| 1 |
29 июля 2021 г.-30 июня 2022 г. |
Разработка методики высокочувствительного иммуноанализа с использованием электроформованных полимерных мембран |
| Результаты этапа: В основе проекта лежит гипотеза о том, что мы можем улучшить чувствительность иммуноаналитических систем, если реакции проводятся не на донышке планшета, как в традиционном иммуноферментном анализе (ИФА), а на поверхности пористой мембраны. Для получения мембран нами был использован метод электроспиннинга (электроформования). Были изготовлены электроформованные мембраны из полилактида (ПЛА), поликапролактона (ПКЛ) и нейлона-6. Все эти мембраны состояли из гладких цилиндрических волокон с диаметрами в субмикронном диапазоне (670 ± 270 нм - ПЛА, 355 ± 165 нм - ПКЛ, 430 ± 190 нм - нейлон-6) без явных дефектов (утолщений или капель).
С помощью измерения краевого угла смачивания и времени впитывания капли была оценена гидрофильность мембран в исходном состоянии и после их обработки кислородной плазме. Необработанные полиэфирные мембраны (ПЛА и ПКЛ) проявляли гидрофобные свойства: средние значения их краевых углов смачивания превышали 120°, капля не впитывалась во время наблюдения (100 секунд). Нейлоновые мембраны были гидрофильными - значение краевого угла постепенно уменьшалось с приблизительно 120° до 0° (полное впитывание капли) в течение 50-60 секунд. Плазменная обработка электроформованных мембран значительно улучшала гидрофильность мембран. Для всех типов мембран (ПЛА, ПКЛ, нейлон-6) начальный краевой угол смачивания сразу после обработки составлял менее 60°, а время впитывания капли не превышало 10 секунд. Эффект от плазменной обработки мембран сохранялся спустя сутки. Хорошая смачиваемость мембран благоприятна для разработки сенсора, т.к. она обеспечит однородность адсорбции антител, а также позволит использовать всю толщину мембран, а не только поверхностные слои волокон.
С помощью спектрофлуорометрии и флуоресцентной микроскопии была исследована автофлуоресценция использованных полимеров. И для мембран, и для растворов полимеров наибольшая интенсивность автофлуоресценции наблюдалась в диапазоне 400-500 нм при возбуждении 320-400 нм. Соответственно, для флуоресцентной детекции могут быть использованы флуорофоры Cy3 или Alexa Fluor 555, максимумы эмиссии (565-570 нм) и возбуждения (555 нм) которых не входят в указанные диапазоны.
Количественно описана способность электроформованных мембран из нейлона-6 адсорбировать антитела класса IgG. Показано, что при концентрации антител в диапазоне 2.5-10 мкг/мл связывающая способность мембран имеет порядок ~100 мкг/г, а доля антител, адсорбированных из раствора, составляет 40-45%. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показано, что адсорбированные антитела более эффективно вымываются с внешних слоев мембраны, чем с внутренних.
Начаты работы по созданию иммуноаналитической системы для обнаружения и измерения концентрации интерлейкина 1 бета (ИЛ1б). Оказалось, что многие коммерчески доступные антитела против ИЛ1б не взаимодействуют с нативным ИЛ1б, но взаимодействуют с денатурированным.
Для проведения экспериментов по исследованию характеристик иммуноанализа на электроформованной мембране при его проведении в проточном режиме, была спроектирована и изготовлена разборная оправка (держатель) мембраны. Оправка выполнена из поликарбоната, акрилового адгезива и полиэтилентерефталата. Детали изготовлены методом лазерной абляции. Оправка позволит концентрировать аналит вблизи поверхности мембраны путем циклического пропускания пробы через нее. |
| 2 |
1 июля 2022 г.-30 июня 2023 г. |
Разработка методики высокочувствительного иммуноанализа с использованием электроформованных полимерных мембран |
| Результаты этапа: На данном этапе был разработан набор методических приемов, которые позволяют улучшить характеристики иммуноаналитических систем – снизить время анализа, уменьшить расход дорогостоящих реагентов (улавливающих антител), повысить чувствительность (увеличить тангенс угла наклона калибровочной кривой). Для обычного ИФА это может быть достигнуто за счет изменения процедуры нанесения улавливающих антител на донышко планшета.
