Направленный синтез могофункциональных плазмонных везикул для биомедицинских примененийНИР

The directed synthesis of the plasmonic vesicles for biomedical applications

Источник финансирования НИР

грант РФФИ

Этапы НИР

# Сроки Название
1 1 января 2016 г.-22 декабря 2016 г. Направленный синтез могофункциональных плазмонных везикул для биомедицинских применений
Результаты этапа: 1. Разработана простая химическая методика получения липосом с узким распределением по размеру, содержащих наночастицы золота сферической формы. Предложен алгоритм расчета соотношения наночастицы золота – липосомы. 2. Доказана стабильность полученных исходных и содержащих золото липосом в нейтральных и щелочных средах, а также под воздействием ультразвука. 3. При помощи спектроскопии комбинационного рассеяния установлено, что увеличение содержания золота в липосомах способствует повышению интенсивности сигналов от лекарственных препаратов,что доказывает их вхождение в мембрану липосомы, и позволяет контролировать процессы доставки лекарственных препаратов и исследовать изменение их структуры. 4. В работе высказано предположение, что усиление сигнала в спектроскопии КР может быть объяснено образованием кластеров из наночастиц золота, замкнутых в полости липосомы. Падающее лазерное излучение вблизи золотых липосом возбуждает коллективные колебания электронов проводимости золота, образуются т.н. локализованные поверхностные плазмоны, создающие собственное электрическое поле. Когерентное взаимодействие падающего и созданного плазмонными везикулами поля приводит к усилению электромагнитного воздействия на молекулы ланализируемых веществ, адсорбированные на металле. Происходит усиление как падающего, так и рассеянного поля, что усиливает сигнал в спектрах КР от молекул анализируемого вещества, и дает возможность анализировать растворы с малыми концентрациями (10-7М). 5. В работе предложен синтез плазмонно-магнитных нанокомпозитов, состоящих из наночастиц золота и магнетита. При исследовании спектров КР метиленового синего с концентрацией 10-7М, помещенного на стекло, покрытое слоем композита, наблюдается значительное усиление сигналов от красителя. Усиление обусловлено двумя факторами. Наночастицы оксида железа образуют комплекс с переносом заряда с молекулами метиленового синего, полоса поглощения которого близка к полосе поглощения наночастиц золота (533 нм) и длине излучения лазера, а наночастицы золота, полоса поглощении которых близка к полосе поглощения комплекса, усиливают сигнал от образовавшегося комплекса в спектроскопии КР. Благодаря синергетическому взаимодействию оксида железа, золота и метиленового синего, удалось получить спектр от раствора метиленового синего с концентрацией 10-7М 6. В работе осуществлен синтез липосом, содержащих наночастицы золота и оксида железа. Методом просвечивающей электронной микроскопии доказано вхождение нанокомпозитов в полость липосомы. Однако для использования таких липосом в анализе биологических объектов необходимо нахождение оптимального соотношения наночастицы золота – наночастицы магнетита. 7. Разработана простая химическая методика получения липосом, содержащих нанокомпозиты на основе наночастиц золота и оксида графена. 8. Экспериментально доказано, что в липосомах происходит восстановление оксида графена наночастицами золота. Этот процесс сопровождается ростом доли атомов углерода, находящихся в состоянии sp3 гибридизации, и, соответственно, увеличением отношения ID/IG. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о химическом контакте наночастиц золота и оксида графена, что подтверждает их вхождение в полость липосом..
2 1 января 2017 г.-31 декабря 2017 г. Направленный синтез могофункциональных плазмонных везикул для биомедицинских применений
Результаты этапа: Аннотация В ходе выполнения исследования получены плазмонные липосомы (везикулы), образованные одним из самых распространенных липидов – фосфатидилхолином, включающие в свою полость и оболочку лекарственный препарат доксорубицин и наночастицы благородных металлов (индивидуального золота и композитов золото-серебро). Для оценки химической стабильности липосом, содержащих индивидуальные наночастицы золота, и их композиты с доксорубицином, было изучено их поведение в растворах, обладающих различными значениями рН. Результаты оптической спектроскопии свидетельствуют о том, что в кислой среде, в отличие от нейтральной и щелочной, для липосом, содержащих наночастицы золота, наблюдается значительное смещение полосы плазмонного резонанса в длинноволновую область, что может быть объяснено образованием агломератов частиц. Присутствие доксорубицина в составе липосом, содержащих наночастицы золота, увеличивает устойчивость липосом в широком интервале рН от 1 до 7. При помощи спектроскопии комбинационного рассеяния доказано, что наличие наночастиц золота в липосомах, содержащих доксорубицин, усиливает сигнал от молекул доксорубицина в спектрах КР. В работе показано, что липосомы@Ag@Au являются наиболее перспективными материалами для использования в качестве контейнеров для транспортировки и контролируемого выделения лекарственных препаратов. Для таких материалов характерен значительный фототермический эффект, который заключается в быстром разогреве объектов при лазерном воздействии до температуры 39ОС, которая является критической для липосом. При этой температуре начинается разрушение везикул и может происходить выделение лекарственного препарата, инкапсулированного в липосомах. В работе описано создание липосом, содержащих тройной композит GO@Fe3O4@DOX. При помощи метода спектроскопии комбинационного рассеяния доказано образование связей между карбоксильными группами оксида графита и аминогруппами доксорубицина. Биосовместимая поверхность оксида графита содержит значительное количество функциональных групп, способствующих химическому связыванию с доксорубицином. Суперпарамагнитные частицы оксида железа могут быть использованы при гипертермическом лечении и адресной доставки доксорубицина под действием внешнего магнитного поля непосредственно в пораженный орган. Липосома способствует сохранению химической стабильности созданного препарата в средах с различными значениями рН. Использование предлагаемого материала позволит контролируемо доставлять доксорубицин, уменьшить дозы используемого лекарства и, тем самым, снизить негативные последствия действия препарата на организм.
