ИСТИНА

проект посвящён разработке и апробации нового метода функционального исследования белков, основанного на исследовании способности кристаллической формы белков связывать специально подобранные низкомолекулярные лиганды, представляющие собой основные клеточные метаболиты или их элементарные единицы. Данный метод также может быть применим в исследованиях, направленных на создание новых модуляторов (ингибиторов или активатор) белков, имеющих фармакологический или биотехнологический потенциал.

Для реализации настоящего проекта на 2012 год ставились следующие цели: 1.Осуществить экспрессию отобранных белков в бактериальной системе Escherichia col . 2. Нарастить биомассу, подобрать условия выделения и очистки рекомбинантных белков. 3. Провести эксперименты по подбору условий кристаллизации для отобранных объектов. 4. Проверить качество полученных кристаллов, осуществить сбор дифракционных наборов данных. 5. Разработать наборы коктейлей, содержащих структурные элементы (фрагменты) возможных природных метаболитов. 6. Провести подбор условий инкубации (настаивания) кристаллов в приготовленных коктейлях.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА Для упрощения процедуры выделения исследуемых рекомбинантных белков: гипотетической монооксигеназе Dr_2100 из Deinococcus radiodurans (3E8O), гипотетическом белке из Salmonella typhimurium LT2 Stm4435 (2Q02), гипотетической нуклеотидилтрансферазе Tm_1012 из Thermotoga maritimа (2FCL), а также в белке-шапероне DJ-1 (DJ-1) в их целевые гены с N-конца были введены гистидиновые таги и сайт расщепления TEV-протеиназы (высокоспецифичной протеиназы из вируса гравировки табака). Процесс выделения проводили с помощью высокоэффективной металлохелатной аффинной хроматографии на Ni2+-сефарозе с последующим отщеплением гис-тага при помощи TEV-протеиназы. Результатом проведенных работ стали целевые белки исследуемых ферментов не содержащие гистидиновый таг. Для гипотетической нуклеотидилтрансферазе Tm_1012 из Thermotoga maritimа по непонятным причинам не удалось отщепить гистидиновый таг и данный белок кристаллизовался с ним. В дополнение к металлохелатной хроматографии, для увеличения степени очистки белка, что особенно важно для кристаллизации, использовали гельфильтрационную хроматографию, во время которой белки переводили в буфер, содержащий небольшие количества 2-меркаптоэтанола иEDTA, что должно было способствовать повышению стабильности белка в процессе хранения и кристаллизации. Чистоту выделенных белков анализировали с помощью электрофореза в 12.5% ПААГ в денатурирующих условиях с последующим окрашиванием Кумасси G-250. Все белки обладали электрофоретическими подвижностями, соответствующими расчѐтным молекулярным массам, и имели чистоту не менее 98 %. Концентрацию очищенных белков определяли по методу Бредфорд. ПЕРВИЧНЫЙ СКРИНИНГ УСЛОВИЙ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ НАТИВНЫХ БЕЛКОВ Для кристаллизации исследуемых белков использовался гомогенный по данным электрофореза препарат с концентрацией 12 мг/мл. Состав белкового буфера был следующий: 20 мМ трис рН 8.0, 250 мМ хлорид натрия, 5% глицерин. Растворы белков центрифугировали непосредственно перед кристаллизацией на микроцентрифуге с охлаждением в течение 10 мин со скоростью 13400 об/мин для удаления инородных частиц и агрегатов. Первичный подбор условий кристаллизации белков исследуемых белков проводили методом диффузии в парах («сидячая капля») с использованием роботизированной системы кристаллизации «Rigaku» (Япония) с использованием коммерческих китов для первичного скрининга условий кристаллизации глобулярных белков компании Hampton Research: Crystal Screen HT, Crystal Screen Cryo HT, Index HT, PEG/Ion HT, PEGRx HT, SaltRx HT. Первые хорошо ограненные кристаллы белка 2FCL появились через 6 дней в условиях 0.2 M Sodium chloride, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 30% v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol при температуре +40С. Необходимо отметить, что в состав полученных условий входит криопротектант - (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol, что нивелирует необходимость дополнительного подбора криопротектантов. Начало роста кристаллов белка 3E80 пришлось также на 6-е сутки в условиях: 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6, 2.0 M Ammonium sulfate при температуре +40С. Кристаллы белка DJ-1 удалось получить при двух различных температурах. При +40С в течение недели кристаллы белка выросли в 5-и различных условиях: 1. 