ИСТИНА

Цель данного исследования - изучить механизмы взаимодействия между мужским гаметофитом и женскими тканями в прогамной фазе оплодотворения

The relevance of the study of the mechanisms regulating the germination of the male gametophyte is due to the fact that this process determines the success of fertilization and, accordingly, the formation of seeds. The possibility and efficiency of germination is determined by two factors: firstly, the fertility of the male gametophyte itself, which depends on the conditions of its formation and on the genotype, and secondly, the ability of sporophytic tissues to activate and maintain a pollen grain in the early stages of its activation and later, in the process growth. Precisely on the latter paragraph we are planning to concentrate within the framework of this Project. Thus, the set goal lies in the plane of intercellular communication between pollen and female tissues. The emphasis is on the interaction between pollen and the liquid in which it is activated and germinates in vivo (let's call it receptive liquid, RL). This aspect is extremely important for the success of reproduction, since in all plants with a wet stigma and most conifers, pollen is in the liquid when pollinated, immersed in it and germinates in it. Our hypothesis is that fluid composition and properties are key determinants of pollen germination efficiency. We will consider these factors in an evolutionary aspect: we plan to trace the development of systems of interaction between pollen and female tissues in plants from different families, both holo- and angiosperms. On the part of the pollen grain, we have already begun such work: we tested the ability of pollen grains of plants from different taxonomic groups to respond to any activating factors (mainly ROS) in vitro. But this is only one side: after all, even if pollen is able to respond to any signal, this does not yet prove that such a signal really affects it in vivo. By studying the properties of the pancreatic fluid and changing them, we can identify the correspondence between the sporophyte control systems for germination and the ability of pollen to respond to these systems. It must be said that the liquids participating in the germination of pollen in conifers (pollination droplet) and in flowering plants (stigma exudate) are produced by different tissues and it would be wrong to carry out direct homology between them, but the more important is their functional similarity as a medium that supports the germinating gametophyte. The composition of these liquids has already been studied for some plants, but the main emphasis has always been on the nutritional composition (mixture of carbohydrates) and the protein component (enzymes and regulatory proteins). We plan, firstly, to collect receptive fluids from a number of plants from different phylogenetic groups (pine, zamiaceae, ginkgo, Aristolochiaceae, peony, Solanaceae, Liliaceae and others), and secondly, to compare these fluids by different parameters related with intercellular interaction: to measure the content of ROS and antioxidant activity (by EPR, chemiluminescence, spectrophotometry), the content of inorganic ions (spectrofluorimetry, flame photometry), saturated and unsaturated fatty acids (GC-MS) and phytohormones (HELC). During the implementation of the Project, for the first time for different groups of plants, a comparative study of pollen tubes forming and growing in vitro and in vivo will be carried out. At the moment, such studies were carried out only on model objects and included mainly measurements of quantitative parameters (how quickly the tube grows). The results obtained are quite obvious: in vivo it grows faster. Much more interesting is another question: why? In our work, it is planned to use native and modified GC as an adjunct to in vitro germination. Modifications of the RL will help to identify the most important components for germination that affect pollen in each of the groups of plants. The comparison will include both quantitative indicators (tube growth rate, respiration intensity) and cytological characteristics (fluorescence microscopy, TEM, histochemistry), showing how rapid growth is ensured. Also of great interest is the question of how universal the mechanisms of germination control are, and to what extent these mechanisms can be responsible for multiple shortening of the progamic fertilization phase in flowering plants as compared to gymnosperms. To answer this question, we need a fairly wide coverage of plants in the taxonomic sense. We, as a small team, do not plan to study dozens of species, but it seems to us much more important to choose plants that are as far apart as possible on the phylogenetic tree (adjusted for availability in our zone and in our city), and also test as possible more parameters that can influence germination. The team, in addition to the employee, graduate student and post-graduate student of the head, included specialists from various fields of botany, biophysics and physiology, who will ensure the comprehensive nature of the research. Each member of the team has his own experimental task, based on his methodological competence and allowing to involve in research a number of modern methods without purchasing excessively expensive equipment, as well as to competently approach the taxonomy of plants and the evolutionary problem, which is very important for the preparation of highly rated publications. As a result of the implementation of the Project, for the first time experimentally, an answer will be obtained to the question of the most important mechanisms for controlling the initial stages of the progamic phase of fertilization in different groups of plants. The hypothesis about the differences in these mechanisms between gymnosperms and angiosperms will also be tested for the first time, and the factors that contributed to the multiple acceleration of the progamic phase in the latter will be identified. On this basis, it will be possible to propose strategies for optimizing the reproductive process, and, as a consequence, increasing the productivity of plants and their resistance to adverse external influences.