3 1 января 2018 г.-31 декабря 2018 г. Направленный синтез могофункциональных плазмонных везикул для биомедицинских применений
Результаты этапа: В настоящее время для лечения онкологических заболеваний широко применяется антибиотик антрациклинового ряда - доксорубицин. Однако клиническое использование этого препарата ограничено из-за сильного побочного эффекта, связанного с кардиотоксичностью. Адресная доставка препарата непосредственно в пораженный орган позволит уменьшить дозы препарата и ослабить побочные эффекты. Для обеспечения адресной доставки лекарственных средств перспективным является использование композитов, содержащих доксорубицин и наночастицы парамагнитного оксида железа. Химическая связь между доксорубицином и оксидом железа имеет ионную природу, при этом молекулы лекарства образуют хелатный комплекс с ионами железа. Исследование кинетики выделения доксорубицина из композита с оксидом железа позволит получить количественную информацию о том, сколько доксорубицина может присоединиться к суперпарамагнитным наночастицам оксида железа, и как зависит количественное выделение доксорубцина от pH и температуры. Поэтому одна из задач настоящего исследования посвящена синтезу и исследованию свойств композитов, содержащих доксорубицин и парамагнитный оксид железа состава Fe3O4, и исследованию кинетики выделения доксорубицина из композита. Получение магнитных частиц Fe3O4 Для синтеза магнитных наночастиц оксида железа выбрали методику сопропорционирования Fe+3 и Fe+2 в аммиачном растворе. Соли FeCl2*4H2O и Fe(NO3)3*6H2O с массами 1.666 г и 7.066 г, соответственно, растворили в 17 мл воды, затем добавили 180 мл раствора аммиака концентрацией 4%. Реакционная смесь приобрела черный цвет. . Раствор был нагрет до 80 оС и оставлен на 30 минут при постоянном перемешивании. Частицы в полученном растворе заметно притягивались к магниту. Осадок Fe3O4 из раствора отделили при помощи магнита После образец был помещен в ультразвуковую ванну на 20 минут для диспергирования полученных магнитных частиц. Процесс протекал в соответствии с реакцией: Fe+2 + 2Fe+3 + 8OH- = Fe3O4 + 4H2O Приготовление раствора доксорубицина (DOX) Для приготовления раствора доксорубицина с концентрацией 1 мг/мл в дистилированной воде использовали коммерчески доступный доксорубицина гидрохлорид (TEVA, производитель Нидерланды). Цвет полученного раствора были насыщенно-оранжевыми. Получение композитов DOX/Fe3O4 Для получения композита указанного состава к 40 мл раствора DOX (1 мг/мл) добавили 4 мг Fe3O4. Образец поместили на магнитную мешалку на 12 часов при комнатной температуре, предварительно химический стакан с образцом был закрыт лентой «Parafilm» и обернут алюминиевой фольгой для защиты от света. Построение градуировочной функции Для получения градуировочной прямой были получены спектры поглощения водных растворов DOX с различными концентрациями: 0.3 мг/мл, 0.1 мг/мл, 0.03 мг/мл, 0.01 мг/мл, 0.003 мг/мл, соответственно. Спектры поглощения растворов DOX были измерены на двух спектрометрах: Perkin Elmer Lyambda 950 и спектрофотометре СФ 103 «Авилон». Уравнения построенных прямых были близки по значениям коэффициентов. Исследование кинетики выделения DOX Для исследования кинетики выделения DOX в средах с различными значениями рН композит состава DOX/Fe3O4 отделили при помощи магнита и перенесли в пленку для диализа (MWCO 1500 kD, Spectrum laboratory Inc.), которую хранили в водном растворе NaN3. Затем пленку с композитом поместили в химический стакан с 25 мл фосфатного буферного раствора (pH 7.4). Стакан поместили при комнатной температуре на магнитную мешалку, скорость перемешивания составила 200 об/мин. Были произведены отборы проб по 3 мл через каждые 30 минут в течение 2.5 часов. Затем раствор в диализной пленке оставили на 12 часов и 72 часа, после чего повторно были произведены отборы проб объемом 3 мл. Опыты были проведены в растворе PBS при 37оС, 40оС, а также в ацетатном буфере (pH 5) при аналогичных температурах. Из результатов рентгенофазового анализа синтезированного в работе оксида железа следует, что образец не является однофазным, кроме фазы Fe3O4 в образце содержится фаза FeOOH. Однако наличие этой примесной фазы не противоречит цели, поставленной в работе, поскольку FeOOH также обладает суперпарамагнитными свойствами и может быть использован для создания композита с доксорубицином и оксидом графита. Магнитные свойства. Зависимость намагниченности насыщения М(Н), нормированной на массу образца, от поля для магнитной жидкости оксида железа имеет обратимый характер и нелинейна, остаточная намагниченность практически отсутствует (рис.9). Оба эти факта однозначно подтверждают то, что в ходе данной работы были получены суперпарамагнитные частицы, содержащие Fe3O4. Из микрофотографий образца оксида железа видно, что наночастицы Fe3O4 состоят из хорошо ограненных кубических кристаллитов со средним размером около 8 нм (рис. 10). УФ-видимая спектроскопия. Метод оптической спектроскопии является информативным для анализа композитов, содержащих доксорубицин, поскольку чистый доксорубицин имеет максимумы поглощения при 480 и 500 нм. При анализе спектров поглощения проб, взятых при проведении диализа образцов композитов при различных условиях, наблюдали максимумы поглощения характерные для доксорубицина. При температуре 22оС в растворе PBS выделения доксорубцина не происходит. По мере увеличения температуры (37оС, 40оС) и времени диализа наблюдали увеличение интенсивности максимумов поглощения доксорубицина). Из этого можно сделать вывод об увеличении концентрации доксорубицина в растворе буфера, что свидетельствует о зависимости выделения свободного доксорубицина в пробах от времени и температуры. Исходя из эксперпментальных результатов, следует, что с понижением pH внешнего раствора доксорубцин в процессе диализа быстрее выделяется из композита. Это объясняется наличием в молекулярной струкутре докосрубцина амино-групп, которые протонируются в кислой среде. Принимая допущение о том, что весь доксорубцин вышел за 72 часа, и используя построенную градуировочную прямую (рис. 14), были получены зависимости выделения доксорубицина (в процентах от суммарно загруженного количества) от температуры и pH внешнегог раствора. После 2-ух часов диализа в фосфатном буферном растворе (pH 7.4) выделилось 8% загруженного докосрубцина. За это же время в буферном растворе с pH 5 выделилось 10% от первоначального количества лекарства. При проведении кинетических экспериментов выделения доксорубцина при различных температурах (37oC, 40oC) показано незначительное влияние этого фактора.. После 2,5 часов диализа наблюдали выделение примерно одинковых количеств доксорубцина (11,5%) в растворах при различных температурах. Полученные данные и зависимости полностью подтверждают теоретические предположения о кинетике выделения доксорубцина из композита Fe3O4-DOX. Молекулярная люминесценция. Метод молекулярной люминесценции позволил получить дополнительное доказательство о вхождении антибиотика в состав композита. Наличие характерного максимума на спектре флуоресценции в области 540 нм свидетельствует о наличии доксорубцина в образце после 2-ух часового диализа в фосфатном буфере, так как доксорубицин является флуоресцирующим веществом. Выводы из данного раздела исследования 1. В ходе выполнения работы были получены суперпарамагнитные наночастицы оксида железа 2. В работе был получен композит на основе оксида железа и доксорубицина 3. Анализ литературы показал, что для определения доксорубицина в растворе может быть использован метод люминесцентной спектроскопии 4. Показано, что методами оптической спектроскопии может быть исследована кинетика выделения доксорубицина из композита Fe3O4-DOX 5. Разработана методика определения доксорубицина при различных температурных условиях и в различных средах Вторая часть настоящего исследования была посвящена созданию многофункциональных магнитных микросфер, сочетающих функцию двойного магнитного и молекулярного нацеливания на опухолевые ткани, состоящих из оксида графита, оксида железа Fe3O4 и доксорубицина (GO@Fe3O4@DOX). Развитие новых способов адресной доставки лекарственных препаратов позволит значительно улучшить безопасность и эффективность их терапевтического воздействия. Для решения этой проблемы перспективными являются материалы на основе графена и его производных – в том числе, оксида графита, - интенсивное изучение которых началось с работ А.