастиц. Моделирование динамики развития пузырька воздуха из пор наночастиц в зависимости от размера пор, начального размера газового пузырька, служащего зародышем кавитации, и частоты волны. Определение резонансного размера пузырька и порогового давления, необходимого для развития активной кавитации. Расчет радиационной силы и закона смещения наночастиц. 6. Комплектование и сборка экспериментальной установки для измерения нагрева и порогов акустической кавитации по кавитационному шуму и амплитуде субгармоники в водных суспензиях селективно модифицированных наночастиц мезопористого кремния и полимерных фантомах. Написание программ управления экспериментом с использованием пакета Labview для обеспечения автоматизированной записи измеряемых параметров.

Руководитель проекта проф. В. Ю. Тимошенко является признанным специалистом в области синтеза и исследования полупроводниковых наноструктур для оптоэлектроники, фотоники и биомедицины. Членами научной группы, в которую входят асп.А. П. Свиридов, асп. К. П. Тамаров и другие участники завки, было впервые обнаружено свойство сенсибилизации действия ультразвука (УЗ) кремниевыми наночастицами. In vitro продемонстрировано уничтожение раковых клеток сочетанным действием кремниевых наночастиц и УЗ. Был получен патент РФ «Способ усиления действия ультразвука при лечении гипертермией опухолевых тканей путем использования нанокластеров кремния», № 2447915, 2012 г. Были разработаны методика формирования кремниевых наночастиц, методика диагностики нанобиосистем, методика проведения исследований полученных наночастиц (ГК № 16.513.12.3010, «Разработка метода получения водных суспензий кремниевых наночастиц для использования в условиях высокочастотной колебательной активации», 2011-2012 гг.). Сконструированы и введены в эксплуатацию экспериментальные установки для формирования кремниевых наночастиц методами электрохимического травления, механического измельчения, которые дали возможность получать порошки и водные суспензии нанокристаллов кремния с размерами от 10 до 100 нм. Первым в России представленный научный коллектив освоил методику получения массивов кремниевых нанонитей, а также показал возможность получения из них низкотоксичных фотолюминесцентных кремниевых наночастиц (ФЦП «Научные и научно- педагогические кадры инновационной России», № 8737, «Изучение закономерностей формирования, физико-химических свойств и биосовместимости водных суспензий кремниевых нанонитей для медицинских применений», 2012-2013 гг.). Был получен патент РФ «Способ получения водной суспензии биосовместимых пористых кремниевых наночастиц» № 2504403, 2014 г. Были освоены методики покрытия кремниевых наночастиц полисахаридами и биополимерами

Впервые применен и развит новый метод синтеза селективно модифицированных наночастиц мезопористого кремния для изготовления твердотельного соносенсибилизатора с контролируемыми структурными и физико-химическими свойствами. Гидрофобные поры содержат пузырьки воздуха, которые будут служить зародышами акустической кавитации, снижая пороги последней. К гидрофильной внешней поверхности наночастиц конъюгированы биосовместимые полимеры, которые помогают стабилизировать суспензии наночастиц в биологических жидкостях, а также повысить время нахождения соносенсибилизатора в организме. Наночастицы загружены противоопухолевыми препаратами. Конъюгация антител на поверхности наночастиц обеспечивает адресную доставку препарата к раковым клеткам. Дополнительно произведено покрытие наночастиц термочувствительным полимером, что позволяет провести исследование возможности температурно-контролируемого выхода препарата при инициировании гипертермии ультразвуковым излучением. Проведено детальное теоретическое изучение трех эффектов, связанных с воздействием ультразвука на твердотельную частицу: вязкое поглощение и переход энергии в тепло, кавитация, обусловленная ростом газового пузырька из пор на поверхности частицы, и радиационное давление на частицу. Дана оценка коэффициентов и сечения поглощения УЗИ в суспензиях твердотельных частиц в зависимости от частоты, интенсивности УЗИ, размера и концентрации частиц. Впервые применено уравнение Гилмора-Акуличева для описания динамики развития воздушного пузырька из поры наночастицы. Рассчитана сила радиационного давления на частицу в поле ультразвуковой волны и найдена амплитуда смещения частицы. Создана оригинальная установка для измерения нагрева суспензий наночастиц с использованием высокочувствительных термопар в поле свободного излучателя.Собрана установка для измерения порогов акустической кавитации по амплитуде субгармоники и интенсивности кавитационного шума в суспензиях селективно модифицированных наночастиц с использованием фокусированного ультразвука и миниатюрного гидрофона. Написана программа управления экспериментом с использованием пакета Labview для обеспечения синхронной генерации и приема сигналов, автоматизированной записи основных измеряемых параметров и анализа данных в режиме реального времени.