ИСТИНА

Цель проекта – понять, как регуляция специфических продуцентов ацил-КоА отражается на иных реакциях ацилирования in vivo и каковы физиологические последствия такой конкуренции.

The hypothesis studied in the current project is that the interaction between different systems of post-translational acylations contributes to physiological changes upon the altered function of specific acyl-CoA producers. This is evidenced by the following results obtained by us in 2018-2020: (1) changes in the physiology and biochemistry of the brain observed upon inhibition of OADHC, which is involved in the tissue-specific catabolism of lysine and tryptophan, and, due to its very low expression in the brain, is usually not ascribed a significant physiological role; (2) nuclear localization of the 2-oxoadipate dehydrogenase isoform, capable of complex formation, in addition to its mitochondrial, but not cytoplasmic, localization; (3) different physiological manifestations of PDHC and OGDHC inhibition, despite the coupling of their mitochondrial function in the tricarboxylic acid cycle; (4) long-term changes in brain biochemistry after a short-term inhibition of the activity of the complexes, suggesting epigenetic changes; (5) absence of an immediate marker of OGDHC inhibition - glutamate - from the most important comppnents of the brain that change upon OGDHC inhibition, established by partial least squares discriminant analysis (PLS-DA). To achieve the project goal, a number of tasks is planned to be solved. (1) In addition to the dataset on the inhibition of the succinyl-CoA producer OGDHC, already analyzed by the PLS-DA, we shall use this analysis for the datasets obtained upon the inhibition of the producers of acetyl-CoA (PDHC) and glutaryl-CoA (OADHC). This will make it possible to determine the most important components of the PDHC and OADHC inhibition, and analyze their relationship to the cellular acylation systems. (2) Using the antibodies specific towards different types of protein acylation, possible changes in the patterns of protein acetylation, succinylation, and glutarylation will be investigated upon inhibition of each of the studied acyl-CoA producers, i.e. PDHC, OGDHC and OADHC. For example, in studies of the tissue homogenates and / or cell lysates, it is planned to determine whether the observed decrease in succinylation upon OGDHC inhibition will be accompanied by altered acetylation or glutarylation of the brain proteins. Potential changes in the expression of sirtuin 3 in the models of the OGDHC and OADHC inhibition, and of sirtuin 5 in the model of PDHC inhibition, will be analyzed in a similar way. (3) Our proteomic data obtained in the independent studies of the models of pentylenetetrazole-induced chronic epilepsy and of a single epileptic seizure, will be analyzed regarding changes in various types of protein acylation in the brain of epileptic rats vs controls. Changes in sirtuin 3 and protein acetylation in the epileptic brain are known from the literature, but it is not known whether such changes affect succinylation and glutarylation. Using our approach for the quantitative assessment of mass spectrometric data on protein acylation, the three studied types of acylation in the brain proteins of epileptic and control rats will be characterized. The results on the modification of specific proteins will be added by immunoblotting of the corresponding samples of brain homogenates, which are available from the same independent study. (4) The effect of thiamine transport inhibitors - metformin and amprolium - on the acylation of brain proteins will be studied in an animal model of the drugs administration tested in 2020. The involvement of thiamine in the processes of acetylation of metabolic proteins in the brain was shown during the project of 2018-2020. We also showed that cellular thiamine deficiency induced by amprolium, increased p53 acetylation. Therefore, the patterns of acylation of brain proteins and the level of p53 acetylation will be studied upon long-term treatment of animals with the thiamine transport inhibitors. (5) The relationship between the compensatory OGDHC activation and increased p53 acetylation, observed in 2020 in the rat brain, will be investigated in glioblastoma cell lines with native (U87) and mutated (T98G) p53. The potential coupling of the expression of p53 and / or its acetylated form with the levels of OGDHC activity in these cell lines under normal conditions and upon the inhibition of the complex will be evaluated to characterize molecular mechanisms of the interaction between OGDHC and acetylated p53. (6) In order to perform specific inhibition of the producers of acetyl-, succinyl- and glutaryl-CoA in the planned cellular and animal experiments, esterified and charged forms of the phosphonate analogs of substrates will be synthesized, selectively blocking PDHC, OGDHC and OADHC. The relevance of the study is determined by poorly characterized biological significance of other than acetylation types of acylation, occurring at partially intersecting subsets of the protein acylation sites. Independent studies have shown that malignant transformation exhibit reduction in protein succinylation, and such malignant properties as invasiveness decrease upon elevated succinylation. On the other hand, glioblastoma cell growth is known to be associated with histone hyperacetylation. The decreased succinylation is thus likely to contribute to hyperacetylation. The recent discovery of nuclear localization of all the complexes studied in this project, including those traditionally considered exclusively mitochondrial (PDHC and OGDHC), enhances the significance of the planned study for understanding the role of the acyl-CoA producers studied in the project, in epigenetic regulation invoving acylations of histones.