К. Гейма и К.С. Новоселова. [1] Благодаря своей уникальной структуре, напоминающей пчелиные соты и состоящей из монослоев атомов углерода, находящихся в состоянии sp2 – гибридизации, графен обладает отличной тепло- и электропроводностью, большой удельной поверхностью и биосовместимостью. Графен и его производные содержат шестиатомные слои с системой сопряженных π-связей, что позволяет рассматривать эти соединения как планарные ароматические макромолекулы, на поверхности которых можно иммобилизовать различные макромолекулярные вещества, включая лекарственные препараты, благородные металлы и магнитные материалы в виде наноразмерных частиц. Наличие на поверхности различных кислородсодержащих функциональных групп (-COOH, -COH, -OH, =O), образующихся при химическом синтезе графена и оксида графита, способствует образованию химических связей между углеродсодержащим материалом и лекарственным препаратом доксорубицином, содержащим аминогруппы –NH2. Адресная доставка доксорубицина непосредственно в пораженный орган позволит уменьшить дозы препарата и, соответственно, ослабить побочные эффекты. Для решения поставленной задачи перспективным является создание композитов, содержащих доксорубицин, наночастицы парамагнитного оксида железа и оксид графита. Молекула доксорубицина, содержащая аминогруппу, способна образовывать с оксидом железа хелатный комплекс, что обеспечивает прочное химическое связывание. Наличие суперпарамагнитных свойств у наночастиц оксида железа позволит использовать внешнее магнитное поле для доставки лекарственного препарата в пораженный орган. Использование в составе композита оксида графита, обладающего планарной структурой и развитой поверхностью, позволит сорбировать на его поверхности значительные количества оксида железа, химически связанного с доксорубицином. Кроме того, наличие на поверхности оксида графита (GO) кислородсодержащих функциональных групп способствует дополнительному образованию химических связей между аминогруппами молекулы доксорубицина и карбоксильными группами оксида графита. Учитывая вышеизложенное, цели настоящего исследования следующие: Создание многофункциональных магнитных микросфер, сочетающих функцию двойного магнитного и молекулярного нацеливания на опухолевые ткани, состоящих из оксида графита, оксида железа Fe3O4 и доксорубицина (GO@Fe3O4@DOX). Исследование процессов выделения доксорубицина из композитов GO@Fe3O4@DOX в средах, моделирующих биологические жидкости. Оксид графита был приготовлен в соответствии с модифицированным методом, который мы немного изменили. К смеси растворов концентрированных кислот H2SO4 и H3PO4, взятых в объёмном соотношении 9:1 (240мл и 27мл, соответственно), добавили 2г графита и порционно и постепенно 12 г KMnO4. Раствор стал тёмно зелёным, при этом наблюдали повышение температуры смеси до 37 градусов. После перемешивания реакционной смеси в течение 12 часов прилили 10 мл 30%-ной H2O2 и охладили. Затем полученный раствор разбавили в два раза 5%-ной H2SO4 и добавили 12г H2C2O4 при перемешивании, при этом цвет менялся из тёмно-зелёного в зелёно-коричневый. Далее раствор центрифугировали, надосадочную жидкость декантировали, к осадку приливали дистиллированную воду и снова центрифугировали до тех пор, пока значение pH надосадочной жидкости не достигло 7. Образец подвергли сублимационному обезвоживанию. Получение магнитных наночастиц Наночастицы Fe3O4 были получены в соответствии с методом, основанном на сопропорционировании солей железа (II) и железа (III) в растворе аммиака. А именно, 7,066 грамм Fe(NO3)3*10H2O и 1,666 грамм FeCl2*4H2O были растворены в минимальном объёме дистиллированной воды. К полученному раствору было прилито 180 мл 5%-ного раствора аммиака, при этом выпал чёрный осадок, надосадочная жидкость потемнела. Осадок в присутствии постоянного магнита приходил в движение. Полученную суспензию перемешивали в течение получаса при нагревании до 80 градусов для удаления избыточного аммиака, а затем оставили перемешиваться без нагревания ещё 12 часов. Для более глубокого измельчения частиц стакан поместили в ультразвуковую ванну на 60 минут. Итоговые частицы были получены после сушки на воздухе полученной суспензии. Получение магнитных липосом Магнитные микросферы были получены по аналогии с методом, описанном в статье. Для приготовления суспензии навески 20 мг Fe3O4 и 5 мг GO в 5мл воды были помещена в ультразвуковую ванну на час. После остывания до комнатной температуры к суспензии бы добавили 5 мг доксорубицина. Полученную смесь прилили к вязкому раствору 200 мг хитозана в смеси 5 мл воды с 0,1 мл ледяной CH3COOH и перемешивали в течение часа. Далее вязкую суспензию по каплям добавили к смеси раствора пирофосфата натрия в воде и этилового спирта, при этом наблюдали образование капсул, размер которых зависел от соотношения исходных веществ, количества пирофосфата и от способа прикапывания вязкой суспензии в раствор. Микросферы рызмерами 0,2-1 мкм (рис. 6, нижний ряд) были получены при добавлении суспензии в раствор, содержащий 80% спирта по объёму и 1%-ный раствор пирофосфата. Капсулы (рис. 6, верхняя часть) были получены добавлением суспензии в смесь, содержащую 1%-ный раствор пирофосфата и этиловый спирт в объёмном соотношении 10:2. Разницу в размерах можно объяснить разницей в количестве пирофосфата, способствующего эмульгированию жира и более эффективному инкапсулированию. Полученные капсулы реагировали на присутствие постоянного магнита, но в гораздо меньшей степени, чем наночастицы Fe3O4. Для исследования кинетики выделения доксорубицина капсулы были разделены на несколько частей и помещены в плёнку для диализа (MWCO 1500 kD, Spectrum laboratory Inc., которую хранили в водном растворе NaN3), а затем в PBS буфер (среда крови) и буфер, со значением pH 5,5 (среда опухоли) (рис. 5). Через фиксированные промежутки времени часть раствора, куда диффундировал доксорубицин, отбирали для исследования спектров оптического поглощения доксорубицина. На основании этих данных оценивали скорость увеличения концентрации доксорубицина в растворе. Кинетические эксперименты проводили в буферах, которые подвергались не только перемешиванию, но и дополнительному воздействию ультразвукового излучения. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты рентгенофазового анализа Из данных рентгенофазового анализа (рис. 7) следует, что синтезированный образец оксида железа не является однофазным, и содержит фазы Fe3O4, FeOOH, Fe2O3. Все присутствующие фазы обладают магнитными свойствами. На рентгенограмме образца оксида графита отсутствует пик при 2𝜃 = 26,60 градусов, что свидетельствует об отсутствии в образце непрореагировавшего графита. Наличие рефлексов при 2𝜃 = 10,34 градусов и при 2𝜃 = 42,50 градусов однозначно доказывает наличие фазы оксида графита. Основные рефлексы рентгенограммы, полученной для микросфер Fe3O4/GO/CHI/DOX c учётом многофазности синтезированного оксида железа, соответствуют рентгенограмме, приведенной в статье [12], что свидетельствует об образовании магнитных микросфер и загрузке в них доксорубицина. Результаты просвечивающей электронной микроскопии Результаты ПЭМ свидетельствуют об образовании кластеров частиц оксида железа диаметром 100-300 нм. Средний диаметр частиц составил (9 ± 4) нм. Данные электронной дифракции свидетельствуют об образовании оксида железа Fe3O4. Результаты магнитных измерений Зависимость намагниченности насыщения М(Н), нормированной на массу образца, от поля для изученных частиц имеет обратимый характер и нелинейна, остаточная намагниченность практически отсутствует. Оба эти факта однозначно подтверждают то, что в ходе данной работы были получены суперпарамагнитные частицы, содержащие Fe3O4. Чувствительность микросфер к магнитному полю заметно меньше, что согласуется сданными статьи. Результаты динамического светорассеяния По данным динамического светорассеяния при