0.1 M HEPES pH 7.0, 30% v/v Jeffamine ® ED-2001 pH 7.0 2. 0.1 M HEPES pH 7.5, 1.4 M Sodium citrate tribasic dehydrate 3. 0.2 M Magnesium chloride hexahydrate, 0.1 M Tris pH 8.5, 25% w/v Polyethylene glycol 3,350 4. 0.2 M Ammonium citrate tribasic pH 7.0, 20% w/v Polyethylene glycol 3,350 5. 0.2 M Sodium citrate tribasic dihydrate, 0.1 M TRIS hydrochloride pH 8.5, 30% v/v Polyethylene glycol 400 При температуре +200С кристаллы появились уже на четвертый день в условиях 1.1 M Ammonium tartrate dibasic pH 7.0. Для белка 2Q02 при температуре +40С кристаллы удалось получить в течении первых 10 дней в трех условиях: 1. 0.095 M Sodium citrate tribasic dihydrate pH 5.6, 19% v/v 2-Propanol, 19% w/v Polyethylene glycol 4,000, 5% v/v Glycerol 2. 0.085 M HEPES sodium pH 7.5, 8.5% v/v 2-Propanol, 17% w/v Polyethylene glycol 4,000, 15% v/v Glycerol 3. 0.08 M TRIS hydrochloride pH 8.5, 1.6 M Ammonium phosphate monobasic, 20% v/v Glycerol. При температуре +20С кристаллы росли в четырех условиях в течении 10 дней: 1. 0.1 M HEPES sodium pH 7.5, 2% v/v Polyethylene glycol 400, 2.0 M Ammonium sulfate 2. 0.01 M Cobalt(II) chloride hexahydrate, 0.1 M MES monohydrate pH 6.5, 1.8 M Ammonium sulfate 3. 0.2 M Ammonium sulfate, 0.1 M MES monohydrate pH 6.5, 30% w/v Polyethylene glycol monomethyl ether 5,000 4. 1.1 M Sodium malonate pH 7.0, 0.1 M HEPES pH 7.0, 0.5% v/v Jeffamine ® ED-2001 pH 7.0 Все полученные первоначальные условия кристаллизации были использованы при дальнейшей оптимизации с целью получения высококачественных кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ Для оптимизации условий кристаллизации использовалась другая вариация метода диффузии в парах - «висячая» капля. Оптимизацию проводили в ручном режиме, при этом исходные условия варьировались путем изменения концентрации осадителя и добавок, их соотношения в растворе, соотношения объемов раствора белка и противораствора в капле. После проведения перечисленных выше манипуляций для каждого исследуемого белка были отобраны условия, позволяющие получить кристаллы наилучшего качества. Полученные условия приведены в Таблице 1. Результатом проведенной работы стало получение кристаллов нативной формы для каждого из отобранных белков, пригодных для проведения рентгеноструктурного анализа (Рисунок 1). РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ Рентгеноструктурные исследования кристаллов нативной формы исследуемых белков проводили на станции белковой кристаллографии «Белок» на пучке синхротронного излучения накопителя «Сибирь-2» НИЦ «Курчатовский институт» при температуре 100К. Разрешение всех полученных структурных данных было достаточно высоким от 1.2 до 2.4 A, что свидетельствовало о возможности идентификации в полученных структурах малых молекул и целесообразности настаивания полученных кристаллов в разработанных коктейлях. Полученные структуры были уточнены и две из них были депонирваны в банк данных белковых структур RCSB (www.rcsb.org) с кодами - 4HX0 и 4HGX. РАЗРАБОТКА КОКТЕЙЛЕЙ (СМЕСИ МЕТАБОЛИТОВ) Одной из поставленных задач нашего исследования являлась разработка и приготовление коктейлей для последующего настаивания в них полученных кристаллов исследуемых белков. Результатом этой работы является набор из 13-ти коктейлей, в состав которых вошли основные структурные элементы клеточных метаболитов. Состав смесей приведен в Таблице 2. Как видно из таблицы, в состав каждого коктейля включены 5-12 различных соединений. Как правило, структурно схожие соединения объединяли в одном коктейле. Разработанные