ожидается определить взаимосвязи между различными типами ацилирования на уровне целостной биосистемы и конкретных ее белков. Мы ожидаем, что иммунодетекция ацетилирования, сукцинилирования и глутарилирования белков мозга крыс и клеток глиобластомы может быть полезным инструментом для характеристики изменений в различных типах ацилирования в контрольных условиях и при воздействии внешних факторов. Так, ингибирование одного из продуцентов ацил-КоА может влиять и на другие типы ацилирования. С другой стороны, ожидаемо, что наблюдаемый при ряде патологий рост ацетилирования снижает доступность белковых сайтов альтернативным модификациям: сукцинилированию и глутарилированию. В связи с опубликованными данными об усилении ацетилирования белков мозга при эпилепсии мы ожидаем определить такие изменения в имеющихся в нашем распоряжении образцах мозга крыс, у которых моделировали эпилептический приступ. Поскольку для этих животных у нас имеются и протеомные данные, метод иммунодетекции ацилирования белков в этом случае будет дополнен масс-спектрометрическим определением таких модификаций у ключевых метаболических белков. Таким образом, ожидается увидеть изменения в ацетилировании, сукцинилировании и глутарилировании белков мозга крыс-эпилептиков по сравнению с контрольными животными. Ожидается, что обнаруженная в мозге крыс связь между продуцентом сукцинил-КоА ОГДК и уровнем ацетилирования р53 будет изменена в клетках глиобластомы. Понимание молекулярных механизмов таких изменений может быть использовано для усиления эффективности борьбы с глиобластомами. Ожидается, что обработка животных известными фармакологическими препаратами, ингибирующими тиаминовые транспортеры (метформин, ампролиум), будет изменять уровни ацетилирования, сукцинилирования и глутарилирования белков мозга вследствие нарушения нормального насыщения тиаминдифосфатом продуцентов ацил-КоА, а также влиять на связанный с ними уровень р53 и/или его ацетилирования. Ожидается, что анализ изменений компонентов систем ацилирования мозга и физиологических изменений в данной модели методом PLS-DA выявит в качестве главных компонент изменения, имеющие принципиальное значение при специфическом ингибировании каждого из тиамин-зависимых продуцентов ацил-КоА. Индуцируемый применением фармакологических препаратов гиповитаминоз тиамина (витамина В1) приобретает все более широкое распространение в развитых странах, где алиментарный дефицит тиамина давно побежден. Полученные в моделях такой скрытой патологии (гиповитаминоз), а также тяжелых и плохо поддающихся лечению заболеваний, таких как эпилепсия и опухоли мозга, результаты будут иметь большое медицинское значение для разработки персонифицированных подходов к эффективным комбинированным терапиям. Анализ литературы показывает, что направленная регуляция клеточного (де)ацилирования для борьбы со злокачественной трансформацией клеток – неизбежного спутника старения – является очень популярной современной тематикой, в дополнение к уже традиционной роли сиртуинов в качестве факторов омоложения.