добавлении буфера PBS к полученным микросферам размером 0,2-1 мкм в растворе образуются однородные ассоциаты с размером около 2000 нм. Результаты УФ-видимой спектроскопии Для исследования кинетики выделения доксорубицина использовали градуировочный график, построенный студентом 213 группы Каплиным Александром, связывающий концентрацию раствора доксорубицина в растворе с интенсивностью полсы поглощения раствора в области 480 нм . На представлены спектры, полученные при исследовании скорости выделения доксорубицина из растворов микросфер и капсул. На основании данных спектров и калибровочного графика можно судить об изменении концентрации доксорубицина в растворе от времени. Из рис. 17 видно, что степень вымываемости доксорубицина из микросфер составила 65%, а из капсул – 70%. Из схожести кинетики выделения доксорубицина можно сделать вывод о независимости степени и скорости вымывания антибиотика от размеров сфер. Кинетические кривые выделения доксорубицина из сублимационно высушенных капсул представлены на рис. 19. На основании рис. 18 и рис. 19 можно сделать вывод о том, что большая часть антибиотика выделяется из сублимационно высушенных сфер без применения ультразвука, причём для микросфер в буфере с pH=5,5 этот процесс происходит в большей степени, чем для сфер в буфере PBS. Из рис. 20 и рис. 21 следует, что скорость высвобождения доксорубицина из свежеприготовленных сфер без применения ультразвука гораздо меньше, чем в случае использования ультразвуковой обработки, при этом в ацетатном буфере с pH=5,5 скорость выделения доксорубицина выше, чем в PBS. Полученные результаты свидетельствуют об ускорении процессов выделения доксорубицина при ультразвуковом воздействии на макрокапсулы с любой химической предысторией, что подтверждает образование прочных связей лекарственного препарата с оксидами графита и железа в полученном композите. Ускорение процесса выделения антибиотика в среде, значение рН которой такое же, как у онкологических клеток, указывает на перспективность использования донного материала как препарата для лечения злокачественных новообразований. ВЫВОДЫ В процессе выполнения данного этапа работы: 1. Получен оксид графита модифицированным методом. 2. Получены частицы Fe3O4 методом щелочного осаждения и изучены их свойства. 3. Получены магнитные микрокапсула тройного композита DOX/Fe3O4/GO с разной предысторией (с сублимационной сушкой и без неё). 4. Методом УФ-видимой спектроскопии исследована кинетика выделения доксорубицина из композита с разной предыстории в средах с различными значениями pH. Полученные результаты свидетельствуют об образовании прочных связей лекарственного препарата с оксидами графита и железа в полученном композите. 5. Ускорение процесса выделения антибиотика в среде, значение рН которой такое же, как у онкологических клеток, указывает на перспективность использования донного материала как препарата для лечения злокачественных новообразований. Третья часть исследования проводимого в течение 2018 года была посвящена развитию новых материалов, которые могут быть использованы как для адресной доставки противораковых лекарственных препаратов к пораженным тканям, так и для фототермического лечения опухолей. Для решения данной научной задачи перспективными материалами являются биогели на основе оксида графена и лекарственного препарата доксорубицина. Данные материалы позволят сочетать фототермическое и терапевтическое лечение онкологических заболеваний. Из литературных данных известно, что двумерные слои производных графена, обладающие полиароматической структурой, способны преобразовывать световую энергию ближнего инфракрасного излучения в тепло, которое является достаточным для термического разрушения опухоли. Однако идеальный графен является гидрофобным материалом, что затрудняет его использование в качестве платформы для загрузки лекарств. В последнее время для получения графеноподобных материалов используют различные химические приемы, основанные на окислении графита неорганическими реагентами, при этом получают оксид графена (GO), который является гидрофильным материалом, обладает высокой удельной поверхностью и содержит различные кислородсодержащие группы: фенольные, оксидные, эпоксидные, карбонильные и карбоксильные. Этот материал является полярным, что способствует его химическому взаимодействию с доксорубицином. Однако наличие большого количества функциональных групп вызывает потерю его планарности и, тем самым, уменьшает количество загруженного лекарства. Поэтому наиболее перспективными являются частично восстановленные формы оксида графена (r-GO), которые сохраняют гидрофильность, планарность, фототермические свойства и способность к образованию химических связей с лекарственным препаратом. Однако r-GO является неорганическим веществом, поэтому он не обладает достаточной коллоидной стабильностью, что может легко привести к агрегации во время внутривенного использования и вызвать летальный исход Этих недостатков должны быть лишены биологические гели, содержащие восстановленный оксид графена, доксорубицин и природные биосовместимые материалы: желатин и хитозан, которые обладают лучшей коллоидной устойчивостью из-за их гидрофильности, а также гибкостью, которая способствует их лучшему проникновению в мягкие ткани, например, в кожные покровы или хрящевые и костные ткани. Биогели, являющиеся нетоксичными материалами и содержащие r-GO и биополимер, способны инкапсулировать доксорубицин через электростатическое взаимодействие лекарства и r-GO, которым можно управлять, изменяя рН среды. Это означает, что процесс выделения доксорубицина из гелей может быть ускорен или замедлено при соответствующем изменении рН. Интересным свойством биополимеров является их способность изменять вязкость при незначительном повышении температуры. Это означает, что воздействуя на материал светом определенной длины волны, можно обеспечить нагрев геля, изменить его вязкость и увеличить проникающую способность и доставку лекарства к пораженным тканям, тем самым, будет обеспечена адресная доставка лекарственного средства и снижен его побочный эффект. Учитывая все выше изложенное, настоящее исследование посвящено поиску оптимальных путей создания биодеградируемых гелеобразных композитов, содержащих восстановленный оксид графита, доксорубицин и биополимер, и изучению процессов выделения лекарственного препарата в средах, моделирующих биологические жидкости. Синтез оксида графита проводили согласно методу, описанному выше. Получение композитов на основе оксида графита, хитозана и альгината натрия Синтез проводили согласно следующей методике: 12 мг хитозана (CS), растворили в 1.9 мл ледяной уксусной кислоты, после чего pH раствора довели до значения 5.5-6 с помощью гидроксида натрия, общий объем раствор составил 60 мл. К раствору добавили водный раствор оксида графита (12 г, 0.2 мг/мл). Смесь интенсивно перемешивали в течение 30 минут, затем на 30 минут поместили в ультразвуковую ванну. Приготовление композита GO-CS/SA проводили аналогично, к раствору хитозана в уксусной кислоте добавили 12 мг альгината натрия. Затем прилили водный раствор оксида графита (12 г, 0.2 мг/мл). Смесь интенсивно перемешали в течение 30 минут, затем на 30 минут поместили в ультразвуковую ванну. Получение нанолистов на основе восстановленного оксида графита и желатина Синтез проводили с.о.: . 1.5 г желатина, растворили в 50 мл воды, после чего раствор перемешивали 30 минут при 80 ˚C. Затем добавили водный раствор оксида графита (50 мл, 0.2 мг/мл) и продолжили перемешивание при 80 ˚C в течение 30 минут. После чего продолжили перемешивание при 95 ˚C в течение 5 часов, при этом раствор из коричнево-желтого стал черным, сто свидетельствует о частичном восстановлении оксида графита. Синтез нанокомпозитов GO-DOX Синтез нанокомпозитов GO-DOX. проводили с.о.: 6 мг оксида графита, растворили в 3 мл воды, затем добавили 1 мл раствора доксорубицина DOX (2мг/мл). Смесь перемешивали на магнитной мешалке без доступа света в течение 24 часов. Синтез композитов GO/CS/DOX и GO/CS/SA/DOX Синтез композитов GO/CS/DOX и GO/CS/SA/DOX проводили с.