Будет проведено сравнение рецептивных жидкостей (РЖ), которые продуцирует спорофит растений из разных систематических групп (опылительных капель и рыльцевого экссудата) по нескольким параметрам, важным для межклеточного взаимодействия: уровень АФК и антиоксидантная активность (ЭПР, хемилюминесценция, спектрофотометрия), содержание неорганических ионов (ионоселективные электроды, пламенная фотометрия), насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (ГХ-МС) и фитогормонов (ВЭЖХ). Тем самым будут впервые выявлены механизмы, которые те или иные растения используют для взаимодействия рыльца (у покрытосеменных) или микропиле (у голосеменных) с мужским гаметофитом и активации его роста. Подобные исследования никогда ранее не проводились, поскольку изучение рыльцевого экссудата и особенно опылительных капель очень затруднено из-за малого объема этих жидкостей, короткого периода их появления и трудности сбора. Есть целый ряд работ по составу этих жидкостей, но указанные параметры там практически не обсуждались (в отличие от состава сахаров и протеома), тем более, в эволюционном аспекте. 2. Впервые для различных групп растений будет проведено сравнение пыльцевых трубок, формирующихся и растущих in vitro и in vivo. Сравнение будет включать в себя как количественные показатели (длину трубки, количество трубок из одного пыльцевого зерна – для хвойных), так и цитологические характеристики (зонирование цитоплазмы, положение мужского гаметного модуля). Тем самым будет показано влияние РЖ на запуск полярного роста и его параметры. Пыльцевые зерна и трубки некоторых групп растений (например, саговниковых, кирказоновых) в цитологическом отношении изучены очень мало, поэтому для выявления указанных различий сначала нужно будет собрать данные об особенностях этих гаметофитов, подобно тому, как это ранее было сделано для модельных объектов. Так, для новых объектов будут подобраны условия роста in vitro, будет изучено расположение и движение органелл, особенности состава клеточной стенки и плазматической мембраны. Данный блок результатов также будет включать эволюционный аспект, поскольку цитологические параметры мужского гаметофита являются одной из линий развития отношений между спорофитным и гаметофитным поколениями. Проследить это развитие с опорой на разные группы растений – одна из задач настоящего Проекта. 3. Взаимодействие между РЖ и мужским гаметофитом будет изучено in vitro. Для установления роли каждой из обнаруженных в пункте 1 систем в контроле прорастания пыльцы воздействие рецептивной жидкости будет проверяться в двух вариантах: РЖ полного состава и РЖ после модификации, затрагивающей изучаемую систему, например, систему редокс-баланса (добавление антиоксидантов/АФК), систему ионного гомеостаза (добавление/хелатирования важного иона), систему гормонального сигналинга (связывание/инактивация обнаруженного гормона). Тем самым будет подтверждено не только наличие какой-либо из регуляторных систем на рыльце/в опылительной капле, но и её прямое участие в контроле репродуктивного успеха. Актуальность этого результата не вызывает сомнений, так как механизмы межклеточного взаимодействия в репродуктивных процессах сейчас находятся в центре внимания исследователей. В самых престижных журналах публикуются статьи по взаимодействию белков и пептидов с рецепторами на рыльце, но это лишь один из механизмов, которые растения используют для активации и поддержания полярного роста. Не вступая в прямую конкуренцию, мы планируем подойти с другой стороны, представив доказательства многоплановости общения между спорофитом и гаметофитом и эволюционного развития разных механизмов этого общения.

Планируемое исследование основывается на многолетнем опыте изучения физиологии мужского гаметофита, которое проводится на кафедре физиологии растений МГУ. Долгое время группой руководил профессор Ермаков И.П., после его ухода на пенсию руководство перешло к молодому сотруднику (руководитель Проекта), который поставил себе задачу создать рабочую команду из молодых ученых. В последние годы в нашей группе интерес сотрудников был сконцентрирован на функционировании регуляторного модуля «АФК-ионный транспорт» в мужском гаметофите цветковых и хвойных модельных растений, этой теме фактически посвящены два текущих проекта, которые завершаются в этом году. Она напрямую связана с предполагаемой тематикой Проекта, однако в рамках данного проекта мы решили не органичиваться АФК, а посмотреть на проблему регуляции прорастания шире, и сделать уклон в сторону in vivo, что соответствует общемировым трендам (а значит, лучше публикуется) и представляется логичным развитием темы. Кроме того, новым является эволюционный аспект, который постепенно нарастал в нашей группе с появлением нового модельного объекта – голубой ели – в 2018 году. В 2015-2016 годах под руководством заявителя исследования роли АФК в прорастании проводили на новых объектах - протопластах из пыльцевых трубок (Максимов и др., 2015. Цитология. 10:720) и пыльцевых зёрен покрытосеменных (Breygina et al., 2016. Plant Biol. 18:761), что позволило оставить в стороне фактор оболочки и таким образом упростить экспериментальную систему.В 2019-2020 годах продолжаются исследования роли АФК в регуляции роста пыльцевых трубок лилии и ели, начато сотрудничество с лабораторией ЭПР на кафедре биофизики (исполнитель Проекта Лунева О.Г.). Параллельно заявитель продолжает развивать контакты с другими лабораториями с целью расширения методической базы: получены первые результаты в протеомных исследованиях на базе лаборатории протеомики ИБХ РАН и с участием проточной цитометрии.