В данном проекте была охарактеризована взаимная регуляция трех типов пост-трансляционного ацилирования лизиновых остатков белков мозга: ацетилирования, сукцинилирования и глутарилирования. Регуляцию характеризовали с учетом продукции ацилирующих агентов (ацил-КоА) комплексами дегидрогеназ пирувата (ПДК), 2-оксоглутарата (ОГДК), 2-оксоадипата (ОАДК) и экспрессии НАД+-зависимых деацилаз ацетил- или сукцинил- и глутариллизинов, кодируемых генами SIRT2 и SIRT3 или SIRT5. С использованием животных моделей показано, что данная система вовлечена в ответы на краткосрочные и хронические метаболические стрессы, в том числе наблюдаемые при нарушениях метаболизма тиамина (витамина В1) и эпилепсии (Boyko et al 2021 https://doi.org/10.3389/fnmol.2021.620593; Zavileyskiy, Aleshin et al 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232012302; Graf et al 2021 https://doi.org/10.3389/fmed.2021.751639; Artiukhov, Graf et al 2022 https://doi.org/10.3390/ph15020182; Boyko et al 2022 https://doi.org/10.3389/fmed.2022.896263; Bunik, Artiukhov et al 2022 https://doi.org/10.3389/fchem.2022.892284; Graf et al 2022 https://doi.org/10.3390/ijms23052579). Сопоставление изменений в системе ацилирования белков мозга и физиологии животных мультипараметрическим анализом РLS-DA показало, что ацетилирование и сукцинилирование белков мозга являются наиболее общими факторами среди тех, которые определяют различия контрольной и экспериментальной групп животных при разнообразных типах дисфункций комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот. При этом для экспериментальных животных, у которых отличия от контрольных в наибольшей степени определяются экспрессией ОАДГ и ацилированием р53, ведущий вклад в отличия вносит и такой поведенческий фактор как тревожность. Данное патологическое состояние развивается при хроническом введении животным окситиамина, вызывающего дисфункцию всех дегидрогеназ 2-оксокислот in vivo. При краткосрочном ингибировании ПДК наиболее значительный вклад в различия экспериментальной и контрольной групп вносит такая комбинация биохимических и физиологических факторов как сукцинилирование белков мозга и параметры вариабельности сердечного ритма. Изучение ацилирования при специфическом ингибировании ПДК, ОГДК и ОАДК показало высокую степень взаимозависимости различных типов ацилирования и активностей субстрат-специфичных дегидрогеназ 2-оксокислот (Artiukhov, Graf et al 2022 https://doi.org/10.3390/ph15020182; Boyko et al 2022 https://doi.org/10.3389/fmed.2022.896263; Bunik, Artiukhov et al 2022 https://doi.org/10.3389/fchem.2022.892284). Помимо того, что такое взаимное влияние может быть опосредовано процессами пост-трансляционных ацилирований на уровне продукции ацил-КоА и конкуренции различных ацил-КоА за белковые сайты (Zavileyskiy, Aleshin et al 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232012302; Boyko et al 2022 https://doi.org/10.3389/fmed.2022.896263), еще одним медиатором взаимного влияния является экспрессия соответствующих деацилаз ацетильных и отрицательно заряженных (сукцинильных, глутарильных) остатков, кодируемых генами SIRT3 или SIRТ5, соответственно (Aleshin et al 2021 https://doi.org/10.3390/ijms22158006). Так, в коре мозга крыс экспрессия десукцинилазы/деглутарилазы SIRT5 растет с ростом уровня ингибирования продуцента ацетильных остатков - ПДК (Алешин и др., 2023). Напротив, краткосрочное введение животным ингибиторов продуцентов сукцинильных и глутарильных остатков - ОГДК и ОАДК - вызывало снижение экспрессии деацетилазы SIRT3. Долгосрочное же снижение активности ОАДК вследствие процессов адаптации сопровождалось снижением уровней и SIRT5, и SIRT3 (Boyko et al 2022 https://doi.org/10.3389/fmed.2022.896263). Взаимозависимость компонентов системы белкового ацилирования в значительной степени определяется клеточным метаболизмом. В частности, в линиях раковых клеток с разным уровнем экспрессии кодируемой геном DHTKD1 ОАДГ показаны разные ответы клеток на воздействия ингибиторов ОГДК и ОАДК. В клетках U251-MG (низкая экспрессия DHTKD1) наблюдалось повышение уровня SIRT5 при ингибировании ОАДК по сравнению с ингибированием ОГДК, тогда как в клетках MCF7 (высокая экспрессия DHTKD1) и А549 (средняя экспрессия DHTKD1) при той же дозе ингибитора не наблюдали значимых изменений SIRT5. По-видимому, при одинаковой дозе ингибитора ответ на уровне экспрессии SIRT5 в клетках с высокой или средней экспрессией фермента отсутствует, т.