о.: 1 мг DOX растворили в 2 мл PBS, полученный раствор добавили к 2 мл раствора оксида графена и хитозана с общей концентрацией оксида графена, хитозана (0.2 мг/мл). После чего реакционную смесь вначале поместили в ультразвуковую ванну на 30 минут, а затем на магнитную мешалку без доступа света в течение 24 часов. Для синтеза композитов на основе оксида графита, хитозана, альгината натрия доксорубицина приготовили 2 мл раствора DOX в PBS (1 мг DOX, 2 мл PBS), который добавили к 2.5 мл раствора оксида графена, хитозана, альгината натрия, с общей концентрацией оксида графена, хитозана и альгината натрия (0.2 мг/мл). После чего реакционную смесь вначале поместили в ультразвуковую ванну на 30 минут, а затем на магнитную мешалку без доступа света в течение 24 часов. Синтез нанолистов на основе GO/Gel - DOX Для синтеза композитов на основе оксида графита, желатина и доксорубицина, приготовили раствор доксорубицина с концентрацией 0.2 мг/мл. К 2.5 мл раствора GO-Gel с концентрацией GO/Gel (0.5 мг/мл) добавили 2 мл раствора DOX (0.2 мг/мл). После чего реакционную смесь вначале поместили в ультразвуковую ванну на 30 минут, а затем на магнитную мешалку без доступа света в течение 24 часов. Спектроскопия комбинационного рассеяния наиболее чувствительна к высоко симметричным ковалентным связям с маленьким или отсутствующим дипольным моментом. С - С связи полностью соответствуют этому критерию, поэтому спектроскопия КР способна обнаруживать мельчайшие изменения в структуре оксида графита, что делает ее чрезвычайно ценным методом для данного исследования. На рис. 16 представлены спектры комбинационного рассеяния оксида графита и композитов на его основе, нанесенных на кремневую пластину. Во всех спектрах присутствуют характеристические полосы для оксида графита и других углеродных материалов моды: G (1593 см-1); D (1334 см-1). Соотношение интегральных интенсивностей компонентов спектра ID/IG может быть рассмотрено как соотношение доли sp3/sp2 углерода в материале. Таким образом, соотношение интенсивностей можно считать величиной, пропорциональной размеру доменов листа графита, а обратное соотношение – значением, пропорциональным концентрации дефектов. Для оксида графита, приготовленного в настоящей работе, соотношение ID/IG составляет 1,1 Для всех образцов на основе оксида графита сохраняется соотношение ID/IG присущее исходному образцу, что свидетельствует о сохранении дефектности, заложенной в исходном оксиде графита. Исследование кинетики выделения доксорубицина из композитов методом УФ- видимой спектроскопии Для всех полученных в работе материалов необходимо было доказать вхождение доксорубицина в композит при длительном выдерживании в растворе лекарственного средства. Это было сделано при помощи УФ-видимой спектроскопии поглощения растворов (рис.17). Из данных, представленных на рис. 17, видно, что в спектрах поглощения растворов композитов есть полоса поглощения при длине волны 480 нм, которая является характеристической полосой чистого DOX, следовательно, все композиты содержат загруженный в них доксорубицин, и для них может быть изучена кинетика выделения доксорубицина в растворе PBS, моделирующем межтканевую жидкость. Расчет концентраций выделившегося DOX от времени производился согласно градуировочной прямой и расчетной формуле, предоставленной студентом 213 г. Химического факультета МГУ Каплиным А.В. (рис. 18) На рисунках 19 - 23 (а, б) представлены результаты УФ- видимой спектроскопии растворов и кинетические кривые выделения доксорубицина для всех композитов на основе оксида графита. Результаты кинетических экспериментов показали, что максимальные загрузка доксорубицина и скорость его выделения в PBS наблюдается в случае композита, содержащего желатин. Для композита указанного состава были проведены аналогичные кинетические эксперименты в ацетатном буфере (pH=5.5), среда которого по кислотности блика к онкологическим клеткам. (рис. 22 б). Видно, что скорость выделения доксорубицина в кислой среде больше, чем в нейтральной. Так, после 10 мин выдержки в кислой среде наблюдали выделение значительного количества доксорубицина. Причина такого поведения заключается в следующем. В кислой среде может происходить разрушение полипептидных связей желатина, аминогруппы образовавшихся при этом аминокислот могут протонироваться. Этот процесс будет способствовать разрушению связей желатина с оксидом графита. Аналогично, могут протонироваться и аминогруппы доксорубицина, что приведет к разрушению его связей с функциональными группами оксида графита. Следовательно, в кислой среде выделение доксорубицина происходит быстрее, чем в средах с рН, близким к нейтральному. Выводы 1. В ходе выполнения работы проведен поиск и анализ литературы по методам синтеза и свойствам гелеобразных композитов, содержащих производные графена, доксорубицин и биополимер 2. При выполнении исследования получен оксид графита по модифицированному нами методу, а также проведены его исследования методами рентгено-фазового, дифференциально-термического анализа и спектроскопии комбинационного рассеяния. 3. В ходе работы отработаны способы получения наногелей на основе оксида графита, хитозана и желатина. 4. Методом УФ-видимой спектроскопии доказано вхождение лекарственного препарата доксорубицина в биогели на основе оксида графита, хитозана и желатина. 5. В работе проведено изучение кинетики выделения доксорубицина из биогелей в растворах, моделирующих биологические жидкости с рН = 7,4 и 5,5. Показано, что максимальные загрузка доксорубицина и скорость его выделения наблюдается в случае композита, содержащего желатин. Отмечено, что в кислой среде выделение доксорубицина происходит быстрее, чем в средах с рН, близким к нейтральному. Четвертая задача исследования посвящена синтезу и изучению физико-химических свойств плазмонных гибридных материалов: липосом и гелеобразных композитов на основе наночастиц благородных металлов. Липосомы, изучаемые в данной работе, образованы одним из самых распространенных липидов – фосфатидилхолином, наночастицами благородных металлов и доксорубицином. Такие липосомы нетоксичны, при определенных условиях могут поглощаться клетками, их мембрана может сливаться с клеточной мембраной, что ведет к внутриклеточной доставке их содержимого. Заключенный в липосомы антибиотик антрациклинового ряда ‒ гидрохлорид доксорубицина, широко используемый в различных методах лечения рака, оказывается защищенным от воздействия ферментов, что увеличивает его устойчивость к биодеструкции в биожидкостях и уменьшает его кардиотоксичное воздействие на организм. Введение в состав липосом наночастиц золота и серебра, обладающих высоким химическим сродством к азот-содержащим группам, входящим в состав доксорубицина, обеспечивает химическое связывание молекул благородного металла с молекулой доксорубицина. Способность наночастиц благородных металлов преобразовывать световую энергию в тепловую позволит обеспечить разогрев и разрушение липосом, дозированное выделение лекарственного препарата из них под воздействием света, обеспечить адресную доставку лекарств и осуществлять фототермическое лечение злокачественных новообразований. Наличие в составе липосом наночастиц золота и серебра, обладающих плазмонным резонансом, позволит проводить прецизионную подстройку полосы плазмонного резонанса липосомы под длину возбуждения лазера и полосу поглощения лекарства, что обеспечит большее усиление сигнала доксорубицина в спектроскопии комбинационного рассеяния и повысит точность анализа лекарственного препарата. Перспективными плазмонными материалами могут быть гелеобразные нанокомпозиты на основе желатина или хитозана и наночастиц золота. Хитозан является полисахаридом, аминосахаром, содержащим большое количество аминогрупп. Роль хитозана состоит в следующем: амино-группы хитозана способны приобретать положительный заряд, что обеспечит электростатическое связывание с отрицательно заряженными наночастицами золота, находящимися в анионной оболочке. Образующиеся интермедиаты агломерируют и напоминают скрученный клубок, на котором происходит дальнейший рост наночастиц металла в форме цветов. Изменяя количество хитозана и значение рН раствора, в котором происходит