Для белкового дот-блоттинга обнаружено, что адсорбция антител на нитроцеллюлозные мембраны может быть увеличена в 15-17 раз за счет обработки мембран в тлеющем разряде (в плазме), причем этот эффект слабо зависит от полярности приложенного напряжения. Усиленная адсорбция антител, в свою очередь, позволяет приблизительно в 10 раз поднять чувствительность иммуноанализа. Расход улавливающих антител, используемых для дот-блоттинга, может быть уменьшен при использовании электроформованных мембран из нитроцеллюлозы вместо фабричных.
Показано, что циклическое пропускание пробы через полимерную мембрану повышает адсорбцию аналита, причем это справедливо и для неспецифической адсорбции, и для специфической, которая реализуется при наличии аффинного рецепторного слоя на мембране. Сама по себе возможность концентрирования пробы на мембране является нетривиальным фактом, т.к. размер молекулы аналита значительно меньше, чем характерный размер поры в мембране, и можно ожидать, что молекулы будут проникать через поры, не связываясь с поверхностью. Тем не менее, возможность интенсивной адсорбции аналита на поверхность была продемонстрирована с помощью двух аналитов (бычьего сывороточного альбумина для неспецифической адсорбции и интерлейкина 1 бета для специфического связывания) и двух систем пропускания пробы - герметичной, разработанной на предыдущем этапе, и открытой, разработанной на этом этапе. При циклическом пропускании пробы через мембрану доля аналита, осевшего на мембрану из раствора за время эксперимента, возрастала в 2.8-11.5 раз для неспецифического связывания и в 2.4-3.4 раз для специфического.
Для исследования структуры мембран предложена оригинальная методика корреляционной микроскопии, объединяющая сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) и лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (ЛСКМ). Корреляционная микроскопия СЭМ-ЛСКМ позволяет исследовать одну и ту же выбранную область образца двумя методами последовательно, при этом методы дополняют друг друга и позволяют получить наиболее точную информацию о структуре образца. Предложен оригинальный способ обработки данных для экспериментов, выполненных с помощью корреляционной микроскопии. Разработанная методика и соответствующая процедура обработки данных могут быть использованы для широкого класса образцов со сложной нано- и микроструктурой. |
| 3 |
1 июля 2023 г.-30 июня 2024 г. |
Разработка методики высокочувствительного иммуноанализа с использованием электроформованных полимерных мембран |
| Результаты этапа: На третьем, заключительном этапе работ, была создана теоретическая модель, объединяющая уравнения диффузии и адсорбции, предназначенная для описания движения растворов биомакромолекул внутри пористой полимерной мембраны и их адсорбции на поверхность полимера. С помощью этой модели для нескольких экспериментальных систем построены зависимости количества аналита, осажденного на мембрану, от его концентрации в пробе. Теоретические зависимости, рассчитанные путем численного решения уравнение, показали отличное совпадение с экспериментальными данными. Модель позволила по экспериментальным данным оценить константы диссоциации для неспецифического и специфического связывания аналита с сорбентом, и эти константы хорошо совпали с литературными данными. Разработанная модель может использоваться для совершенствования биоаналитических систем, в которых реакции связывания происходят на мембране.
Разработана герметичная камера для пропускания растворов через мембраны, которая допускает одновременную обработку шести мембран. С ее помощью исследовано осаждение альбумина и конъюгатов мелатонина на нитроцеллюлозные мембраны. Показано, что серийно выпускаемые мембраны из нитроцеллюлозы и электроформованные мембраны из нее в дот-блоттинге дают практически одинаковые сигналы.
Для исследования структуры электроформованных мембран предложена оригинальная методика корреляционной микроскопии, а также алгоритм обработки данных, получаемых с ее помощью. Методика позволяет получить изображения одного и того же участка поверхности методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (ЛСКМ) последовательно. Эта методика предусматривает перенос образца, содержащего навигационные метки, между микроскопами, для получения пары изображений, а специальный алгоритм обработки данных позволяет совместить полученные изображения на основании корреляционного анализа. Методика корреляционной микроскопии в дальнейшем может использоваться для определения структуры различных объектов, прежде всего, пористых пленок или микрочастиц.
|