к. доза ингибитора не вызывает такого значительного снижения активности ОАДК и связанного с ней глутарилирования белков, как в клетках с низкой экспрессией. По результатам проекта биологическая роль кодируемой DHTKD1 ОАДГ в значительной степени определяется участием этого фермента в глутарилировании белков, в том числе ПДК (Boyko et al 2022 https://doi.org/10.3389/fmed.2022.896263; Zavileyskiy, Aleshin et al 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232012302). Интересным с точки зрения развития новых подходов к лечению рака является обнаруженная нами возможность регуляции уровня сукцинилирования клеточных белков с помощью воздействий на дегидрогеназы 2-оксокислот. Так, в клетках А549 и U251-MG сукцинилирование повышалось при инкубации с ингибитором ОГДК. Поскольку известно, что при повышении сукцинилирования уменьшаются такие злокачественные свойства как инвазивность, возможность фармакологической регуляции данной модификации белков может иметь практическое значение. В животной модели индуцированной пентилентетразолом эпилепсии показано, что по сравнению с контрольной группой, ацилирование 14 сайтов в 11 белках значительно отличалось после судорог. Из 11 белков 6 относились к метаболическим путям выработки энергии, включая гликолиз. Экспрессия SIRT3, SIRT5 и активность ОГДК понижались после хронических судорог по сравнению с одиночным приступом (Zavileyskiy, Aleshin et al 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232012302). Таким образом, мы обнаружили вовлеченность ОГДК и SIRT5 в метаболические изменения, вызываемые хроническими судорогами. Конкуренция между ацетилированием и глутарилированием показана как на уровне одного остатка лизина в конкретном белке, так и по отрицательным корреляциям между данными модификациями в разных белках. Однако такая зависимость не является обязательной, поскольку многие белки показывают и положительные корреляции между разными ацилированиями их остатков. Отсутствие единого ответа всех белков на некие общие изменения т.н. «ацилирующего потенциала» показывает, что значительную роль в регуляции ацилирования играют и такие факторы как внутриклеточная локализация белков и их реактивность к ацил-КоА (Zavileyskiy, Aleshin et al 2022 https://doi.org/10.3390/ijms232012302). В данном исследовании также обнаружено, что уровень наиболее распространенного типа белкового ацилирования – ацетилирования – положительно коррелирует с экспрессией наиболее представленной в мозге деацетилазы SIRT2. Напротив, корреляция уровня глутарилирования белков мозга с экспрессией деглутарилазы SIRT5 – отрицательная. Ацилирование белков мозга в моделях нарушения метаболизма тиамина менялось в соответствии с наблюдаемыми in vitro изменениями функций дегидрогеназ 2-оксокислот. Так, по сравнению с контролем, ни глутарилирование белков мозга, ни активность ОАДК в экспериментальной группе не изменялись. Напротив, дисфункция ОГДК сопровождалась пертурбациями сукцинилирования и ацетилирования белков мозга, сопряженное изменение которых отражает лимитирующую роль ОГДК в окислении ацетил-КоА в цикле Кребса. Таким образом, в проекте охарактеризованы закономерности взаимной регуляции разных типов ацилирования белков мозга и показана существенная роль в этом процессе как дегидрогеназ центрального метаболизма (ПДК и ОГДК), так и комплекса ОАДК, роль которого в процессе глутарилирования белков мозга показана нами впервые.