формирование наночастиц, можно изменять морфологию наночастиц благородного металла и размеры его кластеров. Такое явление должно сопровождаться смещением полосы плазмонного резонанса от 700 нм в сторону меньших длин волн около 520 нм, характерных для наночастиц золота сферической формы. Таким образом, если в состав композита ввести наночастицы золота, стабилизированные хитозаном, и доксорубицин, то можно производить регулировку размеров наночастиц золота и положение полосы плазмонного резонанса под длину возбуждающего лазера, управлять фототермическими эффектом и повысить точность анализа доксорубицина методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Наночастицы разветвленной формы обладают способностью к дополнительному связыванию доксорубицина со своей поверхностью, кроме этого, у них имеется значительное количество «горячих центров», которые способствуют существенному усилению сигнала от анализируемого вещества. Еще одним перспективным материалом для создания биосовместимого геля, содержащего наночастицы благородного металла, является природный полимер желатин, традиционно используемый для создания оболочек лекарственных препаратов. Желатин получают контролируемым гидролизом белка млекопитающих – коллагена. Особенность желатина состоит в повторяющемся фрагменте аминокислот: глицин – X – Y, где X – пролин, Y - гидроксипролин. Такая последовательность обеспечивает спиральную структуру желатина и его способность образовывать гели за счет захвата в спиральные области молекул воды. Можно ожидать, что такие гели смогут лучше удерживать лекарственный препарат доксорубицин, защитят его от разрушающего воздействия межтканевой жидкости, что позволит доставлять лекарство непосредственно к пораженным органам. Такие гели должны быть особенно востребованы при лечении заболеваний костной и хрящевой ткани. Благодаря наличию аминокислот, обладающих электронно - донорными свойствами, желатин может быть использован одновременно в качестве восстанавливающего, регулирующего рост и стабилизирующего агента для синтеза наночастиц металла с желаемыми морфологией и контролируемыми размерами. Это позволит минимизировать количество химических реактивов, традиционно используемых для синтеза металлических наночастиц. Так как желатин обладает значительной термочувствительностью и способен изменять конформацию молекул и вязкость при изменении температуры, то, варьируя количество и температуру желатина, можно изменять размеры и морфологию наночастиц. Таким образом, в настоящей работе планируется синтезировать липосомы и гелеобразные композиты на основе наночастиц благородных металлов и осуществить загрузку в них и лекарственного препарата доксорубицина. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ: СИНЕЗ ЛИПОСОМ: Для синтеза липосом приготовили буферный раствор, содержащий 50 мМ KH2PO4, 2 мМ MgSO4, рН=7.5. Буфер хранили при температуре +40С, он стабилен в течение 1-2 месяцев. Липосомы готовили из L-α-фосфатидилхолина (лецитина, Sigma), выделенного из соевых бобов. 40 мг лецитина разводили в 1 мл буферного раствора, полученную суспензию гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе до исчезновения комков и получения однородной мутной суспензии. Полученный 1 мл суспензии переносили в пробирку Эппендорфа, охдаждаемую в стакане со льдом, после чего проводили ультразвуковую обработку коллоидного раствора липосом при помощи пальца на ультразвуковом дезинтеграторе полного просветления суспензии (около 5 мин). Полученную суспензию липосом разбавляли буферным раствором до объема 10 мл (концентрация липосом 1 мг/мл) и использовали для дальнейших экспериментов. СИНТЕЗ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА: МЕТОД ТУРКЕВИЧА: 0,14 г Na3Cit*2H2O растворили в воде и довели объем раствора до 14 мл. К 600 мкл раствора HAuCl4 с концентрацией 0,0603 М добавили 97 мл воды, довели до кипения, затем к кипящему раствору прилили 3 мл приготовленного раствора цитрата натрия. Раствор вновь довели до кипения и выдержали 2 минуты. Затем раствор оставили остывать до комнатной температуры при перемешивании. При охлаждении окраска раствора последовательно меняла свой цвет с прозрачного на сиреневый, а затем на вишнёвый. Процесс протекал по уравнению: 3Na3C6H5O7 + 2HAuCl4 = 2Au↓ + NaC5H5O5 + 2C5H6O5+ 3CO2↑ + 8NaCl МЕТОД ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЖЕЛАТИНОМ: Предварительно были приготовлены растворы желатина различной концентрации. Необходимое количество желатина растворили в дистиллированной воде в ультразвуковой ванне в течение 10-15 минут. С повышением процентного содержания желатина увеличивалась вязкость раствора, при работе с образцами с содержанием желатина 6-10% необходимо было подвергать раствор дополнительной ультразвуковой обработке. Далее был приготовлен 20 мл раствора HAuCl4 (с=0,003015М) из раствора с концентрацией 0,0603М путем смешивания 1 мл данного раствора и 19 мл дистиллированной воды. Наночастцы золота были получены путем смешения 5 мл раствора желатина (0,5-10%) с 5 мл приготовленного раствора тетрахлораурата при непрерывном перемешивании при нагревании до 90°С. При потемнении раствора нагревание и перемешивание прекращали. МЕТОД ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЗОЛОТОХЛОРИСТОВОДОРОДНОЙ КИСЛОТЫ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТОЙ В РАСТВОРЕ ХИТОЗАНА: Предварительно были приготовлены растворы хитозана различных концентраций (0,05%, 0,4%, 2,5%) и 1% - ной уксусной кислоты. Необходимое количество сухого хитозана растворили в растворе 1% - ной уксусной кислоты при непрерывной ультразвуковой обработке в течение 30 минут до приобретения прозрачности раствором. Далее к 5 мл каждого раствора прилили 40мкл раствора HAuCl4 с концентрацией с=0,0603М. Раствор непрерывно перемешивали на магнитной мешалке в течение 30 минут, затем добавили 3мл 1% - ного водного раствора аскорбиновой кислоты, ,после чего наблюдали потемнение раствора. Растворы с различным содержанием хитозана характеризуются различными цветами: • 0,05% - темно-синее окрашивание. • 0,4% - оранжево-красное окрашивание. • 2,5% - зелено-коричневое окрашивание. При изменении рН растворов с 5,5 до 3,0 цвет растворов не изменялся. СИНТЕЗ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА: ВОССТАНОВЛЕНИЕ РАСТВОРА НИТРАТА СЕРЕБРА ЦИТРАТОМ НАТРИЯ (АНАЛОГ МЕТОДА ТУРКЕВИЧА) К 50 мл дистилированной воды прилили 300 мкл раствора нитрата серебра (1% w/v). Раствор довели до кипения, затем к кипящему раствору прилили 3 мл раствора цитрата натрия (1% w/v). Раствор вновь довели до кипения и выдержали 2 минуты. Раствор изменил цвет с прозрачного на желтый. СИНТЕЗ ЛИПОСОМ С НАНОЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА: Для получения липосом, содержащих наночастицы золота, был приготовлен состав с соотношением числа наночастиц золота к липосомам 20/1. Для этого к 10 мкл раствора липосом добавили 5940мкл раствора наночастиц золота. Раствор подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин, чтобы обеспечить диффузию наночастиц золота внутрь липосомы. СИНТЕЗ ЛИПОСОМ С НАНОЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА: Для получения липосом, содержащих наночастицы серебра, к 10 мкл раствора липосом (концентрация 1мг/мл) было добавлено 5940 мкл приготовленного раствора наночастиц серебра. Раствор подвергали ультразвуковой обработке в течение 10 мин, Раствор приобрем молочно-желтоватый цвет. СИНТЕЗ ЛИПОСОМ С НАНОЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА И СЕРЕБРА: Для получения липосом, содержащих наночастицы серебра и золота, к раствору липосом, содержащих наночастицы серебра, добавили 500 мкл раствора HAuCl4 (0,0603 М) и оставили на час на магнитной мешалке, цвет раствора стал темно фиолетовым. СИНТЕЗ ЛИПОСОМ, СОДЕРЖАЩИХ НАНОЧАСТИЦЫ БЛАГОРОДНЫХ МЕТАЛЛОВ И ДОКСОРУБИЦИН: Для получения липосом, содержащих доксорубицин (DOX), к 1 мл суспензии липосом добавили 200 мкл раствора DOX с концентрацией 1мг/мл и подвергли ультразвуковой обработке в ванне в течение 10 минут. В работе использовали доксорубицин фирмы TEVA (производство Нидерланды). Присутствие доксорубицина в составе липосом, содержащих наночастицы благородных