нами коктейли в основном состоят из кофакторов и соединений, содержащих общий метаболический структурный элемент. Это делалось для того, чтобы увеличить суммарную концентрацию общих наименьших структурных звеньев. Некоторые классы веществ, такие как аминокислоты, не вошли в состав полученных смесей. Данные соединения и их аналоги будут проверены в последующих стадиях отбора, если первая стадия отбора не даст результатов. Согласно данным литературы, настаивание кристаллов в растворе лигандов (при неизвестных значениях констант связывания) должно проводиться достаточно продолжительное время. Исходя из этих данных, было решено остановиться на времени настаивания в 3-е суток. Для замачивания к капле объемом 3 мкл, содержащей кристалл исследуемого белка, планируется добавлять 0,5 мкл раствора коктейля. Таким образом, конечная концентрация компонентов коктейля будет соответствовать 10 мМ. 3.7. Степень новизны полученных результатов Впервые получены кристаллические структуры ряда отобранных белков в нативном состоянии (новые пространственные группы и/или улучшенное разрешение по сравнению с данными в банке данных пространственных структур). Одна из полученных структур депонирована в банк данных www.rcsb.org с кодом доступа - 4HX0. Разработан уникальных набор коктейлей, охватывающий широкий спектр различных природных метаболитов и/или их структурных элементов. 3.8. Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем Первая стадия настоящего проекта является подготовительной. На этой стадии создан задел для реализации проекта в целом. Тем не менее, следует отметить, что работы проведены на современном методологическом уровне. Так, в частности, использование роботизированной системы скрининга условий кристаллизации является общепринятым стандартом при проведении структурных работ в ведущих мировых центрах. Несмотря на промежуточность полученных результатов некоторые из них уже соответствуют мировому уровню работ в данной области. Так ряд полученных пространственных структур отличается от имеющихся аналогов в банке данных пространственных структур (www.rcsb.org) более высоким разрешением или другой пространственной группой. Необходимо также отметить, что исполнители проекта тесно взаимодействуют с одними из лучших мировых центров синхротронного излучения: Европейская лаборатория молекулярной биологии (EMBL, Germany) и Spring8 (Япония). В связи с этим, в связи с большим объемом работ на втором этапе, ряд работ планируется проводить с привлечением данных ресурсов. 3.9. Методы и подходы, использованные в ходе выполнения Проекта (описать, уделив особое внимание степени оригинальности и новизны) Для продукции исследуемых белков использовали плазмиды, выделенные из клонов, полученных из американского репозитория плазмид Университета Штата Аризоны. При выполнении работ по данному проекту были подобраны условия культивирования клеток E. coli K-12 штамм BL21(DE3), трансформированных целевыми плазмидами. В дальнейшем использованы методы очистки белковых препаратов при помощи металлохелатной аффинной хроматографии. Чистота полученных образцов контролировалась по данным SDS-электрофореза. При подборе первичных условий кристаллизации использовался метод диффузии в парах («сидячая капля»). Для скрининга использовалась система роботизированного скрининга условий кристаллизации фирмы Ригаку. Оптимизация первичных условий кристаллизации проводилась в ручном режиме в 24-ти луночных планшетах методом диффузии в парах («висячая» капля). Тестирование и сбор дифракционных данных проводили на станции белковой кристаллографии «Белок» на пучке синхротронного излучения накопителя «Сибирь-2» НИЦ «Курчатовский институт». Фокусирующий канал станции был настроен на длину волны излучения 0.9875 A. Съемку проводили при температуре -173 ?С с использованием низкотемпературного устройства Cryostream Plus фирмы OxfordCryosystems. Дифракционную картину от кристаллов регистрировали двумерным CCD-детектором Rayonix SX165 и обрабатывали комплексом программ XDS и CCP4.