металлов, увеличивает устойчивость наночастиц к агрегированию за счет формирования дополнительной оболочки из доксорубицина. Это оболочка образуется в результате возникновения ионных связей между группой NH3+ доксорубицина и цитратной оболочкой наночастиц. СИНТЕЗ КОМПОЗИТА НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА, ЖЕЛАТИНА И ДОКСОРУБИЦИНА: Для получения композита, содержащего DOX, к 5 мл раствора наночастиц золота и желатина (0,5-10%) добавили 1мл раствора DOX с концентрацией 1мг/мл и подвергли ультразвуковой обработке в ванне в течение 30 минут. СИНТЕЗ КОМПОЗИТА НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА, ХИТОЗАНА И ДОКСОРУБИЦИНА К 5 мл раствора наночастиц золота и хитозана (0,05%, 0,4%, 2,5%) добавили 1 мл раствора DOX (1 мг/мл). Далее подвергли ультразвуковой обработке в течение 30 минут. СИНТЕЗ КОМПОЗИТА НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА И ДОКСОРУБИЦИНА, ЖЕЛАТИНА С ДОБАВЛЕНИЕМ АЛЬГИНАТА НАТРИЯ: К 5 мл смеси 2% водного раствора альгината натрия и 2% водного раствора желатина (20/80) при непрерывном перемешивании при 90°С добавили 67 мкл HAuCl4 (с=0,0603 М). После приобретения раствором фиолетового цвета было прекращено нагревание. После охлаждения до комнатной температуры прилили 1 мл водного раствора DOX (1мг/мл). Из литературы известно, что наночастицы чистого серебра имеют самый большой коэффициент экстинкции среди других металлов. В тоже время, они обладают невысокой химической стабильностью. Напротив, наночастицы золота демонстрируют высокую химическую стабильность, но имеют значительно более низкий коэффициент экстинкции. Основываясь на вышесказанном, было предположено, что липосомы, содержащие композиты из наночастиц серебра и золота, должны быть достаточно химически стабильны (благодаря наличию золота) и будут демонстрировать значительный фототермический эффект (обусловленный наночастицами серебра), что может быть использовано для разрушения липосом и контролируемого высвобождения лекарственного препарата. Стоит отметить, что для липосом, содержащих в своем составе доксорубицин и наночастицы благородных металлов, должно наблюдаться значительное усиление сигнала лекарственного препарата в спектрах комбинационного рассеяния, поскольку наночастицы серебра и золота обладают плазмонными свойствами. В настоящей части исследования были синтезированы биметаллические липосомы, содержащие наночастицы серебра и золота и доксорубицин (процедура синтеза описана в экспериментальной части) По данным ПЭМ распределение наночастиц серебра по размерам является однородным, средний размер наночастиц около 20 нм. По данным динамического светорассеяния гидродинамический диаметр липосом, содержащих серебро, составляет около 170 нм, дзета-потенциал l=-0.117mV. Для липосом, содержащих наночастицы серебра и золота, наблюдается неоднородное распределение частиц по размеру. Результаты ПЭМ подтверждают вхождение наночастиц металлов в липосомы, как внутрь так и в оболочку, и свидетельствуют об образовании негладкой формы липосом. Все полученные растворы наночастиц и липосом были изучены методом УФ – видимой спектроскопии поглощения растворов. Как видно из рисунка 20, в спектре поглощения раствора чистых липосом отсутствуют максимумы поглощения, в отличие от спектров поглощения чистых растворов наночастиц благородных металлов и липосом на их основе. Максимум полосы поглощения раствора наночастиц серебра наблюдается при 417 нм, что является характерным для раствора таких наночастиц. В случае липосом, содержащих серебро, наблюдается смещение полосы поглощения в сторону больших длин волн 470 нм, что связано с изменением диэлектрического окружения наночастиц серебра. Для полученных наночастиц золота максимум полосы поглощения находится в области 524 нм, что сохраняется и для липосом на его основе. В случае биметаллических липосом наблюдается незначительный сдвиг максимума поглощения до 527 нм и появление плеча в инфракрасной области, что делает перспективным использование таких липосом для превращения энергии света в тепловую и создания материалов для фототермической терапии. Близость максимума поглощения раствора биметаллических липосом к значению, характерному для раствора наночастиц золота, объясняется ростом золотой оболочки на наночастицах серебра. Доксорубицин имеет характеристические полосы поглощения при 254 и 480 нм (Рисунок 20.). Максимумы полос поглощения растворов чистых и содержащих золото липосом с доксорубицином находятся при тех же длинах волн. В случае липосом, содержащих серебро, наблюдается значительное уширение полосы поглощения, обусловленное суперпозицией полос поглощения молекул доксорубицина и липосом, содержащих серебро. В случае биметаллических липосом, содержащих доксорубицин, наблюдается исчезновение полосы поглощения доксорубицина. Причина наблюдаемого яаления может быть объяснена следующим образом. Известно, что молекула доксорубицина демонстрирует флуоресцентное свечение с длиной волны 595 нм при облучении длиной волны 485 нм. Вероятно, спектры излучения доксорубицина перекрываются со спектрами поглощения биметаллических липосом и липосом, содержащих серебро, при этом наблюдается гашение флуоресцентного свечения из-за плазмонного резонансного перехода энергии между металлическими наночастицами и молекулами доксорубицина. Все полученные липосомы, содержащие доксорубицин, были изучены методом комбинационного рассеяния. К 1 мл раствора липосом, содержащих благородные металлы, добавляли 200 мкл раствора доксорубицина с концентрацией 1 мг/мл, затем проводили обработку в ультразвуковой ванне в течение 10 минут и полученные растворы (30 мкл) наносили на тщательно очищенное предметное стекло. Концентрация доксорубицина составляла 3,7*10-4 М. (Рисунок 21.). Из спектров комбинационного рассеяния видно, что для биметаллических липосом характерно значительное усиления сигнала лекарственного препарата. Это объясняется тем, что длина лазерного излучения, используемого при получении спектра (532 нм), близка к полосе плазмонного поглощения биметаллических наночастиц. ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОТЕРМИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ЛИПОСОМ: Из литературных данных известно, что температура перехода липосом из состояния геля в жидкость находится в интервале 30-40 оС. Такой структурный переход сопровождается разрушением структуры липосом, что можно использовать для высвобождения лекарственных средств, инкапсулированных в липосомы. Для изучения фототермического эффекта 2 мл липосом, содержащих наночастицы золота, серебра и их композит, были подвергнуты обработке непрерывным лазером с длиной волны 450 нм и мощностью 0,5 Вт в течение 30 мин. Для определения температуры растворов использовали инфракрасный термометр «Voltcraft». Данные изменения температуры растворов представлены на рисунке 22. При изучении растворов чистых липосом под воздействием лазера в течение 30 минут не наблюдали изменение температуры их раствора. Как следует из данных, представленных на рисунке 22, температура всех растворов липосом, содержащих благородные металлы, непрерывно изменяется. Быстрее всего температура растет у биметаллических липосом, не так быстро происходит увеличение температуры в случае липосом@Ag и медленнее всего повышается температура для липосом@Au, максимальная температура в этом случае достигает значения 34oC. Для растворов биметаллических липосом и серебросодержащих после 30 минутного воздействия лазерного излучения температура достигает 39°С. Наблюдаемое явление свидетельствует о том, что липосомы@Ag@Au имеют самый высокий коэффициент поглощения при длине лазера 450 нм. Это явление обусловлено плазмонным резонансом наночастиц серебра, который способствует превращению энергии света в тепловую из-за поглощения света соответствующей длины волны. Из результатов, полученных нами, следует, что липосомы@Ag@Au являются наиболее перспективными материалами для использования в качестве контейнеров для транспортировки и контролируемого выделения лекарственных препаратов. Для таких материалов характерен значительный фототермический эффект, который заключается в быстром разогреве объектов при лазерном воздействии до температуры 39°С, которая является критической для липосом. При этой температуре начинается разрушение везикул и может происходить выделение лекарственного препарата, инкапсулированного в липосомах. ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПОЗИТА НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА И ХИТОЗАНА: В последние годы многие исследователи сосредоточились на использовании биосовместимых хитозановых цепей в синтезе металлических наноструктур. Роль хитозана определяется электростатическим взаимодействием между положительными аминовыми группами в хитозане и отрицательно заряженными наночастицами золота. Электростатические взаимодействия между аминовыми группами в хитозане и первичными наночастицами вызывают агломерацию первичных частиц. Эти промежуточные частицы служат зародышами для дальнейшего роста наночастиц золота. По данным ПЭМ образуются довольно редко расположенные наночастицы золота несферической формы (форма цветка), средним размером 48 нм. При этом распределение наночастиц золота по размеру не является однородным. Для композита наночастиц золота в 0,05% растворе хитозана индекс полидисперсности (ИПД) равен 0,420 при рН раствора равном 5,5. Размер частиц составляет 298,4 нм, что свидетельствует о наличии достаточно объемной хитозановой «шубы». Для композита наночастиц золота в 0,4% растворе хитозана индекс полидисперсности (ИПД) равен 0,165 при рН раствора равном 5,5. При этом размер частиц составляет 370,3 нм, что также говорит о наличии хитозановой оболочки. Для образца, содержащего 2,5% хитозана характерен средний размер 157,3нм, при ИПД=0,422. Можно сделать вывод, что при низкой концентрации хитозана первоначально образовывалось меньше наночастиц из-за ограниченного количества молекул хитозана. Следовательно, эти наночастицы не были полностью защищены, как следствие, продолжился их рост, который привел к образованию более крупных наночастиц. Все полученные растворы наночастиц были изучены методом УФ – видимой спектроскопии поглощения растворов: Максимум полосы поглощения раствора наночастиц золота наблюдается при 572 нм для образца, содержащего 0,4% хитозана и 635 нм для образца, содержащего 0,05%. Батохромный сдвиг объясняется влиянием восстановителя. Как хитозан, так и аскорбиновая кислота могут выступать в качестве восстановителя в реакции с HAuCl4. Как единственному восстановителю, хитозану, необходимо несколько суток для того чтобы образовались наночастицы золота с пиком около 530 нм, что является типичным пиком поглощения для наночатиц золота. При добавлении в смесь аскорбиновой кислоты в течение нескольких секунд наблюдается быстрое изменение цвета, что указывает на главную роль аскорбиновой кислоты как восстановителя. В восстановленных образцах золота наблюдается заметный красный сдвиг максимального пика поглощения с 530 нм до 635 нм, что можно объяснить осаждением частиц при их значительной агрегации в растворе. Как видно из диаграммы наиболее отчетливо пики наночастиц золота наблюдаются в 0,4% растворе хитозана. ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПОЗИТА НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА, ХИТОЗАНА И ДОКСОРУБИЦИНА: При загрузке доксорубицина было учтено влияние рН раствора, поэтому были проанализированы образцы с рН=3,0 и рН=5,5. При загрузке DOX наблюдается разрушение объемной оболочки из хитозана. Также нужно отметить, что варьируя рН раствора можно регулировать размер образующегося композита. Хорошо известно, что электростатический двойной слой наночастиц золота создает зарядовый баланс и, следовательно, защищает композит от самоагрегации. При изменении рН раствора этот слой разрушается, что в конечном итоге приводит к агрегации композита до определенного размера, который в свою очередь имеет более высокий дзета-потенциал, что способствует большей стабильности молекул композита. УФ – спектроскопия показала, что доксорубицин был загружен не во все исследуемые образцы. Доксорубицин имеет характеристические полосы поглощения при 254 и 480 нм, данным характеристикам соответствует композит, содержащий 0,4% хитозана при различных рН, но второй характеристический пик смещен в красную область, что может быть результатом наложения пика наночастиц золота, который приходится на длину волны 530 нм (который был также более ярко выражен у образца наночастиц золота в 0,4% растворе хитозана), также заданным характеристикам отвечает образец, содержащий 0,05% хитозана, причем при рН=5,5 пик при 480 нм более выражен. ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПОЗИТА НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА И ЖЕЛАТИНА: По данным ПЭМ образуются наночастицы золота средним размером 14,06 нм. Данные наночастицы характеризуются несферической формой, а именно, отмечается наличие четких граней, вероятно наночастицы имеют форму многогранника. Молекулы композита наночастиц золота в 0,5% растворе желатина имеют средний размер, равный 367,8 нм, что подтверждает наличие оболочки из желатина. Индекс полидисперсности составил 0,347. Молекулы композита наночастиц золота в 4% растворе желатина имеют средний размер, равный 483,4 нм. Индекс полидисперсности составил 0,617. Измерение размеров молекул композита с большими концентрациями затруднительно, ввиду высокой вязкости растворов. Но можно однозначно сказать, что размеры молекул увеличиваются за счет образования оболочки из желатина, при увеличении содержания желатина в растворе. Результаты РФА совпали с дифракционными пиками (111), (200), (220), (311), которые подтвердили образование гранецентрированной кубической структуры у наночастиц. По данным УФ - спектроскопии максимум полосы поглощения раствора наночастиц золота наблюдается при 535 нм для образцов с содержанием желатина 2-6%, что является характерным для наночастиц золота. Для образца с содержанием желатина 8% характеристического пика не наблюдается. ХАРАКТЕРИСТИКА КОМПОЗИТА НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА, ЖЕЛАТИНА И ДОКСОРУБИЦИНА: УФ - спектроскопия показала, что успешная загрузка доксорубицина была осуществлена только в композит, содержащий 0,05% желатина. На диаграмме образца с успешно проведенной загрузкой видны пики доксорубицина (280 нм и 480 нм), что отвечает общепринятым показателям (254 нм и 480 нм). Предположительно, в образцах, с большим содержанием желатина DOX не смог встроится в композит из-за слишком плотной оболочки желатина. Образец, содержащий DOX-загруженный композит наночастиц золота в 2% растворе альгината натрия и 2% желатина (20/80), также не демонстрирует выраженных характеристических пиков доксорубицина. Для дальнейшего исследования был выбран образец, содержащий доксорубицин: Из спектров комбинационного рассеяния видно, что для композита характерно незначительное усиление сигнала лекарственного препарата. Это объясняется тем, что длина лазерного излучения, используемого при получении спектра (532 нм), практически идентична полосе плазмонного поглощения золотых наночастиц. ВЫВОДЫ: 1. В ходе выполнения настоящего исследования была разработана простая химическая методика получения липосом с наночастицами благородных металлов. 2. В работе показано, что липосомы, содержащие наночастицы благородных металлов являются наиболее перспективными материалами для использования в качестве контейнеров для транспортировки и контролируемого выделения лекарственных препаратов. 3. Был получен композит наночастиц золота и хитозана. 4. Был получен композит наночастиц золота и желатина. 5. Был получен композит наночастиц золота, альгината натрия и желатина. 6. Методами оптической спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния в работе доказано вхождение доксорубицина в некоторые из полученных композитных материалов, содержащих наночастицы золота, что может иметь медицинское применение для диагностики заболеваний и адресной доставки лекарственных средств.

Прикрепленные к НИР результаты

Для прикрепления результата сначала выберете тип результата (статьи, книги, ...). После чего введите несколько символов в поле поиска прикрепляемого результата, затем выберете один из предложенных и нажмите кнопку "Добавить".